分子診斷在感染性疾病中的應(yīng)用(共61張課件)

分子診斷在感染性疾病中的應(yīng)用第1頁，共61頁。感染的慨念

感染是病原體在宿主的個體內(nèi)進行有害的復(fù)制、繁殖過程.

病原體:細菌、真菌、病毒、支原體、衣原體、螺旋體、寄生蟲……

條件致病菌微生物人體微生物人體不同的感染狀態(tài)共生狀態(tài)在正常情況下，人體的一些腔道和體表均有微生物寄生第2頁，共61頁。感染性疾病的分子診斷策略一般性策略（檢出病原體的DNA/RNA）：判斷有無感染是何種病原體感染常用方法：PCR＋分子探針雜交完整性策略檢出病原體分型（分類）－亞型－耐藥性常用方法：雜交、PCR、基因芯片、DNA測序第3頁，共61頁。分子生物學(xué)檢驗技術(shù)在感染性疾病中的應(yīng)用主要包括對病原生物進行鑒定、分型、耐藥診斷和治療過程中的療效監(jiān)測等動態(tài)、定量地檢測病原體核酸，能對療效判斷和病情預(yù)后評價提供客觀的依據(jù)目前已經(jīng)應(yīng)用于一些重要的感染性疾病，如結(jié)核病、病毒性肝炎、艾滋病、SARS、人禽流感等感染性疾病的分子診斷臨床價值第4頁，共61頁。一、感染性疾病的診斷和治療監(jiān)測

（一）結(jié)核分枝桿菌（二）肝炎病毒

（三）人類免疫缺陷病毒（五）SARS冠狀病毒（四）HPV病毒第5頁，共61頁。

感染方式呼吸道、消化道或皮膚損傷侵入機體所致疾病疾病種類多樣化以肺結(jié)核為主結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)第6頁，共61頁。生物學(xué)主要特點：1.結(jié)核分枝桿菌細胞壁中含有大量脂質(zhì)2.引起的疾病都呈慢性，并伴肉芽腫3.抗酸染色陽性結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)

第7頁，共61頁。實驗室診斷現(xiàn)狀第8頁，共61頁。分子生物學(xué)檢測方法近年來核酸擴增技術(shù)和雜交分析技術(shù)的發(fā)展，為分枝桿菌的檢測、鑒定和藥敏實驗提供了極大的方便，可將診斷時間從幾周降低到幾天。結(jié)核病基因診斷技術(shù)主要包括聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、核酸探針雜交、DNA序列測定、基因芯片、基因分型等。第9頁，共61頁。現(xiàn)代分子生物學(xué)快速診斷基因結(jié)構(gòu)分子診斷第10頁，共61頁。共價封閉環(huán)狀結(jié)構(gòu)標(biāo)準(zhǔn)株結(jié)核分枝桿菌基因組全長4.4kb,包含4000個蛋白質(zhì)編碼基因和50個RNA編碼基因

基因組特點第11頁，共61頁。MDR早期診斷分枝桿菌分子診斷系統(tǒng)

菌種鑒定篩查、鑒別診斷實時熒光PCR基因芯片快速檢測平臺第12頁，共61頁。高效：一個樣本可同時檢測結(jié)核分枝桿菌和NTM快速：4周（菌培）3小時靈敏：10個菌/反應(yīng)（TB）；102

個菌/反應(yīng)（NTM）13分枝桿菌核酸檢測功能：TB快速篩查；TB/NTM鑒別診斷第13頁，共61頁。高效：同時檢測17種分枝桿菌（包括TB）快速：＞4周（菌種鑒定）6小時靈敏：

103

個菌/反應(yīng)檢測范圍：結(jié)核、胞內(nèi)、鳥、戈登、堪薩斯、偶然、瘰疬、淺黃、土、龜-膿腫、草、不產(chǎn)色、海-潰瘍、金色、蘇爾加、蟾蜍、恥垢。14分枝桿菌菌種鑒定（DNA微陣列芯片法）

第14頁，共61頁。通量：兩個一線抗結(jié)核藥（MDR）速度：8周（藥敏）6小時靈敏度：103

個菌/反應(yīng)基于rpoB（利福平）和katG/inhA（異煙肼）的基因突變，對耐多藥結(jié)核病做出快速診斷。15結(jié)核分枝桿菌耐藥基因檢測試劑盒第15頁，共61頁。病毒性疾病的分子檢測第16頁，共61頁。乙型肝炎病毒（hepatitisBvirus,

HBV）全世界有3.5億慢性攜帶者，75%在亞太地區(qū)每年有一百萬人死于HBV感染，是全球范圍內(nèi)第9位死因中國：50%~70%的人受過感染，8%~10%是HBV攜帶者

世界其它地區(qū)亞太地區(qū)75%75%的長期慢性攜帶者來自亞太地區(qū)第17頁，共61頁。有許多因素影響著PCR方法，如標(biāo)本處理及儲存形式，引物設(shè)計、擴增倍數(shù)、反應(yīng)條件、DNA產(chǎn)物的污染、擴增后產(chǎn)物檢測系統(tǒng)等率為100%。(3)用型特異的引物對HCV核心基因巢式PCR。HCV基因型的篩選試驗有：pre-CHBeAg人類免疫缺陷病毒

（HIV）現(xiàn)代分子生物學(xué)快速診斷SARS冠狀病毒（SARSCoV）是一種新的變種的冠狀病毒急性感染時期HBV的標(biāo)志物應(yīng)采取必要的質(zhì)控規(guī)程，包括陽性對照和陰性對照。靶細胞：CD4+T細胞HCV分為6個主要基因型（Simmonds），HCV亞型已超過50個.其正鏈RNA分子大小為不同型的HPV侵犯的部位和所致疾病也不同LIPA方法tuberculosis)HBV的形態(tài)特征

DNA病毒雙鏈（非環(huán)狀）

DNA不等長正鏈（2/3）負鏈

最常見的血清型為adw、adr和ayw

亞型的地區(qū)分布不同，我國以adr為主，adw次之，而ayw見于新疆、西藏和內(nèi)蒙古等地

第18頁，共61頁。HBV基因組結(jié)構(gòu)

pre-S1pre-S1蛋白

pre-S2pre-S2蛋白

SHBsAgpre-CHBeAgCHBcAgPDNAPXHBxAg編碼HBsAgpre-S2pre-S1S區(qū)C區(qū)P區(qū)X區(qū)基因重疊第19頁，共61頁。急性感染時期HBV的標(biāo)志物HBV檢測窗口期血清學(xué)（HBsAg）：56天PCR：33天縮短23天（平均6-15天）第20頁，共61頁。HBV分子診斷方法擴增位置引物序列擴增片段大小(bp)P、X基因特異片段5’-ATACTGCGGAACTCCTAGC-3’2785’-CCGCGTAAAGAGAGGTGCG-3’Ｃ基因特異片段5’-ATACCACAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACT-3’4775’-AAGCCCTACGAACCACTGAACAAATGGCAC-3’Ｃ基因特異片段5’-GCTTTGGGGCATGGACATTGACCCCTATAA-3’2585’-ATGGGATCCCTGGATGCTGGGTCTTCCAAA-3’HBV-DNA檢測（PCR）PCR引物是PCR擴增的關(guān)鍵，決定擴增的特異性和敏感度。PCR引物常根據(jù)其S、C、P和X基因中的高度保守序列來設(shè)計。部分常用的引物序列第21頁，共61頁。1．樣本處理（樣本處理區(qū)）2．核酸擴增2.1試劑配置（PCR前準(zhǔn)備區(qū)）2.2加樣（樣本處理區(qū)）2.3PCR擴增（檢測區(qū)）HBVDNAFQ-PCR（realtimePCR）試劑制備標(biāo)本處理擴增檢測xxx第22頁，共61頁。HBVDNAFQ-PCR（real-timePCR）結(jié)果判斷：FQ-PCR進行HBVDNA的定量檢測，檢測范圍為2.5×102~2.5×109copies/ml

檢測樣本中5×102copies/ml≤HBVDNA≤5×107copies/ml，測定結(jié)果有效，可直接報告相應(yīng)的拷貝數(shù)檢測樣本中HBVDNA>5×107copies/ml，既可直接報告為>5×107copies/ml，也可用正常人血清按10倍剃度做相應(yīng)稀釋，使其拷貝數(shù)落在1×105-5×107copies/ml范圍內(nèi)，再重新測定，測定結(jié)果應(yīng)以稀釋倍數(shù)進行校正檢測樣本HBVDNA<5×102copies/ml時，拷貝數(shù)僅供參考，報告為小于最低檢出限Ct值無數(shù)值時,報告為0.0copies/ml第23頁，共61頁。支鏈DNA（bDNA）技術(shù)

一種核酸探針雜交標(biāo)志信號放大技術(shù)。優(yōu)點：穩(wěn)定性和重復(fù)性較好，結(jié)果準(zhǔn)確，操作簡單，將待測病毒裂解釋放核酸后變性為單鏈，即可進行檢測。缺點：敏感性較低、檢測范圍窄而不適用于低水平病毒的檢測。第24頁，共61頁。還可以用于乙肝病毒基因檢查的方法主要有：熒光PCR法、競爭PCR法、PCR酶聯(lián)免疫吸附法、熒光標(biāo)記物法和PCR酶聯(lián)化學(xué)發(fā)光等方法。

第25頁，共61頁。變異株與耐藥突變檢測

HBV可能發(fā)生自然變異HBV在人體活疫苗接種和抗病毒治療等壓力下發(fā)生變異HBV基因組的變異常引起病毒生物學(xué)特性的改變，從而導(dǎo)致HBV感染發(fā)病機制的變化、血清學(xué)檢測指標(biāo)的改變以及免疫逃逸，給乙型肝炎的診斷和治療帶來困難一、感染性疾病的診斷和治療監(jiān)測

第26頁，共61頁。HBV耐藥突變類型及其核苷酸、氨基酸變化第27頁，共61頁。第28頁，共61頁。第29頁，共61頁。第30頁，共61頁。第31頁，共61頁。46.91℃54.64℃50.74℃第32頁，共61頁。丙型肝炎病毒（HCV）急性丙肝的臨床診斷1.流行病學(xué)史：有輸血史、應(yīng)用血液制品史或明確的HCV暴露史。2.臨床表現(xiàn)：全身乏力、食欲減退、惡心和肝區(qū)疼痛等，其他可有低熱，輕度肝腫大，脾腫大，黃疸。部分患者無明顯癥狀。3.實驗室檢查：ALT多呈輕度和中度升高，抗-HCV和HCVRNA陽性。約90%的輸血后非甲非乙型肝炎和70

80%的無輸血史的散發(fā)型非甲非乙型肝炎由HCV感染所致第33頁，共61頁。HCV-RNA定性試驗引起的疾病都呈慢性，并伴肉芽腫HBV耐藥突變類型及其核苷酸、氨基酸變化檢測基因型方法一般分為二類：高效：同時檢測17種分枝桿菌（包括TB）5’-AAGCCCTACGAACCACTGAACAAATGGCAC-3’人類免疫缺陷病毒

（HIV）傳播途徑：主要通過接觸感染靈敏：10個菌/反應(yīng)（TB）；包含4000個蛋白質(zhì)編碼基因中國：50%~70%的人受過感染，8%~10%是HBV攜帶者Step5:Translation檢測樣本中HBVDNA>5×107copies/ml，既可直接報告為>5×107copies/ml，也可用正常人血清按10倍剃度做相應(yīng)稀釋，使其拷貝數(shù)落在1×105-5×107copies/ml范圍內(nèi)，再重新測定，測定結(jié)果應(yīng)以稀釋倍數(shù)進行校正速度：8周（藥敏）6小時基因組為RNA雙分子，與其它逆轉(zhuǎn)錄病毒基本相同HCV血中HCV含量僅為HBV的千分之一HCV的細胞培養(yǎng)尚未成功，病毒的分離極為困難HCV的變異性很高，使其診斷十分困難HCV的免疫學(xué)標(biāo)志僅有抗HCV一項，且由感染至抗體產(chǎn)生大約需要70天，部分病人感染后始終都不形成抗體HCV分子診斷技術(shù)尤為重要第34頁，共61頁。HCV基因組（單鏈RNA）呈球形顆粒直徑約50nm有一脂質(zhì)包膜核心：單股正鏈RNA，全長9.4kb僅一個開放讀框（ORF），編碼一條含有3008

3037個氨基酸的病毒前體多肽第35頁，共61頁。pre-S2pre-S2蛋白有11個ORF，編碼：依賴于RNA的RNA聚合酶（rep）、4種結(jié)構(gòu)蛋白（S,E,M,N）、5種未知蛋白基于rpoB（利福平）和katG/inhA（異煙肼）的基因突變，對耐多藥結(jié)核病做出快速診斷。ACD/EDTA/HEP現(xiàn)代分子生物學(xué)快速診斷nef（negativeregulatorfactor）痰液、咽拭子、鼻拭子、支氣管肺泡灌洗液、速度：8周（藥敏）6小時分型（分類）－亞型－耐藥性tat（trans-actingtranscriptionalgene）5’-ATACTGCGGAACTCCTAGC-3’-靶擴增技術(shù)如定量PCR方法近年來核酸擴增技術(shù)和雜交分析技術(shù)的發(fā)展，為分枝桿菌的檢測、鑒定和藥敏實驗提供了極大的方便，可將診斷時間從幾周降低到幾天。（三）人類免疫缺陷病毒HBV可能發(fā)生自然變異或者擴增另一個基因片段HCV基因分型的多樣性由于HCV的RNA聚合酶的忠實性不高，所以引起HCV的基因型呈多樣性HCV分為6個主要基因型（Simmonds），HCV亞型已超過50個.HCVRNA基因分型有助于判定治療的難易程度及制定抗病毒治療的個體化方案.第36頁，共61頁。HCV分子診斷HCV-RNA定性試驗?zāi)孓D(zhuǎn)錄PCR有許多因素影響著PCR方法，如標(biāo)本處理及儲存形式，引物設(shè)計、擴增倍數(shù)、反應(yīng)條件、DNA產(chǎn)物的污染、擴增后產(chǎn)物檢測系統(tǒng)等嚴(yán)格的質(zhì)控、操作人員的熟練程度尤為重要HCVRNA定性檢測的特異度在98%以上，只要一次病毒定性檢測為陽性即可確證HCV感染一次檢測陰性不能完全排除HCV感染，應(yīng)重復(fù)檢查第37頁，共61頁。HCV-RNA定量試驗

估價血清中HCV-RNA水平反映感染機體的病毒復(fù)制率及清除率在未治療的慢性丙肝機體內(nèi)病毒負荷相對穩(wěn)定目前有二種方法可定量HCV-RNA水平

-靶擴增技術(shù)如定量PCR方法

-信號擴增技術(shù)如支鏈DNA法

第38頁，共61頁。HCVRNA定量（real-timeRT-PCR）質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)陰性對照的檢測結(jié)果為陰性強陽性對照的Ct值應(yīng)小于等于30.0臨界陽性對照的Ct值應(yīng)大于強陽性對照的Ct值否則此次實驗視為無效結(jié)果判斷Ct值無數(shù)值的樣本為陰性樣本Ct值≤36.0的樣本為陽性Ct值大于36.0的樣本建議重做，重做結(jié)果無數(shù)值者為陰性，否則為陽性第39頁，共61頁。HCVRNA定量結(jié)果表示方法HCVRNA定量檢測法有兩種表示方法：拷貝/ml（羅氏公司CobasV2.0）IU/ml（美國國立遺傳學(xué)研究所的SuperQuant）兩者之間可以進行換算，IU/ml與拷貝數(shù)/ml換算公式是：IU/ml=0.854

拷貝數(shù)/ml+0.538第40頁，共61頁。特別說明應(yīng)注意HCVRNA檢測中的假陽性和假陰性在HCV急性感染期，在血漿或血清中的病毒基因組水平可達到105～107拷貝/ml在慢性感染者中，HCVRNA水平變化范圍在5×104～5×106拷貝/ml之間，同一患者血液中HCVRNA的水平相對穩(wěn)定HCV病毒載量的高低與疾病的嚴(yán)重程度和疾病的進展并無絕對相關(guān)性，但可以作為抗病毒治療療效評估的觀察指標(biāo)（“評估”和“預(yù)測”）

第41頁，共61頁。HCV基因型測定

檢測基因型方法一般分為二類：

⑴檢測HCV基因的點突變的篩選試驗⑵評估HCV基因更大片段的驗證性試驗

HCV基因型的篩選試驗有：

(1)對HCV高度保守的5’-NC區(qū)域行限制性片段長度多型性分析（RFLP）

(2)對HCV-5’NC區(qū)域行逆轉(zhuǎn)錄斑點雜交分析，又名

LIPA方法

(3)用型特異的引物對HCV核心基因巢式PCR。

(4)病毒蛋白抗原性分型評估HCV基因更大片段的驗證性試驗-----序列分析第42頁，共61頁。人類免疫缺陷病毒

（HIV

）第43頁，共61頁。全國累計報告HIV感染者地理分布1-100101-500501-10001001-50005001-10000>10000HIV感染者數(shù)截至2005年12月底第44頁，共61頁。HIV在宿主細胞中的復(fù)制Step1:BindingStep2:ReverseTranscriptionStep3:IntegrationStep4:ReplicationStep5:TranslationStep6:ViralAssembly靶細胞：CD4+T細胞第45頁，共61頁。HIV基因組基因組為RNA雙分子，與其它逆轉(zhuǎn)錄病毒基本相同其正鏈RNA分子大小為

HIV-19.3kb有3組共8個基因

HIV-29.7kb有3組共9個基因5’端有帽子結(jié)構(gòu)，3’端有poly(A)結(jié)構(gòu)

第46頁，共61頁。HIV基因組第一組：逆轉(zhuǎn)錄病毒共同的結(jié)構(gòu)基因和側(cè)翼末端重復(fù)順序

gag（groupofantigen)基因：編碼核心蛋白

pol（polymerase）基因：編碼逆轉(zhuǎn)錄酶，DNA聚合酶

env（envelop）基因：編碼包膜蛋白LTRs：不編碼任何蛋白，可起始其它病毒基因的表達，無種屬特異性第二組：參與基因表達的調(diào)節(jié)基因

tat（trans-actingtranscriptionalgene）

rev（regulatorofexpressionofviralprotein）

nef（negativeregulatorfactor）第三組：負調(diào)控病毒的感染性，成熟或釋放的基因

vif（viralinfectivityfactor）

vpu（viralproteinU）

vpr（viralproteinR）第47頁，共61頁。HIV基因組遺傳變異率高高度變異區(qū)在env基因內(nèi)，相當(dāng)于gp120的五個區(qū)段HIV疫苗研發(fā)難度大第48頁，共61頁。HIV-1感染后病毒標(biāo)志物的變化窗口期：檢測抗體2-12周檢測p24抗原2-3周檢測RNA11天第49頁，共61頁。HCV分為6個主要基因型（Simmonds），HCV亞型已超過50個.HCV基因分型的多樣性應(yīng)采取必要的質(zhì)控規(guī)程，包括陽性對照和陰性對照。變異株與耐藥突變檢測⑴檢測HCV基因的點突變的篩選試驗人類免疫缺陷病毒

（HIV）優(yōu)點：穩(wěn)定性和重復(fù)性較好，結(jié)果準(zhǔn)確，操作簡單，HPV16型和18型是導(dǎo)致我國婦女患子宮頸癌的最主要原因Step2:ReverseTranscription結(jié)核分枝桿菌細胞壁中含有大量脂質(zhì)不同型的HPV侵犯的部位和所致疾病也不同低危型：主要包括HPV6和HPV11HIV病毒載量（HIVRNA定量）主要有三種技術(shù)：RT-PCR（最低檢測限為50copies/ml）bDNA（最低檢測限為50copies/ml）NASBA（最低檢測限為20copies/ml）NASBA（nucleicacidsequence-basedamplification）基于核酸等溫擴增技術(shù)

方法檢測范圍實驗內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)差（lg）抗凝劑RT-PCR4

102-5

0.15

0.33ACD/EDTAbDNA4

102-50.08

0.33EDTANASBA4

102-50.13

0.33ACD/EDTA/HEP第50頁，共61頁。病毒基因組是雙鏈DNA.具有宿主和組織特異性：人是HPV惟一自然宿主傳播途徑：主要通過接觸感染經(jīng)性接觸傳播新生兒可經(jīng)產(chǎn)道感染不同型的HPV侵犯的部位和所致疾病也不同HPV的免疫防御機制尚不十分清楚HPV的致癌潛力分為高危型：主要包括HPV16、18、31、33、45、35、39、51、52和58等（其中HPV16和HPV18與子宮頸癌發(fā)生密切相關(guān)）低危型：主要包括HPV6和HPV11人乳頭狀瘤病毒（HPV）第51頁，共61頁。《中國婦女人乳頭狀瘤病毒（HPV）感染和宮頸癌流行病學(xué)調(diào)查》大規(guī)模的人群專項調(diào)查發(fā)現(xiàn)：我國城鄉(xiāng)婦女高危型HPV感染率均較高，并在20~24歲和40~44歲兩個年齡段呈現(xiàn)感染高峰；以醫(yī)院為基礎(chǔ)、覆蓋7個地區(qū)的調(diào)查顯示：我國婦女83%的子宮頸浸潤癌、84%的子宮頸鱗癌均有HPV16型或18型引起；HPV16型和18型是導(dǎo)致我國婦女患子宮頸癌的最主要原因HPV第52頁，共61頁。HPV檢測實驗室診斷分子生物學(xué)方法檢測HPVDNA在診斷同時確定型別：如斑點雜交、原位雜交，DNA印跡法（此法為最可靠的方法）以HPV基因型特異性引物進行PCR擴增，再用特異性探針雜交法檢測擴增產(chǎn)物（此法特異、敏感、被廣泛采用）免疫印跡（Westernblot）檢測病人血清中基因型特異性抗體第53頁，共61頁。SARS相關(guān)冠狀病毒2003年4月，香港研究者Peiris等報告了50例嚴(yán)重型急性呼吸道綜合征(seriousacuterespiratorysyndrome,SARS)病人的臨床表現(xiàn)和病毒學(xué)研究結(jié)果。一種新的冠狀病毒(Coronavirus)是SARS的致病原因。

(Lancet,2003,361:9365)第54頁，共61頁。SARS冠狀病毒（SARScoronavirus）