檸檬苦素對牛卵母細胞氧化應激水平的影響

摘要近年來，隨著胚胎工程技術的深入研究和全面的商業(yè)化推廣以及養(yǎng)牛行業(yè)的蓬勃發(fā)展，人們對于牛胚胎需求越來越大。解決這一問題的方法之一便是牛卵母細胞體外成熟。氧化應激是影響牛卵母細胞體外成熟的重要因素。為緩解氧化應激造成的不良影響，通常在培養(yǎng)基中添加抗氧化劑或自由基清除劑來維持卵母細胞的氧化還原平衡。本試驗旨在探究在牛卵母細胞體外發(fā)育過程中添加檸檬苦素對牛卵母細胞氧化應激水平的影響。通過對分裂率，谷胱甘肽（GSH）水平，活性氧（ROS）水平，以及四種抗氧化相關基因（SOD1、SOD3、SIRT1、SIRT3）的表達量進行分析。結果顯示，對照組卵裂率顯著低于Lim處理組（P<0.05）；對照組ROS水平顯著高于Lim處理組（P<0.05）；對照組GSH水平顯著低于Lim處理組（P<0.05）；相比于對照組檸檬苦素可以顯著提高SOD1、SOD3、SIRT1和SIRT3的表達水平（P<0.05）。綜上，Lim能夠有效地降低氧化應激損傷，提高牛卵母細胞體外發(fā)育能力。關鍵詞：檸檬苦素；牛；卵母細胞；體外成熟；氧化應激目錄摘要 [7]。研究表明，檸檬苦素等高度氧化的三萜類化合物的結構中羥基較少，因此具有氧化活性[13]YuJ，WangL，WalzemＲlmillerEG，etal．Antioxidantactivityofcitruslimonoids，flavonoids，andcoumarins［J］．JAgricFoodChem，2005，53(6):2009-2014.13]。檸檬苦素的抗氧化能力在腦組織中也可以表達，試驗表明檸檬苦對自然衰老大鼠的學習記憶能力有一定的改善能力[14]李林子，胡文敏，唐靚，等.檸檬苦素對自然衰老大鼠抗氧化和學習記憶能力的影響［J］．中國食品衛(wèi)生雜志，2016，(01):22-27.14][9]孟鵬.金柑檸檬苦素類化合物的提取純化、結構鑒定及生物活性研究［D］．福州:福建農林大學，2013.[10]董文博,王雪瑩,楊洲.檸檬苦素的性質及其生理功能的研究進展[J].食品與發(fā)酵科技,2012,48(02):1-4.[11]TianQ，MillerEG，AhmadH，etal．Differentialinhibitionofhumancancercellproliferationbycitruslimonoids［J］．NutrCancer，2001，40(2):180-184.[12]QianP，JinHW，YangXW.NewlimonoidsfromCoptidisＲhizoma-EuodiaeFructuscouple［J］．JAsianNatProdＲes，2014，16(4):333-344.[13]YuJ，WangL，WalzemＲlmillerEG，etal．Antioxidantactivityofcitruslimonoids，flavonoids，andcoumarins［J］．JAgricFoodChem，2005，53(6):2009-2014.[14]李林子，胡文敏，唐靚，等.檸檬苦素對自然衰老大鼠抗氧化和學習記憶能力的影響［J］．中國食品衛(wèi)生雜志，2016，(01):22-27.[15]MokbelMS，HashinagaF.Evaluationoftheantioxidantactivityofextractsfrombuntan(CitrusgrandisOsbeck)fruittissues［J］．FoodChem，2006，94(4):529-534.1.3研究的目的和意義胚胎移植技術是人工授精技術后的又一次重大突破，對動物科學研究以及畜牧業(yè)都是具有重大意義的偉大提升。而胚胎移植的效果取決與卵母細胞體外成熟的質量。體外培養(yǎng)過程中，會有許多應激損傷損害卵母細胞，氧化應激是其中最大也是最常見的一種威脅。本研究中，在牛卵母細胞體外成熟培養(yǎng)體系中把檸檬苦素作為抗氧化劑添加，通過分析檸檬苦素影響氧化應激水平的效果，來探究添加檸檬苦素對牛卵母細胞體外成熟過程中的發(fā)育質量的影響，為卵母細胞體外培養(yǎng)體系的優(yōu)化，胚胎移植效率的提高提供理論依據和數據支持。第二章材料與方法2.1試驗藥品與儀器2.1.1試驗主要儀器儀器型號 公司超凈工作臺SW-CJ-2FDTELSTAR二氧化碳培養(yǎng)箱CO170S-230-0000ASTEC高溫滅菌鍋MJ-54ASTIK高速離心機D3024Thermo烘干箱BAO-80ASTIK熒光顯微鏡C-SHG1NIKON電熱恒溫水浴鍋XMTD203Thermo電子天平AS220.R2RADWAG實體顯微鏡SZ61NIKON渦旋混合器STD-09022TThermo﹣80℃冰箱ULTS1368Thermo磁力加熱攪拌器1522031ESCOPCR儀Mx3000/5PBIORAD2.1.2試驗藥品主要試驗藥品試劑中文名英文名或縮寫公司檸檬苦素LimoninSigma雙抗P-SSigma胎牛血清FBSGibco組織培養(yǎng)液TCM-199Sigma體外受精液IVF100Sigma表皮生長因子EGFSigma氯化鈉NaClSigma雌二醇E2Sigma丙酮酸鈉PySigma碳酸氫鈉NaHCO3Sigma氯化鈣CaCl2Sigma磷酸二氫鈉NaH2PO4Sigma卵泡刺激素FSHSigma半胱氨酸CySigma葡萄糖GlucoseSigma氯化鉀KClSigma六水氯化鎂MgCl2·6H2OSigma牛血清白蛋白BSASigma肝素HeparinSigma4-羥乙基哌嗪乙磺酸HEPESSigma慶大霉素GentamycinSigma非必需氨基酸MEMSigma谷氨酰胺L-glutamineSigma咖啡因CaffeineSigma必需氨基酸BMESigmaL（+）-乳酸L(+)-LactateSigma透明質酸酶HySigma礦物油MineralOilSigma

2.1.3藥品配制試驗所用藥品全程在超凈工作上使用去離子水完成配置，培養(yǎng)液PH值均在7.3-7.4之間，配制完成后使用0.22μm的過濾器過濾。1%BSA-PBS：取BSA0.4g，加入到40mlPBS溶液中，震蕩溶解后過濾。在4℃保存?zhèn)溆谩?%Hy酸酶濃縮液：取Hy0.2g，加入到20mlTCM-199中，震蕩溶解后過濾。在-20℃保存?zhèn)溆?。無菌生理鹽水：取NaCl9g，青霉素500μl，鏈霉素500μl，加入到1L蒸餾水中，震蕩溶解。常溫保存?zhèn)溆?。IVF100：分裝后4℃保存?zhèn)溆谩?早期胚胎培養(yǎng)液（IVC）成分見下表名稱英文縮寫濃度氯化鉀KCl0.2300mg/ml氯化鈉NaCl6.7000mg/ml牛血清白蛋白BSA4.0000mg/ml碳酸氫鈉NaHCO32.2000mg/ml慶大霉素Gentamycin0.0500mg/ml谷氨酰胺L-glutamine0.1500mg/ml必需氨基酸BME2%L（+）-乳酸L(+)-Lactate0.5500mg/ml非必需氨基酸MEM1%丙酮酸鈉Na-pyruate0.0400mg/ml牛卵母細胞體外成熟（IVM）培養(yǎng)液成分見下表名稱英文縮寫濃度培養(yǎng)液TCM-19950ml表皮生長因子EGF10ng/ml胎牛血清FBS10%雙抗P-S1%卵泡刺激素FSH0.04mg/ml丙酮酸鈉Py0.022g/ml雌二醇E21mg/ml精子激活液（BO）成分見下表名稱英文縮寫濃度氯化鈉NaCl6.6300mg/ml氯化鉀KCl0.2996mg/ml氯化鈣CaCl20.2506mg/ml葡萄糖Glucose2.5050mg/ml牛血清白蛋白BSA5.0000mg/ml4-羥乙基哌嗪乙磺酸HEPES2.9786mg/ml碳酸氫鈉NaHCO32.1000mg/ml磷酸二氫鈉NaH2PO40.1178mg/ml六水合氯化鎂MgCl2·6H2O0.1055mg/ml咖啡因Caffeine3.8840mg/ml丙酮酸鈉Na-pyruate0.1300mg/ml肝素Heparin0.0100mg/ml2.2卵母細胞的來源在屠宰場等待母牛宰殺后，迅速將卵巢取下，使用30-35℃的無菌生理鹽水進行沖洗。沖洗干凈后裝入保溫瓶中，浸泡在30-35攝氏度的無菌生理鹽水在1h內帶回實驗室。到達實驗室后先將手和卵巢消毒，將卵巢多余的肉在超凈工作臺上割除。在卵巢表面用吸水紙擦拭，然后使用裝有18號針頭的5毫升注射器抽取卵巢上表面直徑為2-8毫米的卵泡。離心管中加入抽取的卵泡液，室溫下沉淀10min后將上清液棄除，將3mlB-IVM培養(yǎng)液加入沉淀物中。在顯微鏡下挑選形態(tài)正常且卵丘細胞層致密的卵子。2.3卵母細胞的體外成熟培養(yǎng)在挑選完成后，隨機將卵子分為實驗組和對照組。實驗組培養(yǎng)滴中加入20μM檸檬苦素，未添加檸檬苦素的為對照組。將實驗組和對照組在無菌培養(yǎng)箱中用38℃，5%CO2的條件下培養(yǎng)24h。2.4卵母細胞體外受精在檸檬苦素組和對照組的IVM中分別加入200μL的0.5%透明質酸酶（Hy），輕輕吹打5次以達成去除部分卵丘細胞的目的，在體外受精液（IVF100）中將卵母細胞清洗5次后放入100μLIVF100中使用礦物油覆蓋；將精子從液氮內取出，在38℃水浴鍋中解凍5s。在BO中加入解凍的精子，25℃，1000rpm離心5min后將上清液棄除，加入BO再離心一次。將卵母細胞與離心后沉淀的精子放入IVF100中，在5%CO2，38.5℃二氧化碳培養(yǎng)箱共培養(yǎng)6h。 2.5卵母細胞的胚胎培養(yǎng)受精結束后，在1.5mL容量的離心管中注入1mL的0.1%透明質酸酶，其中放置揀出的卵母細胞。為去除全部卵丘細胞，使用1000μL槍吹打30次。在含有0.4%的BSA-CRI培養(yǎng)基中清洗受精卵5次后放入10μLBSA-CRI中并用礦物油覆蓋。放入38.5℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后檢查分裂率。2.6 卵母細胞ROS水平的檢測與試驗操作2.3-2.5相同，取得裸卵，用1%BSA-PBS清洗2-3次后，將裸卵放置在200μL濃度為10μmol/L細胞追蹤綠色熒光染料H2DCFDA中。隨后實驗避光操作，在37℃恒溫板上孵育染色，30min后清洗裸卵。在熒光顯微鏡下使用綠色熒光進行觀察并拍攝。2.7卵母細胞GSH水平的檢測與試驗操作2.3-2.5相同，取得裸卵，用1%BSA-PBS清洗2-3次后，將裸卵放置在200μL濃度為10μmol/L細胞追蹤藍色熒光染料CMF2HC中。隨后實驗避光操作，在37℃恒溫板上孵育染色，30min后清洗裸卵。在熒光顯微鏡下使用藍色熒光進行觀察并拍攝。 2.8實時熒光定量PCR與試驗操作2.3-2.5相同，取得裸卵，用1%BSA-PBS清洗2-3次后，在50μL裂解緩沖液中放入裸卵進行裂解。隨后在冰上開始嚴格無菌操作，根據說明書使用DynaBeadsmRNADirectKit（Cat#61012,DynalAsa,Oslo,Norway）試劑盒提取mRNA。接下來使用DynaBeadsmRNADirectKit（LifeTechnologies,Carlsbad,CA,USA）試劑盒將提好的mRNA逆轉錄38min獲得cDNA。再使用KAPASYBR?FAST試劑盒進行qRT-PCR，PCR反應采用20μl體系。qPCR反應使用CFXConnectOpticsModulePCR儀，預變性95℃3min，95°C3s，60°C30s，72°C20s，擴增目的基因為40個循環(huán)。使用內參為GAPDH，目的基因為SOD1、SOD3、SIRT1、SIRT3。PCR引物序列如表所示，RNA的定量數據使用2?ΔΔCt方法進行統計分析?；騁ene引物序列Primersequences(5'-3')SOD1F:ATCCACTTCGAGGCAAAGGGR:TGTCACATTGCCCAGGTCTCSOD3F:TTGCGATTTTATAGGGTCGTAR:AACGCCCGAACTAAAACGATSIRT1F:TGGCCAGCTAGACTTGCAAAR:AACTTGGACTCTGGCACGTTSIRT3F:CACAGTCTGCCAAAGACCCTR:AGAACACAATGTCGGGCTTCGAPDHF:GCACCACTGGCATTGTCATGR:CCATCTCCTGCTCGAAGTCC2.9數據統計分析熒光強度分析使用Image-J軟件。數據統計分析使用SPSS18.0軟件，試驗組與對照組使用獨立樣本T檢驗，形成表圖使用GraphPadPrism6.01軟件。肩標無字母或相同字母表示差異不顯著（P>0.05）；肩標不同字母表示差異顯著（P<0.05）。 第三章結果3.1檸檬苦素對牛卵母細胞體外成熟的影響為了探究檸檬苦素對牛胚胎發(fā)育的影響，在試驗組添加檸檬苦素20μM，普通培養(yǎng)基作為對照組。經過體外成熟，受精和培養(yǎng)，統計早期胚胎的分裂率。如圖3.1所示，經過檸檬苦素處理的實驗組分裂率顯著高于對照組（P<0.05）。說明檸檬苦素對胚胎發(fā)育有著促進作用。圖3.1檸檬苦素對牛卵母細胞發(fā)育的影響（A）24h卵母細胞分裂情況，標尺：200μm；（B）分裂率，R=3；不同字母表示統計學的顯著差異（P<0.05）Fig.3.1effectofLimoninonbovineoocytedevelopment(a)24hoocytedivision，Scalebar:200μm；(b)divisionrate,r=3;Differentlettersindicatestatisticallysignificantdifferences(P<0.05)3.2活性氧（ROS）熒光強度分析 為了探究檸檬苦素對牛卵母細胞內氧化應激的影響，將檸檬苦素添加到IVM培養(yǎng)液中培養(yǎng)24h后，檢測卵母細胞內ROS的水平。在ROS熒光強度分析中，顏色越明亮則ROS相對水平越高。由圖3.2可知，對照組ROS水平顯著高于Lim處理組（P<0.05）。由此可知檸檬苦素對早期胚胎培養(yǎng)過程中的活性氧（ROS）具有一定的清除能力。圖3.2檸檬苦素對牛卵母細胞ROS水平的影響。（A）ROS熒光染色圖片，標尺：200μm（B）ROS相對水平，R=3；不同字母表示統計學的顯著差異（P<0.05）Fig.3.2effectofLimoninonROSlevelofbovineoocytes.(A)ROSfluorescencestainingpictureScalebar:200μm；(b)relativelevelofROS,r=3;Differentlettersindicatestatisticallysignificantdifferences(P<0.05)3.3谷胱甘肽（GSH）熒光強度分析為了進一步探究檸檬苦素對牛卵母細胞內氧化應激的影響，將檸檬苦素添加到IVM培養(yǎng)液中培養(yǎng)24h后，檢測卵母細胞內GSH的水平。在GSH熒光分析中，顏色越明亮則GSH相對水平越高。由圖3.3可知，對照組GSH水平顯著低于Lim處理組（P<0.05）。由此可知檸檬苦素可以顯著提高早期胚胎發(fā)育過程中谷胱甘肽（GSH）的相對水平。圖3.3檸檬苦素對牛卵母細胞GSH水平的影響。（A）GSH熒光染色圖片，標尺：200μm（B）GSH相對水平，R=3；不同字母表示統計學的顯著差異（P<0.05）Fig.3.3effectofLimoninonGSHlevelofbovineoocytes.(A)GSHfluorescencestainingpicture，Scalebar:200μm(b)GSHrelativelevel,r=3;Differentlettersindicatestatisticallysignificantdifferences(P<0.05)3.4抗氧化相關基因mRNA表達量為了深入探究檸檬苦素對牛卵母細胞內氧化應激的影響，將檸檬苦素添加到IVM培養(yǎng)液中培養(yǎng)24h后，檢測了卵母細胞中抗氧化相關基因的表達水平:SOD1、SOD3、SIRT1和SIRT3。相比于對照組檸檬苦素可以顯著提高SOD1、SOD3、SIRT1和SIRT3的表達水平（P<0.05）。圖3.4檸檬苦素對牛卵母細胞抗氧化相關基因的影響。RT-PCR分析抗氧化相關基因SOD1、SOD3、SIRT2和SIRT3的mRNA水平，R=3；不同字母表示統計學的顯著差異（P<0.05）。Fig.2.2.6effectofLIMonantioxidantrelatedgenesinbovineoocytes.ThemRNAlevelsofantioxidantrelatedgenesSOD1,SOD3,sirt2andSIRT3wereanalyzedbyRT-PCR,r=3;Differentlettersindicatestatisticallysignificantdifferences(P<0.05).第四章討論檸檬苦素是在柑橘的皮和種子中含量豐富的一種氧化性四環(huán)三萜類有機物。經過大量試驗驗證，具有優(yōu)秀的抑菌效果和抗氧化能力。本試驗探討了在添加抗氧化劑檸檬苦素后對牛卵母細胞體外成熟和胚胎發(fā)育的影響。結果表明檸檬苦素能夠使ROS水平降低，使GSH水平和抗氧化相關基因的表達提高，以此降低氧化應激對牛卵母細胞和胚胎的不利影響。4.1檸檬苦素對分裂率的影響分裂率是評估卵母細胞質量的標準之一。也是評判對卵母細胞發(fā)育發(fā)育是否有影響最直接的指標。在本試驗中，添加檸檬苦素可以顯著增加早期胚胎的分裂率。說明檸檬苦素對卵母細胞的發(fā)育具有積極的促進作用。4.2檸檬苦素對氧化應激的作用比起體內成熟，卵母細胞的體外成熟效率顯著偏低，氧化應激是可能的一個原因[16]AgarwalA,

GuptaS,

SharmaRK.Roleofoxidativestressinfemalereproduction[J].ReproductiveBiology&Endocrinology,2005,3(1):1-21.。ROS對哺乳動物的卵母細胞以及胚胎的影響非常明顯，DNA在受到氧化應激造成的損傷后有可能會發(fā)生DNA斷裂、基因突變以及雙螺旋結構熱穩(wěn)定性的改變等影響，同時自由基還會對卵母細胞和胚胎的蛋白質分子中的氨基酸成分造成損害，而且蛋白質在經過氧化后，熱動力學穩(wěn)定性上也會變差，其中的部分三級結構會被打開，失去原有構像后蛋白質活性也會降低甚至失活[17]張申,衛(wèi)濤濤.生物大分子的氧化損傷與疾病[J].懷化醫(yī)專學報,2006,5(1):81-84.。因此，卵母細胞正常發(fā)育的前提是確保ROS和抗氧化水平之間的動態(tài)平衡。本試驗中觀察到添加檸檬苦素可以[16]AgarwalA,

GuptaS,

SharmaRK.Roleofoxidativestressinfemalereproduction[J].ReproductiveBiology&Endocrinology,2005,3(1):1-21.[17]張申,衛(wèi)濤濤.生物大分子的氧化損傷與疾病[J].懷化醫(yī)專學報,2006,5(1):81-84.谷胱甘肽（GSH）是一種由甘氨酸、半胱氨酸及谷氨酸組成的三肽[18]冮潔,單立峰.谷胱甘肽的制備及其應用[J].飼料工業(yè),2007(15):15-17.。GSH在細胞內在多種有氧氣參與的反應中均發(fā)揮重要作用，在氧自由基發(fā)生積累時，氧自由基會與GSH的巰基相結合，氧自由基在GSH的催化下會被還原為酸性物質，以此減少氧自由基的積累，使器官免受來自氧自由基的傷害[19]代濤,尹志峰,王良友.還原型谷胱甘肽臨床應用研究進展[J].承德醫(yī)學院學報,2014,31(05):432-435.DOI:10.15921/ki.cyxb.2014.05.084.。GSH的主要功能是及時將氧自由基催化，減少ROS的積累[20]MyhrstadM,

CarlsenH,ONordstr?m,etal.Flavonoidsincreasetheintracellularglutathionelevelbytransactivationofthegamma-glutamylcysteinesynthetasecatalyticalsubunitpromoter.[J].FreeRadicalBiology&Medicine,2002,32(5):386-393.。具有抗氧化特性的物質在卵母細胞體外培養(yǎng)過程中可增加細胞內GSH的產生來防止氧化應激造成的線粒體功能障礙和氧化損傷[21]Xiang-HongOu,,SenLi,Zhen-BoWang,MoLi,SongQuan,FuqiXing,LeiGuo,Shi-BinChao,ZijiangChen,Xing-WeiLiang,YiHou,HeideSchattenandQing-YuanSun,*.Maternalinsulinresistancecausesoxidativestressandmitochondrialdysfunctioninmouseoocytes[J].HumanReproduction,2012,27(7):p.2130-2145.。在本試驗中，檸檬苦素提高GSH的水平[18]冮潔,單立峰.谷胱甘肽的制備及其應用[J].飼料工業(yè),2007(15):15-17.[19]代濤,尹志峰,王良友.還原型谷胱甘肽臨床應用研究進展[J].承德醫(yī)學院學報,2014,31(05):432-435.DOI:10.15921/ki.cyxb.2014.05.084.[20]MyhrstadM,

CarlsenH,ONordstr?m,etal.Flavonoidsincreasetheintracellularglutathionelevelbytransactivationofthegamma-glutamylcysteinesynthetasecatalyticalsubunitpromoter.[J].FreeRadicalBiology&Medicine,2002,32(5):386-393.[21]Xiang-HongOu,,SenLi,Zhen-BoWang,MoLi,SongQuan,FuqiXing,LeiGuo,Shi-BinChao,ZijiangChen,Xing-WeiLiang,YiHou,HeideSchattenandQing-YuanSun,*.Maternalinsulinresistancecausesoxidativestressandmitochondrialdysfunctioninmouseoocytes[J].HumanReproduction,2012,27(7):p.2130-2145.超氧化物歧化酶（SOD）是一種可以有效減少細胞內氧自由基積累的抗氧化金屬酶[22]石慧.半滑舌鰨對納米鋅、納米銅需求量的研究[D].天津農學院,2016.。氧自由基會在SOD的催化發(fā)生歧化，生成過氧化氫和氧，因此它能抵抗氧毒性,增強機體抵抗輻射的能力,延緩衰老，在卵母細胞體外成熟培養(yǎng)中的氧化與抗氧化的平衡中有著非常關鍵的影響[23]楊衛(wèi)健,張雙全.超氧化物歧化酶的研究及應用前景[J].淮陰師范學院學報(自然科學版),2002(04):82-86.DOI:10.16119/ki.issn1671-6876.2002.04.021.。作為SOD基因家族的一員，SOD1是一種在細胞中分布廣泛的抗氧化酶[24]Yuewei,Sheng,Abreu,etal.SuperoxideDismutasesandSuperoxideReductases.[J].ChemicalReviews,2014.。SOD1可以結合ROS和氧氣直接在能量代謝中發(fā)揮作用[25]ReddiA,

CulottaV.SOD1IntegratesSignalsfromOxygenandGlucosetoRepressRespiration[J].Cell,2013,152(1-2):224-235.，作為核轉錄因子時可以對氧化應激進行調控[26]TsangCK,LiuY,ThomasJ,etal.Superoxidedismutase1actsasanucleartranscriptionfactortoregulateoxidativestressresistance.NatCommun.2014Mar19;5:3446.。細胞外過氧化物歧化酶的編碼基因是SOD3基因。SOD3作為SOD基因家族中的一員，和其他SOD基因相同，可以減少體內在代謝過程中所產生的活性氧（ROS）的積累，防止細胞被環(huán)境中超氧離子損傷。SOD3是SOD基因家族中唯一能在細胞外表達的基因，所以SOD3有著降低氧自由基對脈管系統造成損傷的重要作用[27]張寶,周玫,陳瑗.細胞外超氧化物歧化酶(EcSOD)[J].醫(yī)學綜述,2000(08):340-341.。Sirtuin蛋白是一組組蛋白去乙?；福梢詫芏嗟孜锏鞍踪|的表達、穩(wěn)定性與活性通過去乙?；饔眠M行調控[28]霍曉芳,張俊武.Sirtuin:依賴NAD~+的去乙?；竅J].生命的化學,2005(03):181-184.。Sirtuin家族基因與細胞老化，細