圓二色譜原理-

圓二色譜原理光學活性分子對左、右圓偏光得吸收率得差值1.自然光光具有波、粒二象性,就是橫電磁波。只有橫波才有偏振現(xiàn)象:光矢量得振動方向與光得傳播方向垂直,

在垂直于光傳播方向得平面內,有不同得振動方向。電場矢量E與磁場矢量H互相垂直、位相相同。v0HE由于感光作用都就是E引起得,因而,將E作為光矢量。振動面:E與光傳播方向組成得平面。E傳播方向振動面從統(tǒng)計規(guī)律上說,自然光得光振動:在垂直于光速得平面上遍布所有方向,沿各方向振動得光矢量呈對稱分布,相應光矢量得振幅(光強度)相等。(1)高亮度得點光源;

(2)日光色。色溫接近6000K;

(3)在可見光區(qū)連續(xù)光譜;

(4)高顯色性,顯色指數(shù)＞95;

(5)在整個壽命期內維持光色特性;

(6)高電弧穩(wěn)定性;

(7)熱重啟能力;

(8)啟動后即能達到接近最大光輸出;

(9)電弧光斑小、易聚光。超高壓短弧氙燈:在高壓純凈氙氣中放電發(fā)光。自然光平面偏振光圓偏振光樣品橢圓偏振光雙折射現(xiàn)象:一束光射入各向異性晶體后有兩束折射光。尼科耳棱鏡。2.光得偏振在生物樣品中,肌肉纖維、骨骼與牙齒等具有各向異性,淀粉粒、染色體與紡錘體等具有雙折射性,因此被用于組織細胞得化學研究。名稱折射定律折射率傳播方向尋常光(o光)遵守對于晶體一切方向都具有相同得折射率在入射面內非常光(e光)不遵守折射率隨方向而變化不一定在入射面內o光與e光:頻率相同、振動方向相互垂直、平面偏振光自然光入射到某些晶體(電氣石、硫酸金雞鈉堿晶體等)時,晶片吸收振動面與晶軸垂直得光,而只允許振動面平行于晶軸得光通過。大家學習辛苦了,還是要堅持繼續(xù)保持安靜自然光平面偏振光起偏器檢偏器晶軸相互平行時，透射光強度最大；晶軸相互垂直時，透射光強度為零；晶軸夾角為α時，透射光強度與cos2α成正比。.................也稱線(完全)偏振光,簡稱偏振光。它得振動面稱為其偏振面。振動方向保持不變振幅發(fā)生周期性變化E之端點在空間得軌跡為一平面正弦曲線投影到垂直于光傳播方向得平面上為一直線段3.平面偏振光(Planepolarizedlight)4.布儒斯特角當入射光射到兩種介質界面上時,反射光與折射光得偏振情況與入射光不同。5.四分之一波片使o光與e光得光程相差1/4波長得晶片。此時,相位差為π/2,透射得合成光就是長軸與晶軸重疊得正橢圓偏振光。朝光源瞧,電場矢量方向按順時針方向旋轉得,稱為右圓偏振光;電場矢量方向按逆時針方向旋轉得,稱為左圓偏振光。若入射平面偏振光得電矢量與晶體晶軸得夾角θ＝45°,則Eo=Ee,合成光就是圓偏振光(Circularpolarizedlight)。6.光得疊加一束自然光可以瞧作就是兩束相互垂直而沒有相位關系得平面偏振光得加與。旋轉方向相反得左、右圓偏光透過一光學活性物質后透過得左、右圓偏光振幅相位矢量與相等相同平面偏振光相等不同平面偏振光,方向改變不等相同橢圓偏振光不等不同橢圓偏振光,方向改變振幅相等、振動方向相互垂直、相位相差1/4波長得兩平面偏振光合成圓偏振光右旋7、旋光色散(Opticalrotatory

dispersion,ORD)旋光性:光學活性分子對左、右圓偏光得折射率不同,透射光雖然仍然為平面偏振光,但其偏振面旋轉了一定得角度。旋光物質又稱為光學活性物質。旋光度:偏振面旋轉得角度旋光色散:不同波長得偏振光得旋轉角度不同。旋光儀就是測量旋光性與波長得函數(shù)關系,從而得到一個旋光色散譜。圓雙折射:某個物質對于左、右圓偏光得折射率分別為nL與nR,

若

nL=nR,則為光學各向同性物質;若

nL≠nR,則為光學各向異性物質;左、右圓偏光得相位改變,若nL＞nR,透射光得偏振面右旋。若nL＜nR,透射光得偏振面左旋。旋光現(xiàn)象就是圓雙折射得一種特殊形式。旋光物質使左、右圓偏振光得速度不同,即其色散大小得折射率不同,旋光現(xiàn)象得產(chǎn)生就是由于光學各向異性物質得折射率nL≠nR得結果。旋光,雙折射化合物在正常情況下,處于低能得基態(tài),電子占據(jù)所有得成鍵軌道(σ、π、n軌道)。如果電子吸收了外界得能量,它就從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)能級。如果所有得躍遷僅在基態(tài)得最低振動能級與第一激發(fā)態(tài)之間,吸收光譜將就是很狹窄而不連續(xù)得譜線。由于分子得價電子躍遷總伴隨著振動與轉動能級得躍遷,所以,紫外分光光度計測定物質得吸收光譜,雖然有一最大吸收峰值,但都就是具有一定波長寬度并相對平滑得曲線。8、光得吸收與圓二色性(circulardichroism,CD)光得吸收若溶液中得溶質對某一波長得入射光有吸收,則透射光得光強度小于入射光。圓二色性得存在將通過該物質傳播得左、右圓偏光變成橢圓偏振光。并且只在發(fā)生吸收得波長處才能觀察到。理論計算得圓二色性與該橢圓偏振光得摩爾橢圓率得關系:[θ]=100θ/(c·l)=3300(εL-εR)ε:介質對圓偏振光得摩爾消光系數(shù),

c:樣品摩爾濃度,l:樣品厚度(cm),[θ]單位:℃/(mol·cm)或℃·

cm2/dmol。圓二色性得表示吸收(率)差

=L-R

A=AL–AR橢圓度,摩爾橢圓度[]

=2.303(AL–AR)/4

[]=3298(L-R)3300(L-R)

在蛋白質研究中,常用平均殘基摩爾橢圓度園二色＋雙折射9、ORD與CD光譜同時產(chǎn)生,包括同樣得分子結構信息:光學活性物質分子中得不對稱生色團。CD反映光與分子間能量得交換,旋光性則就是與分子中電子得運動有關?？梢杂蒏ronig-Krammers轉換方程相互轉換。CD譜得極值處與吸收峰一致(科頓效應,cottoneffect),因而分子中不同生色團對于譜得貢獻比在ORD中更容易分辨。ORD就是漸近線,兩端不回歸ORDCD吸收帶附近,旋光度由負到正正Cotton效應正CD帶吸收帶附近,旋光度由正到負負Cotton效應負CD帶CD比ORD容易辨別重疊峰CD比ORD弱帶易檢測CD比ORD更容易擬合CD比ORD提供較多意義明確得信息表明有三個生色團,其中兩個有光學活性CD能夠提供得信息:primarystructure,secondarystructuretertiarystructureAlpha-helix,beta-sheet肽鏈骨架得構象變化蛋白質得紫外吸收光譜主要有兩個峰:190-250nm:肽鍵280-290nm:酪氨酸t(yī)yr,色氨酸t(yī)rp10、J-810圓二色光譜儀S1-S2:第一級單色器;S2-S3:第二級單色器;M:球面反光鏡;P:晶體石英棱鏡;L:透鏡;F:濾光器;由CDM交互形成得左、右旋圓偏光通過光學活性物質,透射光強度隨時間得變化當調制電壓過其峰值(正與負)時,εR＞εL時,透過得右旋圓偏光得光強對應于最大值,而左旋最小(實線);εR＜εL時,透過得左旋圓偏光得光強對應于最大值,而右旋最小(虛線)。PMT得輸出信號由正比于IA得直流分量與正比于S得交流分量所組成。直流成分IA=（IL+IR）/2交流成分S相當于圓二色性透射光強的變化頻率與外加調制電壓的頻率相同。圓二色光譜儀工作原理用相同強度,相同頻率得左、右旋圓偏光交替照射樣品測得透過樣品后得強度IR與IL由于IR與IL十分接近,令IA=(IL+IR)/2,S=IR–IL只放大相應于S得PMT輸出電壓Es(交流信號),而不放大相應IA得輸出電壓EA。(適當選取放大倍數(shù)G值,使ESG與EA可比)。PeltierCellHolderCD/TotalFluorescenceFMOStoppedFlow-20～200℃Thepeptidebondisinherentlyasymmetricandisalwaysopticallyactive蛋白質得光學活性1.氨基酸得圓二色性可見光區(qū):各種氨基酸都沒有光吸收。紫外光區(qū):只有芳香族色氨酸、酪氨酸與苯丙氨酸有吸收。氨基酸分子內得紫外生色基團:吲哚基、酚羥基、苯基、二硫鍵、咪唑基與羧基等。2.肽得圓二色譜活性肽構象與其生理功能得關系肽得構象也就是蛋白質構象得一種模型。肽得圓二色性為研究肽在溶液中得構象提供了重要信息。Far-UV(250-170nm)SecondaryStructure:α-helix,β-sheet,β-turn,randomTertiaryStructureClass:all-α,α+β,α/β,all-βI,all-βIINear-UV(320-250nm):aromaticsidechainNear-UV~Near-infrared(300-1000nm):coloredproteins苯丙氨酸(phenylalanine,Phe):255.261與268nm附近;酪氨酸(tyrosine,Tyr):277nm左右;色氨酸(tryptophan,Trp):279、284與291nm附近;二硫鍵得變化反映在整個近紫外區(qū)。芳香氨基酸殘基及二硫鍵處于不對稱微環(huán)境時,在近紫外區(qū)表現(xiàn)出CD信號FarUVCDspectraofpoly-L-Lys1、100%α-螺旋2、100%β-折疊3、100%無規(guī)卷曲-band(nm)+band(nm)α-helix222208192β-sheet216195β-turn220-230(weak)180-190(strong)205polyproIIhelix190210-230weakRandomcoil200212MainCDfeaturesofprotein2ndarystructures3.估算蛋白質二級結構含量僅適合含量較高得蛋白質！將測得得CD曲線與標準曲線擬合。xa+xb+xc=1.0qt=xaqa+xbqb+xcqc改變xa、xb與xc,使qt與樣本曲線最佳擬合(最小二乘法,leastsquaresminimization)未知結構得蛋白得CD信號myoglobin

qt=xaqa+xbqb+xcqcfitsbestwith

xa=80%

xb=0% xc=20%

agreeswellwithstructure 78%helix,22%coilForfurtherdetails:GCN4-p1

0oC:100%helix 75oC:0%helixwhatabout50oC?qt=xoqo+x75q75fitsbestwith

xo=50%

x75=50%

Showsthatat50oC

1/2ofpeptidea-helixdimer

1/2ofpeptiderandomcoilmonomer

Lau,TanejaandHodges(1984)J、Biol、Chem、259:13253-13261螺旋二聚體分解為單螺旋三氟乙醇

(trifluoroethanol,TFE)誘導肽鏈形成螺旋TFE對卷曲螺旋(coiled-coil)得影響

——chymotrypsin(allb)——lysozyme(a+b)——triosephosphateisomerase(a/b)——myoglobin(alla)CDsignalofaproteindependsonits2ndarystructurepH變化引起得肌球素變性前后CD譜得動力學變化稀釋前后得熒光與CD譜從伸展到折疊α螺旋含量得變化得動力學檢測KineticTraceat222nm(secondarystructureregion)Unfoldingstate(random)Refoldingstate(α-Helix)Kinetictracesat289nm(Aromaticsidechainregion)細胞色素c伸展與折疊狀態(tài)得CD與熒光光譜反映了芳環(huán)側鏈(色氨酸殘基)得變化鹽酸胍中得細胞色素c(伸展狀態(tài))與PBS混合后得CD與熒光光譜6.磁圓二色譜

(MagneticCircularDichroism,MCD)磁性材料對左、右圓偏光得吸收不同而產(chǎn)生得二色性現(xiàn)象。利用法拉第效應,在外加磁場得作用下,許多原來沒有光學活性得物質也具有了光學活性,原來可測得CD譜得,在磁場中CD信號可增大幾個數(shù)量級。7000Gauss

實驗要點SampleconcentrationAgoodsuggestionistoruninadvanceanabsorptionUV-VISspectra、CDspectroscopycallsforsamerequirementsasUV-VIS:bestS/Nisobtainedwithabsorbancelevelintherange0、6to1、2、It’susuallydifficulttogetproperdatawhenabsorbance(ofsample+solvent)isover2O、D.樣品杯:高度均勻得熔融石英,不會帶來附加得圓二色性。光程:0、01cm-1cm,為了降低溶劑影響,一般提高樣品濃度,用短光程。cellpathlengthNitrogenflushingFlushingtheopticswithdrynitrogenisamust:Xelamphasaquartzenvelope,soifoperatedinairit’lldevelopalotofozone,harmfulforthemirrorsbelow195nmoxygenwillabsorbradiationHTplotTheHTplotisveryimportant,sincereadingsabove600-650Vmeanthatnotenoughlightisreachingthedetectorsoasampledilutionortheuseofshorterpathcellarerequired、theHTplotisinrealtyasinglebeamspectraofoursample,sincethereisadirectrelationbetweenHTandsampleabsorbance、BydatamanipulationHTconversionintoabsorbanceandbufferbaselinesubtractionispossible、AlternativelysinglebeamabsorbancescalecanbeusedalreadyinCH2duringdatacollection,loosinghoweverabitthealertingfunctionsofthischannel、Bandwidth(SBW)selectionSettingofslitsshouldbeaslargeaspossible(todecreasenoiselevel),butpatibletothenaturalbandwidth(NBW)ofthebandstobescanned、AsaruleSBWshouldbekeptatleast1/10oftheNBW,otherwisethebandwillbedistorted、IfNBWisnotknownaseriesoffastsurveyspectraatdifferentSBWwillhelpproperselection、Tradeinofaccuracyversussensitivity(i、e、theuseoflargerthantheoreticalSBW)isoccasionallyrequired、2nminthefarUVregion1nminthearomaticregion(wherefinestructuresmaybepresent),optimalband-pass(aslargeaspossible,butnotloosinginformation)canbedeterminedafteratrial標準操作時譜帶寬度選為1nm;高分辨率測量用較窄得狹縫寬度,此時PMT電壓較高,信噪比差;當樣品得光密度很高、CD很小時,就要保持測試CD峰多需要得足夠濃度,并用較寬得狹縫寬度。此時,由于樣品OD值過高,可能存在有熒光或雜散光引起得某些假象。Numberofdatapointdatapitch,i、e、numberofdatapointspernm,willnotdirectlyinfluencethenoiselevel、Howeverifpostrunfurtherdataprocessingwillbeappliedtoreducethenoise,it’sadvisabletocollectasmanydatapointsaspossibletoincreasetheefficiencyofthepostrunfilteringalgorithmAccumulationanotherwaytoimproveS/Nistoaveragemorespectra、HeretootheS/Nwillimprovewiththesquarerootofthenumberofaccumulations、Averagingisveryeffectivesinceitpensatesshorttermrandomnoise,butit’llnotpensatelongtermdrifts(mainlyofthermalorigin)、Soiflongaccumulationsareusedweremendasuitablelongwarm-upofthesystemand/ortheuseofasamplealternator(tocollectsequentiallysampleandblankandaveragetheirsubtractedvalues)、Forlongovernightaccumulationsit’s