化學(xué)品 皮膚致敏試驗(yàn)方法 征求意見稿

GB/T21608-xxxx化學(xué)品皮膚致敏試驗(yàn)方法本文件規(guī)定了動(dòng)物皮膚致敏試驗(yàn)的試驗(yàn)?zāi)康?、術(shù)語(yǔ)定義和縮略語(yǔ)、試驗(yàn)基本原則、試驗(yàn)方法、試驗(yàn)報(bào)告和結(jié)果解釋。本文件適用于檢測(cè)化學(xué)品對(duì)皮膚的變態(tài)反應(yīng)性。2規(guī)范性引用文件本文件沒有規(guī)范性引用文件。3術(shù)語(yǔ)、定義和縮略語(yǔ)下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1皮膚致敏反應(yīng)/過(guò)敏性接觸性皮炎skinsensitization/allergiccontactdermatitis皮膚對(duì)一種物質(zhì)產(chǎn)生的免疫源性皮膚反應(yīng)。對(duì)于人類這種反應(yīng)可能以瘙癢、紅斑、水腫、丘疹、小水皰，融合水皰為特征。動(dòng)物的反應(yīng)不同，可能只見到皮膚紅斑和水腫。3.2誘導(dǎo)接觸inductionexposure機(jī)體通過(guò)接觸受試樣品以達(dá)到誘導(dǎo)產(chǎn)生致敏狀態(tài)目的的試驗(yàn)性暴露。3.3誘導(dǎo)期inductionperiod機(jī)體通過(guò)接觸受試樣品而誘導(dǎo)出過(guò)敏狀態(tài)所需的時(shí)間。3.4激發(fā)接觸challengeexposure機(jī)體接受誘導(dǎo)接觸后，再次接觸受試樣品的試驗(yàn)性接觸，以確定皮膚是否會(huì)出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)。3.5局部封閉敷貼法（BT）buehlertest3.6最大反應(yīng)試驗(yàn)（GPMT）guineapigmaximisationtest3.72GB/T21608-xxxx完全福氏佐劑（FCA）freund’scompleteadjuvant3.8十二烷基硫酸鈉（SDS）sodiumdodecylsulfate4試驗(yàn)?zāi)康拇_定重復(fù)接觸化學(xué)品對(duì)哺乳動(dòng)物是否可引起皮膚變態(tài)反應(yīng)及其程度。5試驗(yàn)基本原則實(shí)驗(yàn)動(dòng)物通過(guò)皮內(nèi)注射和/或多次皮膚涂抹誘導(dǎo)劑量受試樣品10d～14d（誘導(dǎo)期）后，動(dòng)物再次接觸激發(fā)劑量的受試樣品，對(duì)照組動(dòng)物僅接受激發(fā)接觸。通過(guò)比較染毒組和對(duì)照組動(dòng)物對(duì)激發(fā)接觸產(chǎn)生的皮膚反應(yīng)程度，判斷受試物是否可以誘發(fā)過(guò)敏反應(yīng)。6試驗(yàn)方法6.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和飼養(yǎng)環(huán)境6.1.1動(dòng)物種屬和性別首選健康、成年雄性和/或雌性白化豚鼠，體重250g～300g，雌性動(dòng)物應(yīng)該是未生育過(guò)和未懷孕的。如選擇其他種屬，試驗(yàn)者需提供選擇的依據(jù)。6.1.2動(dòng)物飼養(yǎng)和環(huán)境動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境應(yīng)符合GB14925—2010相應(yīng)規(guī)定。環(huán)境溫度維持在23℃±3℃,相對(duì)濕度為30%~70%，保持光照12h，黑暗12h，常規(guī)飼料，動(dòng)物自由飲食和飲水，豚鼠應(yīng)補(bǔ)充足量維生素C。實(shí)驗(yàn)前，動(dòng)物應(yīng)在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下適應(yīng)至少5d。實(shí)驗(yàn)前和實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，稱量動(dòng)物體重。6.2試驗(yàn)方法可靠性的檢查為了保證試驗(yàn)的可靠性，使用已知的能引起輕度/中度致敏的陽(yáng)性物每隔6個(gè)月做一次陽(yáng)性對(duì)照。盡量減少動(dòng)物的使用量，可將可靠性檢查與其他研究一起，使用同一個(gè)陰性對(duì)照組（如果溶劑相同）來(lái)進(jìn)行。局部封閉敷貼法至少有15%動(dòng)物出現(xiàn)皮膚過(guò)敏反應(yīng);皮內(nèi)注射法至少有30%動(dòng)物出現(xiàn)皮膚過(guò)敏反應(yīng)。陽(yáng)性物一般釆用：a)己苯乙烯醛(hexylcinnamicaldehyde,CASNo.101-86-0)；b）巰基苯并噻唑(2-mercaptobenzothiazole,CASNo.149-30-4);c）氨基苯甲酸乙酯(ethyl-4-aminobenzoate,CASNo.94-09-7)；用于可靠性檢查的致敏物濃度應(yīng)接近致敏閾值。也可以使用能夠滿足上述標(biāo)準(zhǔn)的其他陽(yáng)性物質(zhì)，說(shuō)明理由。6.3劑量設(shè)計(jì)試驗(yàn)劑量水平可以通過(guò)少量動(dòng)物(2只?3只)的預(yù)試驗(yàn)獲得。在受試物存在皮膚剌激性時(shí)，誘導(dǎo)劑量為能足以引起皮膚輕度刺激反應(yīng)的劑量(最小刺激劑量)，激發(fā)劑量為不引起皮膚刺激反應(yīng)的最大劑3GB/T21608-xxxx量(最大無(wú)刺激劑量）賦形劑的選擇應(yīng)合理，固體受試樣品應(yīng)經(jīng)過(guò)精細(xì)研磨并與適宜的賦型劑混合，水溶性受試樣品可用水或無(wú)刺激性表面活性劑作為賦形劑，其他受試樣品可用80%乙醇（誘導(dǎo)接觸）或丙酮（激發(fā)接觸）作賦形劑。液體也可不稀釋直接使用原溶液。6.4試驗(yàn)步驟6.4.1局部封閉敷貼法(BuehlerTest)6.4.1.1動(dòng)物數(shù)試驗(yàn)組至少20只，對(duì)照組至少10只。6.4.1.2劑量水平誘導(dǎo)接觸的受試樣品濃度是能夠引起輕度皮膚刺激反應(yīng)的最高濃度，激發(fā)接觸的受試樣品濃度應(yīng)是不引起皮膚刺激性的最高濃度。試驗(yàn)濃度水平可用2只?3只動(dòng)物進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)獲得。在試驗(yàn)中設(shè)陰性對(duì)照組,在誘導(dǎo)接觸時(shí)該組僅涂以溶劑作為對(duì)照；在激發(fā)接觸時(shí)該組涂以受試樣品。對(duì)照組動(dòng)物必須與受試樣品組動(dòng)物為同一批。在實(shí)驗(yàn)室開展致敏反應(yīng)試驗(yàn)初期、或使用新的動(dòng)物種屬或品系時(shí)，需同時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照組。6.4.1.3誘導(dǎo)接觸第0天試驗(yàn)前24h實(shí)驗(yàn)動(dòng)物背部一側(cè)去毛。將新配制的受試樣品（固體粉粹并加入合理溶劑，液體樣品可不稀釋）涂布在背部4-6cm2的區(qū)域，以二層紗布和一層玻璃紙覆蓋，再以無(wú)刺激膠帶封閉固定6h。對(duì)照組僅使用溶劑。第6～8天和第13～15天在背部同一區(qū)域以第0天的相同方法再重復(fù)一次。6.4.1.4激發(fā)接觸第27～29天在染毒組和對(duì)照組動(dòng)物另一側(cè)背部皮膚脫毛。以最大無(wú)刺激濃度的受試物貼敷于豚鼠背部去毛去（試驗(yàn)前24h去毛），然后用二層紗布和一層玻璃紙覆蓋，再以無(wú)刺激膠帶封閉固定6h。如激發(fā)接觸結(jié)果可疑，該動(dòng)物可以一周后重新激發(fā)，用最初的對(duì)照組或新的對(duì)照組進(jìn)行比較。6.4.1.5觀察與結(jié)果評(píng)價(jià)激發(fā)接觸結(jié)束，除去涂有受試樣品的濾紙后24h和48h觀察皮膚反應(yīng)（激發(fā)區(qū)在除去貼片大約21h可進(jìn)行清洗和去毛，清除受試殘留物可用水或選用不改變皮膚已有反應(yīng)和不損傷皮膚的溶劑），用盲法觀察對(duì)照組和試驗(yàn)。對(duì)所有皮膚反應(yīng)和異常，包括全身性反應(yīng)、誘導(dǎo)和激發(fā)過(guò)程所產(chǎn)生的結(jié)果均進(jìn)行觀察和記錄（為確定可疑反應(yīng)，也可進(jìn)行組織病理學(xué)檢查、皮膚皺折厚度測(cè)量等）。按表1對(duì)局部皮膚反應(yīng)評(píng)分。當(dāng)受試樣品組動(dòng)物出現(xiàn)皮膚反應(yīng)積分不小于2時(shí)，判為該動(dòng)物出現(xiàn)皮膚致敏反應(yīng)陽(yáng)性，并計(jì)算致敏率，按表2判定受試樣品的致敏強(qiáng)度。4GB/T21608-xxxx表1皮膚致敏反應(yīng)試驗(yàn)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)(1)1表2皮膚致敏反應(yīng)試驗(yàn)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)(2)I弱nm強(qiáng)V注：致敏率是反應(yīng)評(píng)分為1或以上的動(dòng)物數(shù)占該組動(dòng)物總數(shù)的百分比，I級(jí)致敏度沒有6.4.2豚鼠最大反應(yīng)試驗(yàn)（GPMT）采用FCA皮內(nèi)注射方法檢測(cè)致敏的可能性。6.4.2.1動(dòng)物數(shù)試驗(yàn)組至少10只，對(duì)照組至少5只，如果試驗(yàn)結(jié)果難以確定受試樣品的致敏性，應(yīng)增加動(dòng)物數(shù)，試驗(yàn)組至少20只，對(duì)照組至少10只。6.4.2.2劑量水平誘導(dǎo)接觸的受試樣品濃度為能引起輕度至中度皮膚刺激反應(yīng)而不表現(xiàn)全身反應(yīng)的最高濃度，激發(fā)接觸的受試樣品濃度為不能引起皮膚刺激反應(yīng)的最高濃度。試驗(yàn)濃度水平可以通過(guò)少量動(dòng)物（2只?3只）的預(yù)試驗(yàn)獲得。實(shí)驗(yàn)中應(yīng)考慮使用福氏完全佐劑（FCA）處理動(dòng)物對(duì)染毒劑量的影響。6.4.2.3誘導(dǎo)接觸第0天試驗(yàn)組動(dòng)物頸背部去毛區(qū)中線兩側(cè)做三對(duì)皮內(nèi)注射點(diǎn)，每點(diǎn)皮內(nèi)注射0.1mL下述溶液。第一對(duì)注射點(diǎn)1:1（體積比）FCA/水或生理鹽水的混合物；5GB/T21608-xxxx第二對(duì)注射點(diǎn)耐受濃度的受試樣品；第三對(duì)注射點(diǎn)用1:1（體積比）FCA/水或生理鹽水配制的受試樣品，濃度與第2點(diǎn)相同。在第三對(duì)注射點(diǎn)，水溶性受試樣品先溶于水中后再與FCA混合脂溶性或不溶受試樣品則先混懸于FCA中再與水混合。濃度與第二對(duì)注射點(diǎn)濃度相同。第一和第二對(duì)注射點(diǎn)彼此接近且靠近頭部，而第三對(duì)注射點(diǎn)在靠近尾端的試驗(yàn)部位。對(duì)照組：注射部位同受試樣品。第一對(duì)注射點(diǎn)1:1（體積比）FCA/水或生理鹽水的混合物；第二對(duì)注射點(diǎn)未稀釋賦形劑；第三對(duì)注射點(diǎn)用1:1（體積比）FCA/水或生理鹽水配制的濃度為50%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的賦形劑。6.4.2.4誘導(dǎo)接觸第6～8天，將涂有受試樣品（固體粉粹并加入合理溶劑，液體樣品可不稀釋）的2cm×4cm濾紙敷貼在上述再次去毛的注射部位，然后用兩層紗布，一層玻璃紙覆蓋,無(wú)刺激膠布封閉固定48h。對(duì)無(wú)皮膚刺激作用的受試樣品，可加強(qiáng)致敏，在第二次誘導(dǎo)接觸前24h在注射部位涂抹10%SDS0.5ml，目的是引起局部刺激作用。對(duì)照組僅用賦形劑作誘導(dǎo)處理。6.4.2.5激發(fā)接觸（皮膚接觸）第20～22天，豚鼠背部再次脫毛，將涂有受試樣品的濾紙片敷貼在去毛區(qū)，然后再用兩層紗布，一層玻璃紙覆蓋,，無(wú)刺激膠布封閉固定24h。對(duì)照組動(dòng)物作同樣處理。如激發(fā)接觸所得結(jié)果不能確定，可在第一次激發(fā)接觸一周后進(jìn)行第二次激發(fā)接觸。對(duì)照組做同步處理。6.4.2.6觀察與結(jié)果評(píng)價(jià)激發(fā)接觸結(jié)束，除去涂有受試樣品的濾紙后24h、48h和72h觀察皮膚反應(yīng)（激發(fā)區(qū)可進(jìn)行清洗和去毛，清除受試殘留物可用水或選用不改變皮膚已有反應(yīng)和不損傷皮膚的溶劑用盲法觀察對(duì)照組和試驗(yàn)組。對(duì)所有皮膚反應(yīng)和異常，包括全身性反應(yīng)、誘導(dǎo)和激發(fā)過(guò)程所產(chǎn)生的結(jié)果均進(jìn)行觀察和記錄（為確定可疑反應(yīng)，也可進(jìn)行組織病理學(xué)檢查、皮膚皺折厚度測(cè)量等）。按表3對(duì)局部皮膚反應(yīng)評(píng)分。當(dāng)受試樣品組動(dòng)物皮膚反應(yīng)積分不小于1時(shí)，應(yīng)判為皮膚致敏反應(yīng)陽(yáng)性，按表2對(duì)受試樣品進(jìn)行致敏強(qiáng)度分級(jí)。表3皮膚致敏反應(yīng)試驗(yàn)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)(3)7試驗(yàn)報(bào)告試驗(yàn)報(bào)告必須包括以下內(nèi)容：7.1受試樣品——物理屬性及基本理化性質(zhì)；——受試樣品標(biāo)識(shí)數(shù)據(jù)。6GB/T21608-xxxx7.2溶劑——標(biāo)識(shí)數(shù)據(jù)：純度、濃度（若已知）、所用體積；——選擇溶劑的理由。7.3試驗(yàn)動(dòng)物——豚鼠品系；——性別、鼠齡、數(shù)量；——來(lái)源、飼養(yǎng)條件；——試驗(yàn)開始和結(jié)束時(shí)動(dòng)物的體重。7.4試驗(yàn)條件——斑貼位置的準(zhǔn)備方法；——所用的斑貼材料和斑貼技術(shù)的詳細(xì)描述；——?jiǎng)┝克竭x擇（誘導(dǎo)和激發(fā)）的理由；——受試樣品的配制、貼敷和移除的詳細(xì)描述；——用于誘導(dǎo)和激發(fā)的溶劑和受試樣品的濃度及使用量；——飼料和水質(zhì)的詳細(xì)信息（包括飼料類型及來(lái)源、水來(lái)源——處理和取樣時(shí)間的詳細(xì)信息；——毒性檢測(cè)方法；——判斷陽(yáng)性或陰性結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)；——試驗(yàn)方案偏差的詳細(xì)信息、解釋試驗(yàn)偏差如何影響研究設(shè)計(jì)和結(jié)果；7.5可靠性檢查——最近一次可信性檢查試驗(yàn)結(jié)果的摘要，包括所用的陽(yáng)性物質(zhì)、濃度和溶劑等相關(guān)信息。7.6結(jié)果——過(guò)敏反應(yīng)及其他反應(yīng)出現(xiàn)、消失時(shí)間和反應(yīng)特點(diǎn)的文字描述；——過(guò)敏反應(yīng)強(qiáng)度分級(jí)方法；——染毒組及對(duì)照組皮膚過(guò)敏反應(yīng)的發(fā)生率；——組織病理學(xué)發(fā)現(xiàn)；——統(tǒng)計(jì)分析（如有）；8結(jié)果解釋試驗(yàn)結(jié)果應(yīng)能得出受試樣品的致敏能力和強(qiáng)度，這些結(jié)果只