食品免疫學(xué)免疫檢測技術(shù)-1

免疫檢測技術(shù)（1）非標(biāo)記免疫檢測技術(shù)第1節(jié)凝集反應(yīng)凝集反應(yīng)定義細(xì)菌、螺旋體、紅細(xì)胞或其他顆粒性抗原，或可溶性抗原（或抗體）與載體顆粒結(jié)合成致敏顆粒后，與相應(yīng)抗體（或抗原）發(fā)生特異性反應(yīng)，在適當(dāng)電解質(zhì)存在下，形成肉眼可見的凝集現(xiàn)象。反應(yīng)階段：抗原抗體的特異性結(jié)合階段出現(xiàn)肉眼可見凝集階段反應(yīng)特點(diǎn)：IgM的作用比IgG大數(shù)百倍,易出現(xiàn)可見凝集IgG與抗原結(jié)合后，常不出現(xiàn)凝集反應(yīng)，稱不完全抗體。凝集反應(yīng)的階段和特點(diǎn)一、直接凝集反應(yīng)直接凝集反應(yīng)(directagglutination)：顆粒性抗原直接與抗體結(jié)合，在電解質(zhì)的作用下，出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象。Q（一）玻片凝集-檢測血型AB無反應(yīng)凝集反應(yīng)體系（載玻片）紅細(xì)胞（抗凝血）抗血清（血型抗體）（二）試管凝集-肥達(dá)反應(yīng)反應(yīng)體系（試管）菌液血清方法評價(jià)：半定量試驗(yàn)簡便、快速敏感度低可有假陽性臨床應(yīng)用：WidalreactionWeil-felixreactionWrighttest:布魯菌病交叉配血試驗(yàn)（三）間接凝集反應(yīng)間接凝集反應(yīng)(indirectagglutination):將可溶性抗原或抗體吸附于顆粒性載體表面，然后與相應(yīng)的抗體或抗原反應(yīng)，在電解質(zhì)的作用下，出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象正向間接凝集試驗(yàn)反向間接凝集試驗(yàn)間接凝集抑制試驗(yàn)協(xié)同凝集試驗(yàn)按原理，間接凝集反應(yīng)可分為如下4種類型：用抗原致敏載體--檢測抗體?正向間接凝集試反應(yīng)?反向間接凝集反應(yīng)用抗體致敏載體----檢測抗原?間接凝集抑制試驗(yàn)用抗原致敏載體—競爭法檢測抗原?協(xié)同凝集反應(yīng)SPA能與IgG的Fc片段非特異性結(jié)合,同時(shí)不影響Fab片段的活性,所以當(dāng)帶有SPA的金黃色葡萄球菌與抗體混合,再加入適量的相應(yīng)抗原,產(chǎn)生凝集現(xiàn)象。實(shí)際應(yīng)用的凝集反應(yīng)1.血凝試驗(yàn)(直接凝集）?可在微量滴定板或試管中進(jìn)行，將標(biāo)本倍比稀釋，一般為1:64，同時(shí)設(shè)不含標(biāo)本的稀釋液對照孔。2.膠乳凝集試驗(yàn)（間接凝集）抗球蛋白試驗(yàn)又稱Coombs試驗(yàn)三、抗球蛋白試驗(yàn)（檢測抗體的凝集反應(yīng)）（一）直接Coombs試驗(yàn)不完全抗體檢測紅細(xì)胞上抗體（二）間接Coombs試驗(yàn)檢測血清中的抗紅細(xì)胞抗體Coomb實(shí)驗(yàn)在臨床的應(yīng)用在輸血上的應(yīng)用--血型抗原抗體的檢查對新生兒溶血性貧血性疾病的診斷對溶血性貧血的研究細(xì)菌或立克次體的不完全抗體檢查第2節(jié)沉淀反應(yīng)沉淀反應(yīng)（precipitation）是指可溶性抗原與相應(yīng)抗體在適當(dāng)條件下發(fā)生特異性結(jié)合而出現(xiàn)的沉淀現(xiàn)象,其特性與經(jīng)典的抗原抗體反應(yīng)相同。形成肉眼可見免疫復(fù)合物的階段。沉淀線或沉淀環(huán)的觀察以及免疫比濁法中的終點(diǎn)法就是測定此階段形成的復(fù)合物第一階段第二階段沉淀反應(yīng)分兩個(gè)階段抗原抗體特異性結(jié)合階段?？焖俚豢梢?，免疫比濁法中的速率法就是利用此階段測定免疫復(fù)合物形成的速率。一、液體內(nèi)沉淀試驗(yàn)原理：絮狀沉淀試驗(yàn)是將抗原與相應(yīng)抗體混合，在電解質(zhì)存在的條件下，抗原抗體結(jié)合形成肉眼可見的絮狀沉淀物。特點(diǎn)：方法受抗原抗體比例的影響非常明顯應(yīng)用：測定抗原抗體反應(yīng)的最適比例，可分為三種類型。(一)絮狀沉淀試驗(yàn)當(dāng)可溶性抗原與相應(yīng)抗體特異結(jié)合，二者比例合適時(shí)，在特殊的緩沖液中它們快速形成一定大小的抗原抗體復(fù)合物，使反應(yīng)液體出現(xiàn)濁度。利用現(xiàn)代光學(xué)測量儀器對濁度進(jìn)行測定從而檢測抗原含量。原理(二)免疫濁度測定1.抗原抗體的比例：反應(yīng)體系中保持抗體過量2.抗體的質(zhì)量：特異性強(qiáng)、效價(jià)高、親和力強(qiáng)的多抗；多用R型抗體3.抗原抗體反應(yīng)的溶液：PH為6.5～8.5，PBS4.增濁劑：吐溫-20，PEG等影響免疫濁度測定的因素透射免疫比濁法散射免疫比濁法免疫膠乳比濁法免疫濁度測定分類：二、凝膠內(nèi)沉淀試驗(yàn)原理：可溶性抗原和相應(yīng)抗體在凝膠中擴(kuò)散，形成濃度梯度，在抗原抗體相遇并且濃度比例適當(dāng)?shù)奈恢眯纬扇庋劭梢姷某恋砭€或沉淀環(huán)。常用的凝膠有瓊脂、瓊脂糖、葡聚糖或聚丙烯酰胺凝膠。原理原理：抗體與待測的抗原,在兩者比例合適的部位結(jié)合形成沉淀環(huán)。環(huán)的大小與抗原的濃度成正相關(guān)。技術(shù)要點(diǎn)：將抗體混入0.9%瓊脂糖內(nèi)（50℃），未凝固前傾注成平板，凝固后打孔（直徑3～5mm），孔中加入抗原溶液和不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，置濕盒內(nèi)37℃,24～48h觀察孔周圍是否出現(xiàn)沉淀環(huán)。定量試驗(yàn)（一）單向擴(kuò)散試驗(yàn)（平板法）傾注平板打孔加樣放置37℃24～48h觀察沉淀環(huán)原理：將抗原抗體分別加在瓊脂糖不同的對應(yīng)孔中，兩者在凝膠中自由擴(kuò)散，在比例合適處形成白色沉淀線。技術(shù)要點(diǎn)：平板玻璃上傾注一層均勻的瓊脂糖薄層，凝固后打孔，孔徑為3mm，孔間距在3～5mm之間，在相對的孔中加入抗原或抗體，放置濕盒37℃18～24h后，觀察孔周圍是否出現(xiàn)沉淀環(huán)。鑒定抗原抗體的最基本、最常見的方法之一二、雙向擴(kuò)散試驗(yàn)（平板法）（二）雙向擴(kuò)散試驗(yàn)（平板法）主要應(yīng)用?1.抗原或抗體的存在,及相對含量的估計(jì)?2.抗原或抗體相對分子量的估計(jì)?3.抗原性質(zhì)的分析?4.抗原或抗體純度的鑒定?5.抗體效價(jià)的滴定三、免疫電泳技術(shù)電泳與電滲-+電泳電滲電泳分析＋沉淀反應(yīng)免疫電泳技術(shù)火箭免疫電泳①②③④為標(biāo)準(zhǔn)抗原；⑤⑥為標(biāo)本-+主要的技術(shù)類型2.對流免疫電泳1.火箭免疫電泳3.免疫電泳4.免疫固定電泳電泳時(shí)凝膠中抗體不移動，樣品孔中的抗原向正極泳動，隨著抗原量的逐漸減少，抗原泳動的基底區(qū)越來越窄，抗原抗體分子復(fù)合物形成的沉淀線逐漸變窄，形成一個(gè)形狀如火箭的不溶性復(fù)合物沉淀峰，抗體濃度固定時(shí)，峰的高度與抗原量呈正相關(guān)。原理單向免疫擴(kuò)散＋電泳（定量檢測技術(shù)）1.火箭免疫電泳火箭免疫電泳圖①②③④為標(biāo)準(zhǔn)抗原；⑤⑥為標(biāo)本-+通電－蛋白質(zhì)抗原常帶較強(qiáng)的負(fù)電荷，在電場中向正極移動抗體球蛋白帶負(fù)電荷較少，籍電滲作用向負(fù)極泳動＋2.對流免疫電泳結(jié)果分析：?無沉淀線出現(xiàn)則表明無相應(yīng)的抗原。?沉淀線位于抗原抗體孔中間，說明兩者比例較適合。?沉淀線偏向抗原孔一方，表示抗體濃度＞抗原，反之，則是抗體濃度＜抗原濃度。原理：區(qū)帶電泳＋雙向擴(kuò)散1、將蛋白質(zhì)抗原在凝膠中電泳分成肉眼不可見的若干區(qū)帶2、沿電泳方向挖一與之平行的抗體槽，加入相應(yīng)抗血清進(jìn)行雙向擴(kuò)散。3.免疫電泳-+與免疫電泳不同之處，是將抗血清直接加于電泳后的蛋白質(zhì)區(qū)帶表面，抗原抗體在凝膠中直接發(fā)生沉淀反應(yīng)，在適當(dāng)位置形成抗原抗體復(fù)合物，經(jīng)染色后，可對各類免疫球蛋白及其輕鏈進(jìn)行分型。原理區(qū)帶電泳＋沉淀反應(yīng)4.免疫固定電泳左圖為IgGκ型,中圖為IgGλ型，右為正常SPGAMκλSPGAMκλSPGAMκλ免疫固定電泳示意圖1.凝集反應(yīng)定義？2.凝集反應(yīng)的階段和特點(diǎn)？3.什么叫直接凝集反應(yīng)，什么叫間接凝集反應(yīng)？4.