2.1微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)課件

到目前為止，幾十項(xiàng)Nobel生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)，化學(xué)獎(jiǎng)都與微生物學(xué)有關(guān)2.1微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)課題1微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)專題2微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用2.1微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)課題背景19世紀(jì)中期，關(guān)系到法國(guó)經(jīng)濟(jì)命脈的釀造業(yè)曾一度遭受毀滅性的打擊。在生產(chǎn)過(guò)程中，出現(xiàn)了葡萄酒變酸、變味的怪事。經(jīng)過(guò)一番研究，法國(guó)科學(xué)家巴斯德發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致生產(chǎn)失敗的根源在于發(fā)酵物中混入了雜菌。由此人們意識(shí)到保持培養(yǎng)物純凈的重要性。防止雜菌入侵，獲得純凈的培養(yǎng)物，是研究和應(yīng)用微生物的前提。一方面需要為培養(yǎng)的微生物提供合適的營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境條件，另一方面需要確保無(wú)處不在的其他微生物無(wú)法混入。2.1微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)一、基礎(chǔ)知識(shí)：（一）培養(yǎng)基

人們按照微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配制出供其生長(zhǎng)繁殖的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)。培養(yǎng)基就是微生物生存的環(huán)境和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)2.1微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)

液體培養(yǎng)基：（一般用錐形瓶盛裝;常用于工業(yè)生產(chǎn)）

固體培養(yǎng)基：（一般用試管或培養(yǎng)皿盛裝，在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上再添加凝固劑瓊脂;用于微生物的分離、計(jì)數(shù)、鑒定）

半固體培養(yǎng)基:（加少量瓊脂，用于觀察微生物的運(yùn)動(dòng)）1.培養(yǎng)基的種類(1)按物理狀態(tài)分：2.1微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基2.1微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)(2)按功能分：選擇培養(yǎng)基：加入某種化學(xué)物質(zhì)，從眾多微生物中分離出所需微生物鑒別培養(yǎng)基：加入某種試劑，鑒別不同種類的微生物2.1微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)2.培養(yǎng)基的基本成分：碳源、氮源、水、無(wú)機(jī)鹽⑴碳源無(wú)機(jī)碳源：有機(jī)碳源：CO2、CO32-、HCO3-牛肉膏、糖、脂肪酸自養(yǎng)微生物異養(yǎng)微生物⑵氮源無(wú)機(jī)氮源：有機(jī)氮源：NH4＋、NO3-、N2牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等討論1：回憶有關(guān)活細(xì)胞中元素組成的知識(shí)，想一想為什么大多數(shù)培養(yǎng)基都含有這四類物質(zhì)？2.1微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)組成生物體最基本的元素是:C、H、O、N注：含CHON的如蛋白質(zhì)，可以作為異養(yǎng)微生物的碳源、氮源和能源。2.1微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)1000mL牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基配方培養(yǎng)基組分提供的主要營(yíng)養(yǎng)牛肉膏5.0g碳源、氮源、磷酸鹽和維生素蛋白胨10.0g

氮源、維生素、碳源NaCl5.0g

無(wú)機(jī)鹽H2O

定容至1000ml

氫元素、氧元素

除此之外，還需要滿足微生物生長(zhǎng)對(duì)特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（例如:生長(zhǎng)因子，即細(xì)菌生長(zhǎng)必需，而自身不能合成的化合物，如維生素、某些氨基酸等）

pH以及氧氣等要求。2.1微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)加入青霉素的培養(yǎng)基:不加氮源的無(wú)氮培養(yǎng)基:不加含碳有機(jī)物的無(wú)碳培養(yǎng)基:

幾種選擇培養(yǎng)基舉例：分離酵母菌、霉菌等真菌分離固氮菌

分離自養(yǎng)型微生物唯一碳源為纖維素的培養(yǎng)基分解纖維素的細(xì)菌2.1微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)3.培養(yǎng)基配制原則⑴目的明確：⑵營(yíng)養(yǎng)全面、濃度適宜、比例恰當(dāng)⑶適宜的pH值：有機(jī)碳源異養(yǎng)型：根據(jù)微生物的種類、培養(yǎng)目的選擇原料自養(yǎng)型：不加碳源加入緩沖劑細(xì)菌中性或微堿，真菌酸性（CO2碳源）生產(chǎn)科研固氮型：不加氮源2.1微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)（二）無(wú)菌技術(shù)

無(wú)菌技術(shù)泛指在培養(yǎng)微生物的操作中，所有防止雜菌污染的方法技術(shù)。

獲得純凈培養(yǎng)物的關(guān)鍵是防止外來(lái)雜菌的入侵，無(wú)菌技術(shù)就是防止雜菌污染的操作技術(shù)。2.1微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)（1）對(duì)實(shí)驗(yàn)操作的空間、操作者的衣著和手，進(jìn)行清潔和消毒。（2）將用于微生物培養(yǎng)的器皿、接種用具和培養(yǎng)基等進(jìn)行滅菌。（3）為避免周圍環(huán)境中微生物的污染，實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在酒精燈火焰附近進(jìn)行。（4）實(shí)驗(yàn)操作時(shí)應(yīng)避免已經(jīng)滅菌處理的材料用具與周圍的物品相接觸。無(wú)菌技術(shù)，主要包括以下幾個(gè)方面：2.1微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)耐高溫需保持干燥的物品，160～170℃1～2小時(shí)接種環(huán)、接種針等金屬用具70~75℃、30min80℃、15min100℃、5~6min消毒滅菌定義方法較為溫和理化方法，殺死部分有害菌體（不包括芽孢、孢子）強(qiáng)烈的理化方法，殺死所有微生物（包括芽孢、孢子）煮沸消毒法巴氏消毒法化學(xué)藥劑紫外線灼燒滅菌干熱滅菌酒精、氯氣、石炭酸等高壓蒸汽滅菌培養(yǎng)基，100KPa、121℃、15～30min消毒與滅菌：2.1微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)芽孢

有些細(xì)菌在一定的條件下，細(xì)胞里面形成一個(gè)橢圓形的休眠體，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，對(duì)干旱、低溫、高溫等惡劣的環(huán)境有很強(qiáng)的抵抗力。例如，有的細(xì)菌的芽孢，煮沸3小時(shí)以后才死亡。芽孢又小又輕，可以隨風(fēng)飄散。當(dāng)環(huán)境適宜（如溫度、水分適宜）的時(shí)候，芽孢又可以萌發(fā)，形成一個(gè)細(xì)菌。

細(xì)菌、原生動(dòng)物、真菌和植物等產(chǎn)生的一種有繁殖或休眠作用的生殖細(xì)胞。能直接發(fā)育成新個(gè)體。孢子2.1微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)請(qǐng)你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請(qǐng)選擇合適的方法。（1）培養(yǎng)細(xì)菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿（2）玻棒、試管、燒瓶和吸管（3）實(shí)驗(yàn)操作者的雙手思考2.1微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)1000ml牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配方H2O定容至1000mlNacl5g蛋白胨10g牛肉膏5g瓊脂20.0g二.實(shí)驗(yàn)操作：㈠制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基1.計(jì)算：培養(yǎng)基用量依配方比例計(jì)算各成分的用量2.稱量：3.溶化：牛肉膏黏稠，用稱量紙稱取牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加蓋牛肉膏、稱量紙、少量水加熱溶解→取紙→蛋白胨、NaCl→瓊脂→補(bǔ)水定容4.調(diào)pH、分裝、棉塞封口、包扎：5.滅菌：6.倒平板：培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿2.1微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)倒平板約50℃等約5——10分鐘后，將平板倒置灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基2.1微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50℃左右時(shí)，才能用來(lái)倒平板。你用什么辦法來(lái)估計(jì)培養(yǎng)基的溫度？問(wèn)題討論

答：可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時(shí)，就可以進(jìn)行倒平板了。2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過(guò)火焰？

答：通過(guò)灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。2.1微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)3.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？4.在倒平板的過(guò)程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個(gè)平板還能用來(lái)培養(yǎng)微生物嗎？為什么？

答：平板冷凝后，皿蓋上會(huì)凝結(jié)水珠，將平板倒置，既可防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基造成污染，又可防止培養(yǎng)基水分過(guò)快揮發(fā)。

答：空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個(gè)平板培養(yǎng)微生物。2.1微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)單個(gè)細(xì)胞或少數(shù)菌體(2).特征：大小、形狀、光澤度、顏色、透明度等。(3).功能：(1).菌落定義：鑒定菌種的重要依據(jù)固體培養(yǎng)基上大量繁殖子細(xì)胞群體㈡純化大腸桿菌：分散成單個(gè)細(xì)胞,形成單個(gè)菌落2.1微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)㈡純化大腸桿菌：⑴平板劃線法：菌種劃3個(gè)平板1個(gè)不劃線1.接種方法：接種環(huán)防止劃破培養(yǎng)基（重復(fù)實(shí)驗(yàn)）（空白對(duì)照）2.1微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)微生物的恒溫培養(yǎng)微生物的恒溫培養(yǎng)2.1微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)微生物的恒溫培養(yǎng)2.1微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)問(wèn)題討論1.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時(shí)，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物殺死上次殘留的菌種，保證使下一次劃線時(shí)，菌種直接來(lái)源于上次劃線的末端，從而通過(guò)劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時(shí)菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到單個(gè)菌落。及時(shí)殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。2.1微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進(jìn)行劃線？答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。3.在作第二次以及其后的劃線操作時(shí)，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？

答：劃線后，線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個(gè)細(xì)菌繁殖而來(lái)的菌落。2.1微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)4.平板劃線時(shí)不能劃破培養(yǎng)基的原因：一旦劃破，會(huì)造成劃線不均勻，難以達(dá)到分離單菌落的目的；二是存留在劃破處的單個(gè)細(xì)胞無(wú)法形成規(guī)矩的菌落，菌落會(huì)沿著劃破處生長(zhǎng)，會(huì)形成一個(gè)條狀的菌落。2.1微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)6支試管，分別加入9ml無(wú)菌水1ml1011ml1021ml1031ml1041ml1051ml106⑵稀釋涂布平板法：a.梯度稀釋菌液：菌液微量移液器2.1微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)⑵稀釋涂布平板法：a.梯度稀釋菌液：b.涂布平板：不超過(guò)0.1ml各梯度分別涂布3個(gè)平板1個(gè)不涂布作空白對(duì)照滴灼試涂稀釋103倍稀釋104倍稀釋105倍2.1微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)微生物的恒溫培養(yǎng)2.1微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)涂布平板操作討論思考：

涂布平板的所有操作都應(yīng)在火焰附近進(jìn)行。結(jié)合平板劃線與系列稀釋的無(wú)菌操作要求，想一想，第2步應(yīng)如何進(jìn)行無(wú)菌操作？

應(yīng)從操作的各個(gè)細(xì)節(jié)保證“無(wú)菌”。例如，酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍等等。2.1微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)⑴平板劃線法：二.實(shí)驗(yàn)操作：㈠制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基㈡純化大腸桿菌：1.接種：⑵稀釋涂布平板法：2.培養(yǎng)：將接種后的培養(yǎng)基和一個(gè)未接種的培養(yǎng)基放入37℃恒溫箱中培養(yǎng)12h～24h后，觀察并記錄（可觀察是否有雜菌生長(zhǎng)）2.1微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)兩種接種方法形成的菌落2.1微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)三、課題成果評(píng)價(jià)

（一）培養(yǎng)基的制作是否合格如果未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫1～2d后無(wú)菌落生長(zhǎng)，說(shuō)明培養(yǎng)基的制備是成功的，否則需要重新制備。（二）接種操作是否符合無(wú)菌要求如果培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落的顏色、形狀、大小基本一致，并符合大腸桿菌菌落的特點(diǎn)，則說(shuō)明接種操作是符合要求的；如果培養(yǎng)基上出現(xiàn)了其他菌落，則說(shuō)明接種過(guò)程中，無(wú)菌操作還未達(dá)到要求，需要分析原因，再次練習(xí)。（三）是否進(jìn)行了及時(shí)細(xì)致的觀察與記錄培養(yǎng)12h與24h后的大腸桿菌菌落的大小會(huì)有明顯不同2.1微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)四、課題延伸——菌種的保藏：1.臨時(shí)保藏：試管固體斜面培養(yǎng)基上4℃2.長(zhǎng)期保存：菌種易被污染、變異甘油管藏1ml甘油＋1ml菌液－20℃擱置斜面2.1微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)本課題知識(shí)小結(jié):2.1微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)今天你很棒，繼續(xù)加油哦！2.1微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)將接種環(huán)放在火焰上灼燒，直到接種環(huán)_______在_______旁冷卻接種環(huán)，并打開棉塞將試管口通過(guò)火焰.將已______的接種環(huán)伸入菌液中蘸取一環(huán)菌液左手將皿蓋打開一條縫隙，右手將沾有菌種的接種環(huán)迅速伸入平板內(nèi)，劃__________條平行線，蓋上皿蓋。注意不要?jiǎng)澠婆囵B(yǎng)基。.將試管通過(guò)火焰，并塞上棉塞火焰冷卻三至五