(新版)靶向高通量測(cè)序在感染性疾病中應(yīng)用與實(shí)踐專家共識(shí)

高通量測(cè)序(NGS)技術(shù)為臨床感染性疾病提供了高通量檢測(cè)技術(shù)手段，主要包括宏基因組高通量測(cè)序(mNGS)、靶向高通量測(cè)序(tNGS)和全基因組測(cè)序(WGS)。tNGS和mNGS通量高，可一次性檢測(cè)百種以上病檢病原，但易受人源背景干擾。而tNGS通過特異性引物擴(kuò)增或者雜交捕獲的方式靶向富集目標(biāo)病原體或基因，測(cè)序量?jī)H為mNGS百分之一，成tNGS按照技術(shù)路線可分為多重PCR擴(kuò)增法和探針捕獲法。多重PCR擴(kuò)增法通過設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行超多重PCR擴(kuò)增富集目標(biāo)病原體的靶核苷酸序列，而探針捕獲法則通過探針雜交捕獲的方式進(jìn)行富集。多重PCR擴(kuò)增法比探針捕獲法成本更低且速度更快，工更少，但覆蓋的靶病原體不如探針捕獲法多。探針捕獲的靶區(qū)范圍更廣，顯著減少PCR冗余擴(kuò)增導(dǎo)致的完全重復(fù)序列[4]。盡管tNGS已用流程、報(bào)告發(fā)放和結(jié)果判讀的共識(shí)，可為感要依據(jù)。為此，中國(guó)醫(yī)療保健國(guó)際交流促進(jìn)物學(xué)檢驗(yàn)、感染病學(xué)、呼吸病學(xué)、流行病學(xué)等領(lǐng)共識(shí)，以助力tNGS的規(guī)范化應(yīng)用。tNGS與等一致之處，本共識(shí)不再贅述，具體可參考mNGS相關(guān)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)和專家一、共識(shí)制訂過程next-generationsequencing"“infection”“moleculardiagnostictechnology"“molecularantimicrobialsusceptibilitytesting”為關(guān)萬方數(shù)據(jù)知識(shí)服務(wù)平臺(tái)和維普數(shù)據(jù)庫(kù)自建庫(kù)至2024年9月的中、英文文獻(xiàn)，經(jīng)去重和同類文獻(xiàn)優(yōu)選等處理，最終納入符合本共識(shí)主題的文獻(xiàn)31議，再由執(zhí)筆小組進(jìn)行多輪修改，形成修改稿，并進(jìn)行兩次專家評(píng)議會(huì)，第一輪評(píng)議專家22位，其中臨床專業(yè)(包括感染、呼吸、重癥專業(yè))8生物信息專業(yè))5位。初稿推薦共識(shí)條目38條。刪除12條爭(zhēng)議比較大的第二輪評(píng)議專家31位，其中臨床專業(yè)(包括感染、呼吸、重癥專業(yè))15位，微生物學(xué)專業(yè)11位，其他專業(yè)(包括基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、公共衛(wèi)生、生命科學(xué)、生物信息專業(yè))5位。評(píng)議選項(xiàng)包括：同意、不同意、棄權(quán)。規(guī)則：90%以上評(píng)議專家同意則該共識(shí)描述為“建議”;70%~90%同意則該共識(shí)描述為“考慮”;70%以下同意則不納入共識(shí)。(一)病原診斷適應(yīng)證道感染、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染等常見病原譜不同，因此tNGS微生物靶標(biāo)設(shè)病原體，不建議納入某癥候群中無臨床意義的微生傳統(tǒng)微生物學(xué)檢測(cè)陰性時(shí)，考慮送檢tNGS;病情危重或新發(fā)突發(fā)傳染病時(shí)，考慮送檢mNGS。方法。tNGS相比PCR方法靶標(biāo)范圍更廣[9]。肺部感染的患者中，tNGS相比傳統(tǒng)檢測(cè)方法具有更高的陽(yáng)性率(96.7%比36.8%)[10]。共識(shí)2:針對(duì)不同的感染部位，建議覆蓋相應(yīng)病原譜的tNGS,比如肺部一項(xiàng)納入177名受試者201份支氣管肺泡灌洗液(BALF)標(biāo)本的研究顯和67.1%[11]。此外，102例肺部感染患者的痰液和BALF的研究中，tNGS(82.2%,106/129)與mNGS陽(yáng)性率(86.5%,109/126)結(jié)果顯示，培養(yǎng)、PCR和tNGS分別鑒定出13、19和62種微生物，這提示tNGS比常規(guī)檢測(cè)方法檢出了更多病原[13]。共識(shí)4:建議根據(jù)臨床需求和醫(yī)療花費(fèi)選擇不同tNGS方法。多重PCR多重PCR擴(kuò)增tNGS方法通常基于臨床已知致病病原序列設(shè)計(jì)，且相比共識(shí)5:臨床高度懷疑結(jié)核分枝桿菌感染或抗酸染色陽(yáng)性需鑒別非結(jié)核分枝桿菌(NTM)感染時(shí)，考慮選用包括結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群及致病性NTM的tNGS。結(jié)核病患者的早期發(fā)現(xiàn)和分診具有重要的臨床和流行病學(xué)意義[14]。tNGS有助于從(亞)種或復(fù)合群水平區(qū)分結(jié)核分枝桿菌和NTM。一項(xiàng)納入370株分離株、73個(gè)種/復(fù)合群的研究顯示，tNGS與基于表型、rpoB和(或)16SrDNA一代測(cè)序的復(fù)合參比方法相比，292株結(jié)果在(亞)種或復(fù)合群水平完全一致。在103、102和101基因組拷貝的梯度稀釋條件下，tNGS成功鑒定結(jié)核分枝桿菌的比例分別為16/16、13/16和0/16,成功鑒定胞內(nèi)分枝桿菌的比例為3/3、3/3和2/3[15]。(二)微生物耐藥適應(yīng)證測(cè)序深度難以分析亞型，因此不建議mNGS常規(guī)用于耐藥基因檢測(cè)。而tNGS檢測(cè)的靶標(biāo)相對(duì)確定，可將水解酶亞型特定區(qū)段作為富集靶標(biāo)，且相比mNGS的耐藥基因檢測(cè)限更低。使用臨床標(biāo)本進(jìn)行tNGS耐藥基因共識(shí)6:結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)和藥敏試驗(yàn)時(shí)間長(zhǎng)，建議tNGS用于呼吸道標(biāo)2024年，WHO推薦tNGS用于結(jié)核分枝桿菌分子藥敏檢測(cè)[16]。經(jīng)細(xì)菌學(xué)確診的肺結(jié)核患者，可在呼吸道標(biāo)本(痰液、BALF等)中使用tNGS技術(shù)檢測(cè)利福平、異煙肼、乙胺丁醇、吡嗪酰胺和氟喹諾酮類的耐藥性；相關(guān)藥物的耐藥基因靶點(diǎn)應(yīng)至少包括第一級(jí)耐藥基因(如rpoB、inhA、katG、embA、embB、pncA、gyrA、gyrB等),可參考WHO指南推薦[17]。經(jīng)細(xì)菌學(xué)確診的利福平耐藥肺結(jié)核患者，可在呼吸道標(biāo)本(痰液、BALF等)中使用tNGS技術(shù)檢測(cè)異煙肼、乙胺丁醇、吡此外，當(dāng)患者體內(nèi)存在異質(zhì)性耐藥時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)tNGS技術(shù)通過擴(kuò)增靶標(biāo)能力和標(biāo)本中細(xì)菌載量相關(guān)[15]。-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)、萬古霉素美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)M100文件推薦部分微生物中對(duì)以下位點(diǎn)可進(jìn)行分子檢測(cè)[20],但tNGS需要積累更多證據(jù)，且應(yīng)盡可啶-阿維巴坦敏感)和酶抑制劑耐藥型(對(duì)頭孢他啶-阿維巴坦耐藥)等，結(jié)果和表型藥敏在部分標(biāo)本中一致[11],但實(shí)際臨床應(yīng)用尚需更多測(cè)[24],后逐漸擴(kuò)展至人感染相關(guān)的其他病原[25]及環(huán)境(一)引物/探針設(shè)計(jì)共識(shí)9:建議tNGS引物或探針設(shè)計(jì)遵循特異、保守、堿基均勻的原則，引物/探針及目的片段大小應(yīng)控制在適當(dāng)?shù)姆秶?，如擴(kuò)增子長(zhǎng)度宜在200bp內(nèi)，探針長(zhǎng)度宜介于80~120bp。引物和探針需完成干實(shí)驗(yàn)和濕實(shí)驗(yàn)引物/探針的數(shù)量及組合，應(yīng)考慮但不限于病原鑒定的特異性、敏感性、包容性等。引物/探針的序列應(yīng)能夠特異性識(shí)別目標(biāo)病原體微生物的基因引物/探針序列中的ATCG堿基應(yīng)均勻分含量為40%~60%,避免出現(xiàn)連續(xù)重復(fù)序列和嚴(yán)重的二級(jí)結(jié)構(gòu)[14],引物和探針的長(zhǎng)度越引物和探針的性能評(píng)價(jià)需通過生物信息分析如采用PrimerBLAST等軟(二)防污染措施1.實(shí)驗(yàn)室防污染措施共識(shí)10:tNGS實(shí)驗(yàn)過程中靶標(biāo)被極大富集，核酸污染場(chǎng)地要求建議參考已發(fā)表的專家共識(shí)和團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)中的mNGS檢測(cè)病原微程的質(zhì)量控制要求可參考已發(fā)表的高通量測(cè)序?qū)＜夜沧R(shí)[29]。2.生物信息降噪措施共識(shí)11:試劑工程菌、背景環(huán)境菌、環(huán)境中的氣溶膠可能導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)基線數(shù)據(jù)庫(kù)主要包括陰性對(duì)照基線和歷史檢測(cè)基于當(dāng)批陰性質(zhì)量控制(質(zhì)控)樣本檢測(cè)到微生物數(shù)據(jù)建立同批次對(duì)照基對(duì)照基線。與基線數(shù)據(jù)比較，進(jìn)一步確認(rèn)檢測(cè)結(jié)(三)性能確認(rèn)共識(shí)12:tNGS檢測(cè)中引物/探針、酶等關(guān)鍵原材料或檢測(cè)流程中關(guān)鍵參標(biāo)本前處理方法、提取試劑、測(cè)序試劑等發(fā)生變化都會(huì)影響tNGS檢測(cè)結(jié)果。確認(rèn)滿足預(yù)期技術(shù)要求和臨床需求的檢測(cè)試劑和流程不應(yīng)輕易改變。性能確認(rèn)時(shí)應(yīng)選用各種類型的代表性物種進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，至少應(yīng)覆蓋DNA病(四)質(zhì)控共識(shí)13:建議進(jìn)行全流程質(zhì)控，包含陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照、內(nèi)參、數(shù)據(jù)臨床標(biāo)本規(guī)范采集的要求與mNGS無差異，可參考已有專家共識(shí)和行業(yè)(一)核酸提取共識(shí)14:核酸提取試劑盒應(yīng)兼顧不同病原類型的提取效率，試劑工程菌標(biāo)本前處理要求和核酸提取注意事項(xiàng)與mNGS無差異，建議參考已發(fā)表(二)建庫(kù)和測(cè)序共識(shí)15:根據(jù)不同癥候群、靶標(biāo)范圍、擴(kuò)增富集效率等因素確定文庫(kù)長(zhǎng)特點(diǎn)制定合適的讀長(zhǎng)和數(shù)據(jù)量是保證分析結(jié)果準(zhǔn)確的關(guān)鍵。長(zhǎng)讀長(zhǎng)(如≥量根據(jù)不同癥候群、擴(kuò)增或捕獲效率等研究確測(cè)限95%檢出率所需要的最低序列數(shù)。(三)生物信息學(xué)分析共識(shí)16:為確保數(shù)據(jù)質(zhì)量可滿足后續(xù)分析要求，建議實(shí)驗(yàn)室對(duì)原始測(cè)序特征(如常見的引物、探針的二級(jí)結(jié)構(gòu))識(shí)別或去除人源序列。此外，基于多重PCR的tNGS,應(yīng)建立引物量比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)以及陽(yáng)性判斷閾值建立和驗(yàn)證[14]。共識(shí)17:建議實(shí)驗(yàn)室在國(guó)際/國(guó)內(nèi)公認(rèn)的公共數(shù)據(jù)庫(kù)的基礎(chǔ)上篩選高質(zhì)量數(shù)據(jù)庫(kù)建立可參考團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)和專家共識(shí)[5,8]。在比對(duì)分析時(shí)，應(yīng)關(guān)注富集區(qū)段的單核苷酸多態(tài)性(SNP)變化，這些區(qū)段可能包含病原(四)陽(yáng)性判斷值確定共識(shí)18:實(shí)驗(yàn)室綜合考慮標(biāo)本類型、靶標(biāo)類型、富集效率等因素，設(shè)立陽(yáng)性判斷值的確定應(yīng)包括以下步驟，(1)檢出病原二次驗(yàn)證，明確該病原進(jìn)一步驗(yàn)證。(2)陽(yáng)性判斷值建立：考慮到tNGS方法學(xué)靶標(biāo)較多(通常超過100種)且覆蓋較多的罕見病原，對(duì)每種病原(特別是罕見)建立陽(yáng)性判斷值較為困難。可根據(jù)病原類型、檢出效率或同源的引物/探針進(jìn)行曲線分析以確定陽(yáng)性判斷值和分析性能[14]。(3)結(jié)合影像學(xué)、病斷性能。共識(shí)19:實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立用于監(jiān)測(cè)和管理生物信息學(xué)分析程序、流程及數(shù)共識(shí)20:實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對(duì)生物信息分析的結(jié)果進(jìn)行解釋和驗(yàn)證，包括解釋檢共識(shí)21:測(cè)序數(shù)據(jù)可考慮以fastq或bam格式雙份存儲(chǔ)于不同的儲(chǔ)存介比mNGS,在報(bào)告發(fā)放和解讀的過程中應(yīng)額外考慮tNGS的病原覆蓋范基因信息判讀、多學(xué)科會(huì)診和總結(jié)(必要時(shí))。(一)報(bào)告發(fā)放2.病原微生物注解致病性分級(jí)(二)責(zé)任病原體臨床判讀和處置1.責(zé)任病原體臨床判讀共識(shí)23:建議結(jié)合標(biāo)本類型、病原種類、均一化序列數(shù)等指標(biāo)進(jìn)行報(bào)告理論上，針對(duì)不同癥候群的tNGS在設(shè)計(jì)時(shí)已排除不相關(guān)的微生物，但仍/少見病原，可查詢文獻(xiàn)、CAP-CHINA等網(wǎng)站，尋找文獻(xiàn)支持；并及時(shí)能性，必要時(shí)可尋求其他臨床證據(jù)。應(yīng)注意，不同標(biāo)本的tNGS序列數(shù)不2.責(zé)任病原體臨床處置如確定為致病微生物，根據(jù)tNGS報(bào)告的結(jié)果進(jìn)行針對(duì)性治療。應(yīng)密切關(guān)注患者治療效果，如已采取針對(duì)性治積極與其他病因相鑒別，重復(fù)采樣、或送檢不同部位標(biāo)本、或更換其他(三)陰性結(jié)果臨床判讀和決策共識(shí)24:陰性結(jié)果不建議單獨(dú)作為排除依據(jù)，應(yīng)結(jié)合tNGS的靶標(biāo)覆蓋濕實(shí)驗(yàn)技術(shù)問題導(dǎo)致：破壁困難導(dǎo)致核酸未徹底釋放、微生物含量過低、標(biāo)本采樣不規(guī)范、存儲(chǔ)或運(yùn)輸不當(dāng)?shù)龋?3)干實(shí)驗(yàn)問題導(dǎo)致：微生物序列(四)耐藥基因判讀共識(shí)25:建議結(jié)合相對(duì)應(yīng)的病原微生物均一化序列數(shù)、耐藥機(jī)制、tNGS對(duì)于結(jié)核分枝桿菌耐藥檢測(cè)，耐藥結(jié)果顯示陽(yáng)性共識(shí)26:tNGS報(bào)告單建議標(biāo)注使用的tNGS方法(探針捕獲/多重PCR擴(kuò)增),并可考慮分為以下主要部分：臨床診斷、標(biāo)本信息、病原微生物多重PCR擴(kuò)增tNGS方法，建議報(bào)告：病原類型、中英文名稱、耐藥基因、毒力基因、均一化序列數(shù)、擴(kuò)增的引物數(shù)/靶標(biāo)預(yù)設(shè)的引物數(shù)、陽(yáng)性判斷值、特異性序列長(zhǎng)度和致病性(掃描二維碼可瀏覽附錄1:多重PCR擴(kuò)增tNGS