免疫學(xué)：酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測抗體的效價

酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測抗體的效價

免疫標(biāo)記技術(shù)定義：

將抗原-抗體反應(yīng)與標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合，用放射性同位素、酶或熒光素標(biāo)記的已知抗體或抗原，通過檢測標(biāo)記物，間接測定未知的抗原或抗體。分類：放射免疫測定法：131I，32P免疫熒光技術(shù)：FITC，PE免疫酶測定法：HRP，AP免疫酶測定法

(EnzymeImmunoAssay,EIA)用酶標(biāo)記的抗原或抗體進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)。

辣根過氧化物酶(HRP)，堿性磷酸酶(AP)特點：高度特異性：保持抗原抗體反應(yīng)的特異性高靈敏度：酶催化底物顯色的高效性，pg水平微量檢測定性定量檢測：反應(yīng)液顏色深淺或光密度值分類：酶聯(lián)免疫吸附試驗：可溶性抗原或抗體酶免疫組化法：組織中或細(xì)胞表面的抗原。酶聯(lián)免疫吸附試驗

(Enzyme-LinkedImmunoSorbent

Assay,ELISA)用酶標(biāo)記抗原或抗體檢測液體（血液、細(xì)胞液）中未知抗體或抗原的方法。1.定義2.分類間接法（IndirectELISA）：將已知抗原吸附于固相載體，酶標(biāo)記二抗檢測液相中未知抗體雙抗體夾心法（SandwichELISA)：將已知抗體吸附于固相載體，酶標(biāo)記一抗檢測液相中的可溶性抗原競爭法（CompetitiveELISA)：將已知抗體或抗原吸附于固相載體，酶標(biāo)記抗原或抗體檢測液相中的可溶性抗原或抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗

(Enzyme-LinkedImmunoSorbent

Assay,ELISA)3.原理（以間接性ELISA為例）：顯色實驗材料牛血清白蛋白（BSA)——抗原，2%（W/V）溶液，PBS配制小鼠抗血清——待測樣品，用PBST從1：1000開始倍比稀釋，連續(xù)稀釋8個稀釋度HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG——二抗（按說明書稀釋使用，用PBST稀釋）包被緩沖液：0.05MpH9.6碳酸鹽緩沖液（NaHCO31.59克，NaHCO3

2.93克，加水至1L）洗滌液：含0.05%Tween20的0.01MpH7.4PBS（氯化鈉8.5g,十二水磷酸氫二鈉2.85克或二水磷酸氫二鈉1.13克，氯化鉀0.2克，磷酸二氫鉀0.27克，蒸餾水1000毫升）底物溶液：TMB溶液2MH2SO4（市售濃硫酸為18.4M，根據(jù)要配制的2M硫酸體積，吸管吸好相應(yīng)體積濃硫酸沿著器壁緩慢加到水中）酶標(biāo)板，酶標(biāo)儀保鮮膜排槍實驗方法2.包被抗原：取酶標(biāo)板，加入100μL/孔的抗原溶液4℃，保鮮膜包好，18h取出包被好抗原的酶標(biāo)板（4孔/組），甩干孔內(nèi)液體以洗滌液（200μL/孔）洗滌3次，3min/次2.加待測血清標(biāo)記各孔，加入相應(yīng)液體100μL/孔1234陰性空白陽性待測3.加二抗：37℃，保鮮膜包好，60min甩干孔內(nèi)液體以洗滌液（200μL/孔）洗滌4次，3min/次各孔加入酶標(biāo)二抗100μL/孔37℃，保鮮膜包好，45min4.顯色：甩干孔內(nèi)液體以洗滌液（200μL/孔）洗滌4次，3min/次加入底物溶液50μL/孔避光顯色，10min，然后每孔加入50ul2M硫酸5.觀察結(jié)果實驗方法預(yù)期結(jié)果陽性：顯色為黃色