第八章抗生素類藥物的分析

第八章抗生素類藥物的分析

TheAnalysisofAantibioticdrugs

第一節(jié)概述抗生素的來源:＊多數(shù)抗生素生物合成(發(fā)酵)＊少數(shù)化學(xué)合成或者半合成1、抗生素類藥物一般檢查項(xiàng)目：

①鑒別試驗(yàn):用化學(xué)法、物理化學(xué)法以及生物學(xué)法來確認(rèn)是哪種抗生素②毒性試驗(yàn):控制藥品中的毒性物質(zhì)③無菌試驗(yàn):檢查藥品中有無雜菌污染④熱源試驗(yàn):控制藥品中的致熱物質(zhì)

⑤水分測定:控制水分含量⑥溶液澄明度檢查:檢查不溶性物質(zhì)⑦

溶液pH試驗(yàn):測定pH⑧降壓試驗(yàn):檢查有降壓作用的雜質(zhì)⑨

效價(jià)測定:有效成分測定生物學(xué)法物理化學(xué)法目前各國藥典仍以生物學(xué)測定法為主。2、效價(jià)測定抗生素的效價(jià)測定方法有:

(1)

生物學(xué)測定法

以抗生素抑制細(xì)菌生長能力或殺菌能力作為衡量效價(jià)標(biāo)準(zhǔn)優(yōu)點(diǎn)：①原理恰好與臨床要求一致，更能夠確定抗生素效價(jià)。②靈敏度高，需要樣品量較?、?/p>

既適用較純精制品,也適用于純度較差的產(chǎn)品

④

已知或新發(fā)現(xiàn)抗生素都能應(yīng)用

⑤同一類型的抗生素,不需要分離,

可一次測定它們的總效價(jià)。缺點(diǎn)①

操作步驟多，測定時(shí)間較長②

誤差較大(2)

物理化學(xué)測定法根據(jù)抗生素化學(xué)結(jié)構(gòu)利用其特有的化學(xué)或物理化學(xué)性質(zhì)及反應(yīng)進(jìn)行。優(yōu)點(diǎn)①

操作簡單、省時(shí)、方法準(zhǔn)確②

具有較高的專屬性

缺點(diǎn):

對于結(jié)構(gòu)相似的抗生素，測定結(jié)果往往只能代表總的含量，并不一定能代表某一抗生素的生物效價(jià)，只有當(dāng)用物理化學(xué)法測定結(jié)果與用生物學(xué)法測定效價(jià)相一致時(shí)，才能用于效價(jià)測定。

3、本章內(nèi)容＊

-內(nèi)酰胺類:青霉素類頭孢菌素類＊氨基糖苷類: 鏈霉素慶大霉素＊四環(huán)素類:第二節(jié)

-內(nèi)酰胺類抗生素的分析一、化學(xué)結(jié)構(gòu)與性質(zhì)

1、化學(xué)結(jié)構(gòu)①

青霉素類結(jié)構(gòu)＊青霉素類:

母核:由

-內(nèi)酰胺環(huán)和氫化噻唑環(huán)組成的雙雜環(huán)。

6-APA6-AminopenicillanicAcid

側(cè)鏈:RCO-

芐青霉素（青霉素G）氨芐青霉素R＝R＝②

頭孢菌素類結(jié)構(gòu)母核:

-內(nèi)酰胺環(huán)和二氫噻嗪環(huán)組成的雙雜環(huán)。（7-ACA）7-AminocephalospoanicAcid側(cè)鏈RCO-

2、性質(zhì)

青霉素類和頭孢菌素類結(jié)構(gòu)共同特點(diǎn)具有

-內(nèi)酰胺環(huán)。①

酸性＊有羧基，具有酸性＊pKa值在2.5~2.8之間＊與堿成鹽如：青霉素G鈉、青霉素G鉀等②

旋光性

有手性碳原子，具有旋光性3個(gè)手性碳原子2個(gè)手性碳原子③

紫外吸收

＊青霉素類母核沒有共軛系統(tǒng)，沒有紫外吸收

＊但青霉素類藥物在弱酸性下水解，可以產(chǎn)生具有共軛雙鍵的青霉烯酸，在紫外光區(qū)有吸收。

＊側(cè)鏈中有苯環(huán)等取代基的藥物，在紫外光區(qū)也有吸收。像芐青霉素。頭孢菌素類分子中有共軛體系（O＝C－N－C＝C）在260nm處有最大吸收。④

-內(nèi)酰胺環(huán)的不穩(wěn)定性

干燥、純凈青霉素類抗生素穩(wěn)定，其水溶液很不穩(wěn)定.不穩(wěn)定的部分是

-內(nèi)酰胺環(huán)

-內(nèi)酰胺環(huán)在酸、堿、青霉素酶、某些金屬離子的作用下，可使

-內(nèi)酰胺環(huán)開環(huán)或發(fā)生分子重排，而失去抗菌作用。?、?/p>

ⅲ

ⅳ

二、鑒別試驗(yàn)1、羥肟酸鐵反應(yīng)

2、青霉素的各種鹽的鑒別

3、硫酸及硫酸-甲醛反應(yīng)

4、硫酸-變色酸反應(yīng)

5、紫外分光光度法及紅外分光光度法三、含量測定①

原理青霉素在稀堿性條件下,水解生成青霉噻唑酸衍生物,此步水解定量完成,可用于含量測定。1、酸堿滴定法①

方法(ⅰ)水解前：將樣品溶液的pH調(diào)至8（加0.01mol/LNaOH液至顯粉紅色）(ⅱ)水解：加入定過量的標(biāo)準(zhǔn)堿溶液，水浴加熱使水解(ⅲ)剩余滴定：水解后，過量的堿用酸標(biāo)準(zhǔn)液回滴定(至pH8，粉紅色→無色)以“青霉素鈉”為例ChP90（2）空白試驗(yàn)：不加樣品，其余操作同上（1）主試驗(yàn)③

討論

(ⅰ)溶劑新沸過且用0.01MNaOH液中和的水目的：消除水中酸性物質(zhì)影響（如CO2）

(ⅱ)滴定前中和消除能消耗堿的雜質(zhì)影響（如一些酯類雜質(zhì)）(ⅲ)空白試驗(yàn)?zāi)康?

在加熱水解過程中，有可能會吸收CO2，對測定有影響，所以要做空白試驗(yàn)校正。(ⅳ)本法供試品用量較大，多用于效價(jià)高的供試品的測定2、碘量法①原理：青霉素或頭孢菌素分子不消耗碘，其在堿性條件下水解生成的降解產(chǎn)物—

青霉噻唑酸可與碘作用，根據(jù)消耗的碘量可以計(jì)算青霉素的含量。理論上:1mol青霉素≈8molI原子;實(shí)際上:1mol青霉素≈8~9molI原子※溫度，放置時(shí)間，pH，濃度，碘過量程度，雜質(zhì)多少等影響因素。②方法：

以“青霉素鈉”為例，ChP二部（1）主試驗(yàn)：（2）空白試驗(yàn)：③討論：（1）溶液的pH值在4.5左右（2）溫度：24~26℃（3）放置時(shí)間：15~20′（4）空白試驗(yàn)：做法與一般空白不同（加樣品,不加堿水解,其他操作同樣品）＊目的：消除樣品中預(yù)先存在的降解產(chǎn)物（青霉噻唑酸）及其他耗碘雜質(zhì)的影響（5）靈敏度高：因?yàn)?:8，所以供試液濃度在10~100μg/ml即可測定3、汞量法①原理：青霉素分子不與汞鹽反應(yīng)，但其降產(chǎn)物青霉噻唑酸及青酶胺可與汞鹽反應(yīng)，根據(jù)消耗的汞鹽量計(jì)算青霉素的含量。

青霉素分子中的氫化噻唑環(huán)含有一個(gè)硫原子，開環(huán)后形成巰基（—SH），可用汞量法測定

4、可見—紫外分光光度法

①原理：青霉素在弱酸性下（pH=4），不完全水解，產(chǎn)生青酶烯酸，在320—360nm處有強(qiáng)吸收。

青霉烯酸在酸性溶液中極不穩(wěn)定，有兩種改進(jìn)方法。（1）銅鹽法（JP13）：

銅離子與青酶烯酸形成穩(wěn)定的螯合物，在320nm處有最大吸收。對照品法定量。用于氨芐青霉素的含量測定。（2）硫醇汞鹽法（BP1993,ChP95）

青霉素在咪唑的催化下，與氯化高汞定量地反應(yīng)生成青酶烯酸硫醇汞鹽，在324—345nm下有最大吸收。

對照品→同樣操作用于氨芐西林鈉的含量測定

作用：咪唑:催化劑,使水解產(chǎn)率高,生成產(chǎn)物穩(wěn)定醋酐的乙腈溶液:乙?；逼S青霉素側(cè)鏈

—NH2,使λmax=325nm

硼酸緩沖液:調(diào)pH值

HgCl2:微量Hg2+催化劑,促進(jìn)反應(yīng),重現(xiàn)性好。

5、HPLC以“頭孢唑林鈉”為例色譜條件：柱：ODS

流動相：磷酸二氫鉀、枸櫞酸溶液—乙腈（88：12）檢測波長：254nm

內(nèi)標(biāo)物：乙酰苯胺第二節(jié)氨基糖甙類抗生素的分析一、化學(xué)結(jié)構(gòu)及性質(zhì)（一）鏈霉素

1、結(jié)構(gòu)

鏈霉胍N-甲基-L-葡萄糖胺鏈霉糖

2、性質(zhì)：（1）三個(gè)堿性中心：

2個(gè)強(qiáng)堿性胍基（PKa=11.5）

1個(gè)甲氨基（PKa=7.7）可與礦酸或有機(jī)酸成鹽（2）鏈霉素在酸性或堿性條件下可變?yōu)殒溍闺液玩溍闺p糖胺（二）慶大霉素1、結(jié)構(gòu)紫素胺＊三個(gè)類似結(jié)構(gòu)的C1、C2、C1a組成的混合物C1：R1=R2=CH3;C2：R1=CH3,R2=H;C1a：R1=R2=H,R3=HN-甲基-3-去氧-4-甲基戊糖胺脫氧鏈霉胺

2、性質(zhì)：（1）五個(gè)堿性中心——PKa~8

可與礦酸或有機(jī)酸成鹽（2）無UV吸收，（因?yàn)闊o共軛系統(tǒng)）二、鑒別試驗(yàn)（一）共同反應(yīng)

1、茚三酮反應(yīng)氨基糖苷結(jié)構(gòu)，具羥基胺類和α-氨基酸的性質(zhì)，可與茚三酮縮合成藍(lán)紫色縮合物。

2.N-甲基葡萄糖胺反應(yīng):

水解產(chǎn)物N-甲基葡萄糖胺特有反應(yīng)（二）鏈霉素的特征反應(yīng)1、麥芽酚反應(yīng)：鏈霉素在堿性溶液中，鏈酶糖經(jīng)分子重排，消除N—甲基葡萄糖胺及鏈酶胍，生成麥牙酚，麥牙酚可與鐵離子在微酸性溶液中形成紫紅色配位化合物。

2、坂口反應(yīng)：

本品水溶液，加氫氧化鈉試液，水解為鏈酶胍，與8—羥基喹啉作用，再加次溴酸鈉試液，生成橙紅色化合物。第三節(jié)四環(huán)素類抗生素的分析一、化學(xué)結(jié)構(gòu)四駢苯或萘駢萘的衍生物，氫化駢四苯環(huán)四個(gè)取代基RR1R2R3四環(huán)素(TC)HOHCH3H金霉素(CTC)ClOHCH3H土霉素(OTC)HOHCH3OH四個(gè)環(huán)A環(huán)B環(huán)C環(huán)D環(huán)二甲氨基—N(CH3)2酚羥基酰胺基—CONH2酮基與烯醇基共軛酮基與烯醇基共軛雙鍵系統(tǒng)雙鍵系統(tǒng)二、性質(zhì)

1、呈兩性：弱酸性——酚羥基、烯醇型羥基弱堿性——二甲胺基所以遇酸或堿均可成鹽2、含結(jié)晶水四環(huán)素：6個(gè)結(jié)晶水占19.6%土霉素：2個(gè)結(jié)晶水占7.5%

加熱時(shí)可失去結(jié)晶水,當(dāng)含水量低于19.6%的四環(huán)素和低于7.5%的土霉素,置于空氣中要吸收水分。

3．

溶解度：游離體在水中溶解度很小，溶解度與pH有關(guān)。pH4.5~7.2難溶于水,pH低于4或高于8時(shí),可以得到高濃度的水溶液.4．對氧化劑不穩(wěn)定：對各種氧化劑都不穩(wěn)定，且堿性水溶液特別易氧化，顏色很快變深形成色素，干燥品較穩(wěn)定，但貯存時(shí)遇光可使顏色變深（因空氣氧化）。三．化學(xué)反應(yīng)：1.差向異構(gòu)化反應(yīng)：（差向四環(huán)素）弱酸性（pH2.0~6.0）溶液中，A環(huán)上手性C4構(gòu)型的改變，發(fā)生差向異構(gòu)化，形成差向四環(huán)素。差向化速度的影響因素：pH<2或pH>9時(shí)，差向化速度很小。高價(jià)的無機(jī)酸或有機(jī)酸根存在或陰離子濃度增加，差向化速度增大。＊四環(huán)素和金霉素很易差向異構(gòu)化，形成4-差向四環(huán)素、4-差向金霉素，他們的抗菌性極弱或完全消失。＊土霉素和強(qiáng)力霉素由于C5上的羥基和二甲胺基形成氫鍵，不易發(fā)生差向異構(gòu)化。

2.酸性下降解反應(yīng):（脫水四環(huán)素類）在酸性（pH<2）時(shí)，C環(huán)上C6上羥基易脫落與C5a上的氫生成水，在C6-C5a間形成雙鍵。經(jīng)重排使C環(huán)芳構(gòu)化，生成脫水四環(huán)素類四環(huán)素、土霉素和金霉素可發(fā)生脫水；

3.堿性下降解反應(yīng)：（異四環(huán)素類）

在堿性下，C環(huán)打開，生成無活性的具有內(nèi)酯結(jié)構(gòu)的異四環(huán)素；若強(qiáng)堿性下加熱，可定量地轉(zhuǎn)化為異四環(huán)素，后者具有強(qiáng)烈熒光，可熒光法測定。

4.與金屬離子絡(luò)合：

能與許多金屬離子（鋯Zr4+,鈾U6+,鋅Zn2+,銅Cu2+,鋁Al3+,鎂Mg2+，鈰Ce4+,鈷Co2+）形成有色絡(luò)合物。四．鑒別

1.

與濃硫酸反應(yīng)：四環(huán)素類+濃H2SO4

→深紫色（四環(huán)素）藍(lán)色,迅速轉(zhuǎn)變?yōu)榫G（金霉素）朱紅色（土霉素）2.FeCl3反應(yīng)：

四環(huán)素類酚羥基+FeCl3

→紅棕色（四環(huán)素）深褐色（金霉素）