細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒（乳酸脫氫酶法）實(shí)驗(yàn)操作原理

細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒（乳酸脫氫酶法）實(shí)驗(yàn)操作原理原理乳酸脫氫酶（LDH）是一種氧化還原酶，可催化丙酮酸和乳酸的相互轉(zhuǎn)化以及NADH和NAD+的相互轉(zhuǎn)化。LDH是一種穩(wěn)定的酶，存在于所有細(xì)胞類型中，并在質(zhì)膜受損后迅速釋放到細(xì)胞培養(yǎng)基中。因此，LDH是細(xì)胞毒性研究中使用最廣泛的標(biāo)記。細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒（乳酸脫氫酶法）為研究細(xì)胞毒性提供了一種簡便的比色測(cè)定法。該測(cè)定基于在典型的細(xì)胞毒性測(cè)定中，將靶細(xì)胞與細(xì)胞毒性化學(xué)試劑或細(xì)胞毒性細(xì)胞（NK細(xì)胞，細(xì)胞毒性T細(xì)胞）一起培養(yǎng)，以誘導(dǎo)靶細(xì)胞死亡和LDH釋放。將含有LDH的上清液轉(zhuǎn)移至新的96孔測(cè)定板的孔中，并與LDHReactionSolution混合。在LDH的作用下，NADH和四唑鹽MTT反應(yīng)生成NAD+和MTT的還原形式,該MTT的還原形式在565nm處表現(xiàn)出最大吸收，產(chǎn)生的顏色強(qiáng)度與裂解的細(xì)胞數(shù)直接相關(guān)。在室溫下孵育30分鐘后，使用酶標(biāo)儀讀取565nm的吸光度。自備耗材·酶標(biāo)儀（能測(cè)565nm處的吸光度）及二氧化碳培養(yǎng)箱·96孔板，透明平底·平板離心機(jī)（可選）·可調(diào)節(jié)式移液槍及槍頭·去離子水試劑準(zhǔn)備AssayBuffer：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。LacticAcidSolution：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。MTTSolution：即用型；整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，冰上避光放置；分裝保存于-20℃。PESSolution：即用型；整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，冰上避光放置；分裝保存于-20℃。LDHPositiveControl：即用型；整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，冰上避光放置；分裝保存于-20℃。NAD+Solution：即用型；整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，冰上避光放置；分裝保存于-20℃。TritonX-100（10%）：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。LDHReactionSolution：通過混合3.7mLAssayBuffer，1.4mLMTTSolution，800μLNAD+Solution，100μLPESSolution，4.0mLLacticAcidSolution，以制備足以用于一個(gè)96孔板的10mLLDH反應(yīng)溶液，建議現(xiàn)配現(xiàn)用。實(shí)驗(yàn)步驟A確定藥物是否適用該試劑盒個(gè)別藥物可能會(huì)干擾反應(yīng)體系，故不適用于該試劑盒，因此，我們建議執(zhí)行初始預(yù)實(shí)驗(yàn)，以確定計(jì)劃使用的目標(biāo)藥物是否適用于該試劑盒，如果預(yù)實(shí)驗(yàn)顯示藥物有抑制作用，聯(lián)系A(chǔ)bbkine技術(shù)支持。培養(yǎng)細(xì)胞24h以上，離心除去顆粒，得到細(xì)胞培養(yǎng)上清。將細(xì)胞培養(yǎng)上清加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，200μL/孔，設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。在3個(gè)孔中加入20μL目標(biāo)藥物，另外3孔加入20μLAssayBuffer作為對(duì)照孔。每孔各取100μL轉(zhuǎn)移到新的96孔檢測(cè)板中。每孔加入100μLLDHReactionSolution。將板在37℃下孵育最多30min。用酶標(biāo)儀讀取565nm處的吸光度。評(píng)估加藥孔與對(duì)照孔的吸光度，若加藥孔明顯小于對(duì)照孔，說明該藥物不適用于該試劑盒。B樣本測(cè)定根據(jù)細(xì)胞的大小和生長速度確定最佳濃度，將200μL細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，使待檢測(cè)時(shí)細(xì)胞密度不超過80-90%。從96孔板中吸出生長培養(yǎng)基。用PBS洗滌細(xì)胞一次，然后將生長培養(yǎng)基替換為含1%血清的低血清培養(yǎng)基，再孵育1h。將200μL1%低血清培養(yǎng)基（無細(xì)胞）添加至三個(gè)孔作為背景對(duì)照和三個(gè)孔作為LDH陽性對(duì)照（可選做）。通過所需方法誘導(dǎo)細(xì)胞毒性，向適當(dāng)?shù)目字幸皇饺萏砑?0μL藥物。將20μL的10%TritonX-100溶液添加到三個(gè)含有細(xì)胞的孔中作為最大釋放。將20μLAssayBuffer添加到三個(gè)含有細(xì)胞的孔中作為自發(fā)釋放，同時(shí)將20μLAssayBuffer添加到三個(gè)只含1%低血清培養(yǎng)基無細(xì)胞的孔中作為背景對(duì)照。將20μLLDHPositiveControl添加到三個(gè)只含1%低血清培養(yǎng)基無細(xì)胞的孔中作為陽性對(duì)照。在37℃的CO2培養(yǎng)箱中孵育平板，使其達(dá)到實(shí)驗(yàn)所需的的時(shí)間。以400g的速度離心96孔組織培養(yǎng)板5min（可選做，但建議做）。將100μL細(xì)胞上清液轉(zhuǎn)移至新的96孔測(cè)定板中。向每個(gè)孔中添加100μLLDHReactionSolution。在37℃下孵育平板最多30min。用酶標(biāo)儀讀取565nm處的吸光度。從所有孔中減去背景A565水平。注意：加入藥物濃度應(yīng)是反應(yīng)體系的終濃度。每個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果計(jì)算為“細(xì)胞毒性百分比”，或靶細(xì)胞中所含LDH總量的百分比。因此，對(duì)于每個(gè)實(shí)驗(yàn)，必須有一組對(duì)照孔，其中使用試劑盒中提供的10%TritonX-100溶液殺死所有靶細(xì)胞。這些就是“最大釋放量”。同樣，在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中，必須有一組對(duì)照孔，其中未添加細(xì)胞毒性劑或細(xì)胞毒性細(xì)胞，從而導(dǎo)致最低的（自發(fā)的）LDH釋放，就是“自發(fā)釋放”細(xì)胞孔。用細(xì)胞毒劑處理的細(xì)胞將釋放一定數(shù)量的LDH，該數(shù)量介于最大釋放水平和自發(fā)釋放水平之間。結(jié)果計(jì)算以下公式計(jì)算為“細(xì)胞毒性百分比”細(xì)胞毒性百分比(%)=(A樣本－A自發(fā))/(A最大釋放－A自發(fā))×100A樣本，毒性試劑處理樣本在565nm處的吸光度；A自發(fā)，樣本在565nm處自發(fā)釋放的吸光度；A最大釋放，樣本在565nm處最大釋放的吸光度。注意事項(xiàng)不同批次號(hào)、不同的