PCR引物的設計與實驗操作技巧

微生物基因工程李剛副教授教學內容一、PCR引物的設計與實驗操作技巧聚合酶鏈式反響、分子克隆及DNA序列分析這三大類實驗方法幾乎構成了現代分子生物學的實驗工作的根底。而三者中，PCR方法在理論上出現最早，在實踐中應用得最廣泛。PCR反響的七種根本成份熱穩(wěn)定DNA聚合酶。一對特異的引導DNA合成的寡核苷酸引物。dNTP〔混合液：標準PCR反響包含4種等摩爾濃度的脫氧核苷三磷酸，即dATP、dTTP、dCTP和dGTP。二價陽離子。所有的熱穩(wěn)定DNA聚合酶都要求有游離的二價陽離子，通常是Mg2+用于激活。一價陽離子。標準PCR緩沖液內包含有50mmol/L的KCl，它對于擴增大于500bp的DNA片段是有益的，提高KCl濃度在約70－100mmol/L范圍內對改善擴增較短的DNA片段產物是有利的。模板DNA。含有靶序列的模板DNA科研單鏈或雙鏈形式參加PCR混合液中。閉環(huán)DNA模板的擴增效率略低于線性DNA。盡管模板DNA的長短不是PCR擴增的關鍵因素，但當使用高分子量的DNA〔>10kb〕作模板時，如用限制性內切酶先行消化〔此酶不應切割其中的靶序列〕，那么擴增效果更好。PCR引物設計的幾條原那么：①引物長度一般引物長度為18-30堿基就足夠了。特殊情況下〔比方Tm值或GC含量不適宜〕可以進一步延長到50-60bp長度。但超過60bp的引物長度比較少見。原因一是超過60bp長度的引物比較難以合成，因此合成價格大幅度增加。另外長引物在合成的時候出錯率也顯著增加。上下游引物的長度應該根本相等，最好相差不要超過3bp。2.堿基組成G＋C含量應在40％到60％之間，4種堿基要在引物中分配均勻。假設是引物存在嚴重的GC傾向或AT傾向那么可以在引物5’端加適量的A、T或G、C尾巴。3.重復和自身互補序列不能有大于3bp的重復序列或自身互補序列存在。這種序列可形成發(fā)夾結構，如果這種結構在PCR條件下穩(wěn)定，它會非常有效地阻止寡聚核苷酸和靶DNA之間的復性。4．上下游引物的互補性一個引物的3‘端不允許結合到另一個引物的任何位點上。因為在PCR中引物的濃度往往是比較高，所以即使引物間微弱的互補，都會導致引物間形成雜交，隨后是引物二聚體的形成和擴增。如果引物二聚體在PCR早期形成，它將和DNA聚合酶、引物及核苷酸競爭進而抑制靶DNA的擴增。精心進行引物設計，應用熱啟動PCR或降落PCR或特制的DNA聚合酶〔如：AmpliGold，Perkin－Elmer〕都可以防止引物二聚體的形成。當在一個PCR中應用多對引物時，請注意檢查任何一個3’末端都不能和其他任何引物互補。5.解鏈溫度〔Tm〕解鏈溫度〔Tm〕：也稱熔化溫度。計算出來的兩個引物的Tm值相差不能大于5C。擴增產物的Tm值與引物的Tm值相差不能大于10C。這些特性保證了擴增產物在每個PCR循環(huán)可有效地變性。為什么要計算引物的解鏈溫度解鏈溫度的計算方法6.3‘末端

3’末端的性質非常關鍵。如果可能的話，每個引物的3‘末端堿基應為G或C，不能為A。然而，并不推薦使用3’端有NNCG或NNGC序列的引物，因為末端GC堿基高的自由能可以促進發(fā)夾結構的形成，還可能產生引物二聚體。7．向引物的5‘端添加限制性酶切位點，噬菌體啟動子等序列有用而又不與靶DNA序列互補的序列一般加到引物的5’末端。一般來說，這些序列的存在不會顯著地影響寡核苷酸和靶DNA之間的復性。這些附加序列包括噬菌體啟動子和GC夾子。限制性酶切位點是一個特殊情況。因為位于DNA分子5‘末端的限制性酶切位點的切割效率比較低，所以引物應當超出限制性內切酶識別位點至少3個核苷酸。保護堿基確實定保護堿基確實定不是隨意的，通常每一種限制性內切酶都有自己最正確的保護堿基。每一種限制性內切酶與其對應的最正確保護堿基請到NEB公司網站或互聯(lián)網上查詢。8.引導位點的設置根據實驗的不同目的，引導位點的設置可能會受到突變位點、限制性內切酶位點、編碼序列、微衛(wèi)星序列和順式作用元件的影響。當針對cDNA模板設計引物時，正向和反向引物最好結合到不同外顯子的不同區(qū)域。這些可以很容易地把來源于cDNA的擴增產物和來源于污染的基因組DNA的擴增產物區(qū)分開。PCR設計軟件推薦PrimerPremier5WDNASISOligo7

PCR高保真酶推薦PE公司〔ABI〕Parken－ElmerDNA聚合酶，TakaRa公司的PrimeSTARHSPolymerase，ToYoBo公司的Kod－PlusPolymerase。PCR產物的克隆

在許多研究中,需要將PCR產物克隆,以獲得目的DNA片段。此時,所用PCR循環(huán)數應盡量小,以減少平臺效應或非特異性擴增產物的干擾。通常將PCR產物插入到載體中有以下一些方法。1.平末端連接：由于TaqDNA聚合酶往往在PCR產物3'端加上多余的非模板依賴堿基,在用平末端連接克隆PCR產物前,可用Klenow片段或T4DNA聚合酶處理補平末端。2.在PCR產物克隆載體尾部加dT或ddT：TaqDNA聚合酶會在3'端加上多余的非模板依賴堿基,而且對A優(yōu)先聚合,所以PCR產物末端的多余堿基大局部都是A.。利用這一特點,可以經限制酶切割產生的平末端用酶加上dT或ddT,使載體與PCR產物末端互補并進行連接.載體末端加dT尾可直接用TaqDNA聚合酶和dTTP或ddTTP,ddTTP因缺少3-OH而不能再形成磷酸二酯鍵,保證在載體3'端只加上一個ddTTP,而其5'端所含的磷酸基團可與PCR產物的3'端OH連接,連接產物在載體和PCR產物之間的雙鏈上帶兩個切口,這種重組DNA仍可轉化適宜的受體菌,并在細菌體內修復.目前很多公司已開發(fā)出可直接用于克隆PCR產物的帶3'-T的T-Vector。3.粘性末端連接：利用引物中附加在5'端的限制酶位點,直接將PCR產物經適當的限制酶切割后產生粘性末端,與載體連接,產生重組DNA.如果下游兩個引物中含有兩個不同的限制酶位點.經酶切后可定向克隆到載體中。PCR反響有哪些關鍵環(huán)節(jié)？①模板核酸的制備，②引物的質量與特異性，③酶的質量④PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應針對上述環(huán)節(jié)進行分析研究。

模板最容易出現的問題一、模板含有雜質：①模板中含有雜蛋白質；②模板中含有Taq酶抑制劑；③模板中蛋白質沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白；④在提取制備模板時喪失過多，或吸入酚；⑤模板核酸變性不徹底。在酶和引物質量好時，不出現擴增帶，極有可能是標本的消化處理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應固定,不宜隨意更改。

二、模板發(fā)生變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會成功的。通常模板發(fā)生變異的主要原因是模板切膠回收時間過長〔一般應控制在1分鐘以內〕或無意中將模板置于超凈工作臺中滅菌所致。

PCR引物常見的問題引物：引物質量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為：①選定一個好的引物合成單位。②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現，而且兩引物帶的亮度應大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。③引物應高濃度小量分裝保存，防止屢次凍融或長期放冰箱冷藏，導致引物變質降解失效。④引物設計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。

DNA聚合酶的問題酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導致假陰性。需注意的是有時PCR失敗是由于忘加了酶。

Mg2+濃度Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴增的特異性，濃度過低那么影響PCR擴增產量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。對于一些難以擴增的模板，建議買PCRBuffer中Mg2+free的PCR試劑，以便自己通過一些預實驗找出PCR反響中最正確的Mg2+濃度。

PCR反響體積通常進行PCR擴增采用的體積為20ul、30ul、50ul。或100ul，應用多大體積進行PCR擴增，是根據科研和臨床檢測不同目的而設定，在做小體積如20ul后，再做大體積時，一定要模索條件，否那么容易失敗。如果不愿重新摸索條件，一個最簡單可行的方法是按照小體積的條件多做幾管，最后將PCR產物聚集在一起。

另外，PCR管有普通管和薄壁管〔thinwallPCRtubes〕之分。普通管和薄壁管的熱傳導效率是不同的。熱蓋與非熱蓋PCR儀早期的PCR儀均為非熱蓋，因此每個PCR反響管中需要參加無菌石蠟油，以防止溶液的蒸發(fā)。現在的PCR儀大局部都有熱蓋〔及頂部加熱器〕，會阻止溶液的蒸發(fā)，因此PCR反響管中不需參加石蠟油了。

PCR出現假陽性的原因？

假陽性：出現的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。出現假陽性的原因主要有：

〔1〕引物設計不適宜：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增時，擴增出的PCR產物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現假陽性。需重新設計引物。

〔2〕靶序列或擴增產物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉污染，導致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質外，所有試劑或器材均應高壓消毒。所用離心管及樣進槍頭等均應一次性使用。必要時，在加標本前，反響管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性?？苫ハ嗥唇樱c引物互補后，可擴增出PCR產物，而導致假陽性的產生，這種污染可以通過更換實驗場地來解決，有時也可用巢式PCR方法來減輕或消除。

非特異性擴增帶出現的原因非特異性擴增帶出現的對策〔一〕非特異性擴增帶出現的對策〔二〕采用熱啟動PCR：把PCR混合物在顯著低于Tm值的溫度下作哪怕短暫的保溫，也可能產生引物二聚體和非特異性配對。熱啟動PCR那么可以大大減少這些麻煩。其目標是在第一個循環(huán)中等溫度升到超過反響物的Tm值后才允許反響中的一兩種關鍵成分進入反響。例如在覆蓋有礦物油的小試驗中，所有反響管的一種公共成分〔如Taq酶〕可以先不加，而到第一個循環(huán)的變性階段溫度超過80℃以后再加。最近有一種熱啟動的方法是在參加TaqDNA聚合酶前先在管中參加其單克隆抗體〔Clonetech公司的TaqStartAntibody，或者ToYoBo公司的KodPlusDNA聚合酶〕，在溫度升高到將中和抗體變性失活之前，抗體阻遏聚合酶的活性，防止反響開始。非特異性擴增帶出現的對策〔三〕嵌套式和半嵌套式PCR對于減少或消除不需要的產物同時提高靈敏度經常是很成功的。首先在常規(guī)條件下用第一套跨越目的DNA片段的引物擴增，假象產物經常會與引物中的一條或兩條配對，但其內部卻是無關序列。接著對一局部反響物－產物混合物進行新一輪擴增，采用的引物與第一對引物內側的序列配對，在這一輪擴增中只有真正的產物被擴增。這種方法即使在目的產物開始用EB染色檢測不到而且有假象帶時也常常獲得成功。半嵌套式PCR，只第二條引物在目的片段一端的內側，也同樣有效。在基因步行或企圖進行5‘或3’端RACE時，由于只有一條引物內部的序列是的，經常需要作這種變動。采用嵌套式PCR方法，第一、二輪擴增在第20個循環(huán)左右終止而不是象通常的在第30－35個循環(huán)終止會獲得更好的結果，這樣做減少了產生不需要的高分子量帶和成片產物的