免疫共沉淀講課教案

免疫共沉淀揚州大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。其原理是：當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來。如果用蛋白質(zhì)x的抗體免疫沉淀x，那么與x在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)y也能沉淀下來。這種方法常用于測定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合；也可用于確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔。原理優(yōu)點相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的，處于天然狀態(tài)；蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進(jìn)行的，可以避免人為的影響；可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復(fù)合物。缺點可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合，而可能有第三者在中間起橋梁作用；如用westernblot檢驗，必須在實驗前預(yù)測目的蛋白是什么，以選擇最后檢測的抗體，若預(yù)測不正確，實驗就得不到結(jié)果。Co-IP工作示意圖Co-immunoprecipitationbindingwashelutionYYYYY利用westernblot確定捕獲蛋白通過質(zhì)譜確定捕獲的蛋白收獲細(xì)胞，加入適量細(xì)胞裂解緩沖液（含蛋白酶抑制劑），冰上裂解30min,細(xì)胞裂解液于4°c，最大轉(zhuǎn)速離心30min后取上清；取少量裂解液以備westernblot分析，剩余裂解液加1μg相應(yīng)的抗體加入到細(xì)胞裂解液，4°c緩慢搖晃孵育過夜；取10μlproteina瓊脂糖珠，用適量裂解緩沖液洗3次，每次3,000rpm離心3min；將預(yù)處理過的10μlproteina瓊脂糖珠加入到和抗體孵育過夜的細(xì)胞裂解液中4°c緩慢搖晃孵育2-4h，使抗體與proteina瓊脂糖珠偶連；免疫沉淀反應(yīng)后，在4°c以3,000rpm速度離心3min，將瓊脂糖珠離心至管底；將上清小心吸去，瓊脂糖珠用1ml裂解緩沖液洗3－4次；最后加入15μl的2×sds上樣緩沖液，沸水煮5分鐘；sds,westernblotting或質(zhì)譜儀分析。實驗步驟實驗注意事項（1）細(xì)胞裂解采用溫和的裂解條件，不能破壞細(xì)胞內(nèi)存在的所有蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用，多采用非離子變性劑（np40或tritonx-100)。每種細(xì)胞的裂解條件是不一樣的，通過經(jīng)驗確定。不能用高濃度的變性劑（0.2sds)，細(xì)胞裂解液中要加各種酶抑制劑，如商品化的cocktailer。（2）使用明確的抗體，可以將幾種抗體共同使用（3）使用對照抗體：單克隆抗體：正常小鼠的igg或另一類單抗兔多克隆抗體：正常兔igg(4)確保共沉淀的蛋白是由所加入的抗體沉淀得到的，而并非外源非特異蛋白，單克隆抗體的使用有助于避免污染的發(fā)生；(5)要確?？贵w的特異性，即在不表達(dá)抗原的細(xì)胞溶解物中添加抗體后