DB4403-T 122-2020 人源腫瘤細胞系建立技術規(guī)范

ICS07.080

CCSC04

DB4403

深圳市地方標準

DB4403/T122—2020

人源腫瘤細胞系建立技術規(guī)范

Technicalspecificationforestablishmentofhumantumorcelllines

2020-11-23發(fā)布2020-12-01實施

深圳市市場監(jiān)督管理局發(fā)布

DB4403/T122—2020

人源腫瘤細胞系建立技術規(guī)范

1范圍

本文件確立了人源腫瘤細胞系建立過程中樣本獲取、細胞建系以及質(zhì)量檢測的操作程序和一般原

則。

本文件適用于人源實體腫瘤細胞系相關研究。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB18467獻血者健康檢查要求

YY/T0588流式細胞儀

SZDB/Z238短串聯(lián)重復序列基因分型法鑒定人源細胞系技術規(guī)范

ISCN2013人類細胞遺傳學國際命名體制

ASN—0003—2015基于線粒體細胞色素氧化酶亞基1（CO1）DNA條形碼鑒定動物細胞種屬(Species

—LevelIdentificationofAnimalCellsthroughMitochondrialCytochromeOxidaseSubunit1(CO1)

DNABarcodes）

3術語和定義

下列術語和定義適用于本文件。

3.1

供體donor

提供腫瘤樣本的捐贈者。

3.2

原代細胞primarycell

直接由獲取的人體組織或器官制備形成的細胞。

3.3

細胞系cellline

由原代細胞群經(jīng)傳代培養(yǎng)獲得的細胞群。該細胞群通常是非均質(zhì)的，且具有明確的特性，可供建庫

用。

1

DB4403/T122—2020

3.4

實體瘤solidtumor

機體在各種致瘤因素作用下，局部組織的細胞在基因水平上失去對其生長的正常調(diào)控，導致異常增

生而形成的新生物。

3.5

平衡鹽溶液balancedsaltsolution

組織細胞培養(yǎng)時常用的基本液體，可以維持細胞的滲透壓、調(diào)節(jié)pH值以及提供細胞生存所需的無機

離子成分。

注：常用于細胞、組織的洗滌。

3.6

密度梯度離心densitygradientcentrifugation

用一定的介質(zhì)（如氯化銫、蔗糖和多聚蔗糖）在離心管內(nèi)形成連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細胞混

懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過重力或離心力場的作用使細胞分層、分離的方法。

3.7

倍增時間doublingtime

在細胞培養(yǎng)過程中，對數(shù)期中細胞數(shù)量增加一倍所需的時間。

3.8

成瘤性tumorigenicity

細胞接種動物后在注射部位和（或）轉(zhuǎn)移部位由接種細胞本身形成腫瘤能力。

3.9

染色體chromosome

遺傳信息的載體，由DNA、RNA和蛋白質(zhì)構(gòu)成的，其形態(tài)和數(shù)目具有種系的特性。

注：在細胞間期核中，以染色質(zhì)絲形式存在。在細胞分裂時，染色質(zhì)絲經(jīng)過螺旋化、折疊、包裝成為染色體，為

顯微鏡下可見的具不同形狀的小體。

3.10

同工酶分析isoenzymeanalysis

具有相似或相同特異性的酶，利用瓊脂糖凝膠電泳技術，研究細胞裂解過程中同工酶的遷移規(guī)律，

以獲得具有物種特異性的同功酶譜的過程。

3.11

核型分析karyotypeanalysis

2

DB4403/T122—2020

將待測細胞的染色體按照固有的染色體形態(tài)特征和規(guī)定，進行配對、編號和分組，并進行形態(tài)分析

的過程。

3.12

聚合酶鏈式反應polymerasechainreaction

通過DNA互補雙鏈解鏈、退火和聚合延伸的多次循環(huán)來擴增DNA特定序列的方法。

3.13

流式細胞術flowcytometry

對懸液中的單細胞或其他生物粒子，通過檢測標記的熒光信號，實現(xiàn)高速、逐一的細胞定量分析和

分選的技術。

3.14

免疫熒光技術immunofluorescencetechnique

將免疫學方法(抗原抗體特異結(jié)合)與熒光標記技術結(jié)合起來研究特異蛋白抗原在細胞分布的方法。

3.15

細胞半數(shù)致瘤量50%tumorproducingdose

能使50%動物產(chǎn)生腫瘤的最低移植細胞量。

4縮略語

下列縮略語適用于本文件。

BPV：牛細小病毒（Bovineparvovirus）

CMV：巨細胞病毒（Cytomegalovirus）

DMSO：二甲基亞砜(DimethylSulfoxide)

DNA：脫氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid）

EBV：人類皰疹病毒四型（Epstein—Barrvirus）

EDTA：乙二胺四乙酸（EthylenediaminetetraaceticAcid）

HBV：乙型肝炎病毒（HepatitisBVirus）

HCV：丙型肝炎病毒（HepatitisCVirus）

HIV：人類免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiencyVirus）

HTLV：人類嗜T細胞病毒（HumanT—lymphotropicVirus）

PBS：磷酸鹽緩沖溶液（PhosphateBufferSaline）

PCR：聚合酶鏈式反應（PolymeraseChainReaction）

PPV：豬細小病毒（PorcineParvovirus）

RNA：核糖核酸（RibonucleicAcid）

5樣本獲取

5.1倫理審批和知情同意

3

DB4403/T122—2020

5.1.1樣本采集前應進行相應的準備工作，嚴格設計樣本采集方案，并按照樣本采集方的倫理審查要

求對方案的生物安全、倫理以及科學性進行審查。

5.1.2樣本采集應遵循“知情同意、自愿”的原則。工作人員（包括醫(yī)生、樣本操作技術人員等）應

與捐贈者溝通，詳細講解項目背景、意義，采集的樣本量、用途、潛在風險以及捐贈的權利、義務

等，獲得捐贈者或者其法定代理人的知情同意。

5.2信息收集

5.2.1樣本采集前應收集捐贈者信息，包括但不限于姓名、年齡、性別、住院號、病歷號等基本信息

及既往病史、家族史、用藥史、過敏史等臨床信息。捐獻者基本信息表參見附錄A。

5.2.2樣本采集后應詳細記錄所采集的腫瘤樣本信息，包括但不限于樣本的采集時間、編號、大小、

數(shù)量、采集人員等。腫瘤樣本信息表見附錄B。

5.2.3應建立嚴格有效的樣本捐獻者信息保護制度，對捐獻者健康信息的隱私權加以保護。

5.3供體篩選

5.3.1用于腫瘤細胞分離培養(yǎng)的組織應進行篩選，宜排除下列情況的供體：

——病理類型為混合型；

——人源特定病毒檢測結(jié)果不符合GB18467的規(guī)定；

——有精神障礙；

——伴有其他免疫性疾病，或長期應用免疫抑制劑或激素；

——醫(yī)生認為其他不適合情況。

5.4樣本采集前準備

5.4.1采集前應對樣本進行編碼，打印合適數(shù)量不易脫落、標注清晰的標簽。仔細核對捐贈者信息，

確定無誤后將標簽粘貼在無菌的樣本采集容器上。

5.4.2采集前應先準備所需的儀器、試劑和耗材，并確認儀器可以正常使用。主要儀器耗材列表見附

錄C。

5.5樣本采集

5.5.1實體瘤樣本

5.5.1.1樣本應首先滿足捐贈者的診斷和治療需求，剩余樣本才能用于建立腫瘤細胞系。

5.5.1.2應采集具有典型生物學特征的腫瘤組織、癌旁組織和正常組織，實體瘤樣本的直徑宜不低于

5mm。

5.5.2胸腹水樣本

當胸腹水樣本中存在較多腫瘤細胞時，可在無菌條件下抽取胸腹水，采集量宜不低于20mL。

5.6樣本保存與運輸

5.6.1實體瘤樣本應保存于含400IU/mL抗生素的培養(yǎng)基中。胸腹水樣本可直接收集至樣本保存瓶。

5.6.2實體瘤樣本保存和運輸時間應不超過12h，運輸溫度4℃～10℃。胸腹水樣本處理保存與運輸

時間應不超過2h。

6細胞建系

4

DB4403/T122—2020

6.1細胞分離

6.1.1總則

實體瘤樣本宜選擇組織塊法或酶消化法進行原代細胞分離。

6.1.2組織塊法

6.1.2.1充分去除血液、脂肪、神經(jīng)組織及壞死組織，加入4℃平衡鹽溶液清洗腫瘤組織。

6.1.2.2宜采用無菌眼科剪將腫瘤組織切成1mm3～2mm3大小的組織塊。

6.1.2.3將約20個組織塊轉(zhuǎn)移至T25細胞培養(yǎng)瓶中，輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶使其底部朝上，置于37℃、5%

濃度二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h～4h。

6.1.2.4將培養(yǎng)瓶輕輕平放，加入完全培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

6.1.3酶消化法

6.1.3.1充分去除血液、脂肪、神經(jīng)組織及壞死組織，加入4℃平衡鹽溶液清洗腫瘤組織。

6.1.3.2采用無菌眼科剪將腫瘤組織切成1mm3～2mm3大小的組織塊。

6.1.3.3加入1mL～3mL0.25%胰蛋白酶或200IU/mL膠原蛋白酶，37℃水浴震蕩消化0.5h～1h，或

4℃過夜消化。

6.1.3.4加入3mL～5mL完全培養(yǎng)基終止消化，采用孔徑100μm的細胞篩網(wǎng)過濾，收集細胞懸液并

計數(shù)。

6.1.3.5以4℃，200g～300g的轉(zhuǎn)速離心5min～10min后，除去上層清液，加入適量完全培養(yǎng)基，

調(diào)整細胞密度至0.5～1×106/mL，接種至培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5%濃度二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)。

6.1.4胸腹水樣本宜采用直接離心法，以4℃，300g～500g的轉(zhuǎn)速離心5min～10min，收集腫瘤細

胞后直接進行培養(yǎng)。

6.2細胞培養(yǎng)

6.2.1腫瘤細胞培養(yǎng)初期，培養(yǎng)瓶應輕拿輕放，避免組織塊和細胞脫落。

6.2.2細胞培養(yǎng)12h～72h，待細胞貼壁后進行首次換液，去除脫落的組織塊和未貼壁細胞。

6.2.3每隔2天～3天換液，通過顯微鏡觀察記錄細胞生長狀態(tài)。待細胞融合度達到80%以上時，可進

行細胞純化和傳代。

6.3細胞純化

6.3.1腫瘤細胞的純化宜采用機械刮除法、反復貼壁法、消化排除法、密度梯度離心法中的一種或多

種方法聯(lián)合。

6.3.2機械刮除法

6.3.2.1顯微鏡下觀察細胞，采用標記筆在培養(yǎng)瓶背面標記具有典型生物學特征的腫瘤細胞生長區(qū)域。

6.3.2.2棄掉培養(yǎng)液，顯微鏡下采用無菌細胞刮刮除無標記區(qū)域的雜細胞；采用平衡鹽溶液清洗雜細

胞，加入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

6.3.3反復貼壁法

6.3.3.1參考附錄D細胞的傳代操作流程中的步驟E.3.1—E.3.6收集細胞，接種至新的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)

5min～20min。

5

DB4403/T122—2020

6.3.3.2收集未貼壁的腫瘤細胞懸液，接種至新的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)5min～20min。

6.3.3.3重復步驟6.3.3.21次～3次，收集最后一次腫瘤細胞懸液，接種至新培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

6.3.4消化排除法

6.3.4.1針對不同類型的細胞，采用50IU/mL～200IU/mL不同亞型的膠原酶或0.05%～0.25%的胰蛋

白酶對細胞進行消化處理，顯微鏡下觀察，待雜細胞脫落后終止消化。

6.3.4.2采用平衡鹽溶液清洗處理后，更換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，若雜細胞未被除凈，宜再次重復處

理。

6.3.5密度梯度離心法

6.3.5.1宜參考6.3.3.1步驟收集細胞，加入至比重1.025～1.085的細胞分離液中，以20℃，800g

的轉(zhuǎn)速離心10min。

6.3.5.2離心后收集比重1.050～1.085的腫瘤細胞層，清洗2次～3次后，加入完全培養(yǎng)基重懸細胞，

接種至新培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

6.4細胞傳代

腫瘤細胞系傳代參見附錄D。

6.5細胞凍存

6.5.1細胞數(shù)目達到5×107～1×108后，進行細胞收集和計數(shù)（參見附錄D的步驟D.3.1～D.3.7）。

6.5.2加入含10%～15%二甲基亞砜(DMSO)的完全培養(yǎng)基，調(diào)整細胞密度至1×106/mL～1×107/mL。

6.5.3將腫瘤細胞按1mL/管分裝至細胞凍存管中，管壁粘貼唯一編碼標簽。

6.5.4凍存管宜放入程序降溫盒中，置于-80℃冰箱過夜。亦或遵循程序降溫原則采用程序降溫儀將

細胞梯度降溫至-80℃。亦或?qū)⒓毎糜诤賰霰４嬉旱奈⒚毠苤?，直接放置于液氮保存。降溫?/p>

成后應轉(zhuǎn)移細胞至液氮中長期存儲。

7質(zhì)量檢測

7.1生物學屬性檢測

7.1.1細胞鑒別

7.1.1.1種屬鑒定

宜采用脫氧核糖核酸（DNA）條形碼分析或同工酶法。DNA條形碼分析宜參考ASN—0003—2015，同

工酶法檢測參見附錄E。

7.1.1.2細胞系特性鑒定

按照SZDB/Z238對細胞系間特性進行鑒定。

7.1.1.3細胞專屬特性

宜采用各腫瘤細胞系特異性的標記物，通過流式細胞術進行檢測，常見腫瘤細胞系特異性標記物列

表見附錄F。細胞流式分析前處理宜依據(jù)特異性抗體說明書進行，流式細胞儀操作宜參考YY/T0588。

7.1.2細胞存活率

6

DB4403/T122—2020

7.1.2.1細胞存活率宜采用臺盼藍染色法，通過手動計數(shù)或自動細胞計數(shù)儀進行檢測。手動計數(shù)檢測

細胞存活率宜參考附錄G，自動計數(shù)儀檢測細胞存活率宜依據(jù)儀器檢測說明書進行。

7.1.2.2腫瘤細胞系凍存前的存活率應不低于90%。復蘇后的細胞存活率應不低于80%。

7.1.3細胞純度

細胞純度可采用流式細胞術或細胞免疫熒光染色法，通過檢測細胞特異性標記物的陽性表達率進行

檢測。流式細胞術檢測操作宜參考YY/T0588；細胞免疫熒光檢測操作宜依據(jù)熒光抗體使用說明書進行。

腫瘤細胞系任意單個標記物陽性率應不低于90%，任意雙標記物共陽性率應不低于80%。

7.1.4倍增時間

7.1.4.1新建腫瘤細胞系宜進行細胞倍增時間檢測。

7.1.4.2細胞倍增時間宜參考《中華人民共和國藥典（三部）》（2020年版）“生物制品生產(chǎn)檢定用

動物細胞基質(zhì)制備及質(zhì)量控制”關于群體倍增水平計算的規(guī)定進行檢測，并記錄于細胞生物學特征檔

案。

7.1.5凝集試驗

腫瘤細胞系凝集試驗宜參考附錄H。

7.1.6染色體核型分析

宜依據(jù)ISCN2013建立的G顯帶法或Q顯帶法對細胞染色體進行分析和描述，并記錄于細胞生物學特

征檔案。

7.1.7成瘤性試驗

7.1.7.1新建細胞系應進行成瘤性檢測。

7.1.7.2成瘤性檢測宜依據(jù)《中華人民共和國藥典（三部）》（2020年版）生物制品通則4實施。

7.1.7.3對檢測后具有成瘤性的腫瘤細胞，需釆用定量的方法進一步分析細胞成瘤性的大小，并計算

該細胞的半數(shù)致瘤量(TPD50)。

7.2安全性檢測

7.2.1無菌檢測

7.2.1.1細胞系在凍存前應進行無菌檢測。

7.2.1.2無菌檢測可依據(jù)《中華人民共和國藥典（三部）》（2020年版）通則1101中規(guī)定的方法實

施。

7.2.1.3腫瘤細胞系的無菌檢測結(jié)果應為陰性。

7.2.2支原體檢測

7.2.2.1細胞系在凍存前應進行支原體檢測。

7.2.2.2宜采用經(jīng)批準的基于聚合酶鏈式反應（PCR）擴增原理的支原體檢測試劑盒，按照說明書對腫

瘤細胞系進行支原體檢測。

7.2.2.3細胞系的支原體檢測結(jié)果應為陰性。

7.2.3內(nèi)、外源病毒因子檢測

7

DB4403/T122—2020

7.2.3.1使用含牛源和豬源生物制品而新建的細胞系應進行人類EBV、HBV、HCV、HIV—1、HIV—2、

HTLV—1、HTLV—2、CMV、PPV和BPV的檢測。

7.2.3.2宜依據(jù)《中華人民共和國藥典（三部）》（2020年版）通則3306對人源病毒因子HIV—1/2、

HBV、HCV進行檢測；宜采用經(jīng)批準的基于酶聯(lián)免疫法檢測的酶聯(lián)免疫試劑盒對HTLV—1/2、EBV、CMV

進行檢測。

7.2.3.3宜采用經(jīng)批準的基于酶聯(lián)免疫法檢測的酶聯(lián)免疫試劑盒對豬細小病毒或牛細小病毒進行檢

測。

7.2.3.4除特殊研究要求外（如研究材料即為攜帶致病因子的細胞），細胞系內(nèi)與外源病毒因子檢測

應均為陰性。A

8

DB4403/T122—2020

BA

附錄A

（資料性）

捐贈者基本信息表

表A.1給出了捐贈者基本信息表。

表A.1捐贈者基本信息表

姓名：住院登記號：病理號：

年齡：性別：

聯(lián)系地址：

聯(lián)系電話：郵編：

吸煙史（年）：吸煙（支/日）：

飲白酒史（年）：飲白酒（兩/日）：

病史：藥物過敏史：

家族疾病史：用藥史：

簡要病情及手術原因介紹:

術前治療：

手術名稱：

手術時間：年月日時分

切除部位：組織切除量：

手術情況記錄：

手術醫(yī)生簽名：隨同手術人員簽名：

家屬確認簽名：日期：年月日時

病理描述及拍照（附照片）：

病理醫(yī)生簽名：日期：年月日時分

組織樣本交接情況：

交接人：日期：年月日

9

DB4403/T122—2020

CB

附錄B

（資料性）

腫瘤樣本信息表

表B.1給出了腫瘤樣本信息表。

表B.1腫瘤樣本信息表

捐贈者基本信息

捐贈者姓名捐贈者ID

性別口男口女出生日期

樣本收集與處理信息

樣本類型樣本編號

采樣日期樣本采集人員

樣本采集量

處理方法（溫度、操作）：

處理開始時間處理完成時間

樣本信息

樣本編碼腫瘤類型（T或N）取材數(shù)量組織質(zhì)量(A或B或C)

運輸保存

保存條件保存溫度

運輸方式運輸時間

備注

注1：捐贈者ID以腫瘤類別（兩位數(shù)）+年份（四位數(shù)）+流水號（四位數(shù)）+組成樣本編碼。

注2：樣本類型，根據(jù)NIH的病例檢索標準進行填寫。

注3：腫瘤類型，用T和N代表腫瘤及正常，T及N后面的數(shù)字表示取材份數(shù)。

注4：組織質(zhì)量用A、B、C表示（A＝無明顯壞死、B＝散在壞死、鈣化，C＝大量壞死）。

10

DB4403/T122—2020

DC

附錄C

（資料性）

主要儀器耗材列表

C.1主要儀器

表C.1給出了主要儀器列表。

表C.1主要儀器列表

階段儀器名稱用途

低溫標簽制作套裝打印標簽

樣本采集

冷藏冰箱（2℃～8℃）樣本暫存

冷藏冰箱（2℃～8℃）樣本暫存

低溫標簽制作套裝制作標簽

條碼掃描器掃描條碼

冷凍離心機（-20℃～40℃；最高離心力達

細胞建系樣本離心

15000g以上）

生物安全柜操作平臺

移液器（10μL、100μL、1000μL）細胞處理與轉(zhuǎn)移

凍存架放置凍存盒

細胞凍存-80℃冰箱部分樣本儲存

液氮罐部分樣本儲存

C.2主要耗材

表C.2給出了主要耗材列表。

表C.2主要耗材列表

階段耗材名稱用途

無菌醫(yī)用手套（無粉）個人防護

棉簽消毒

采血管采血容器

采血針穿刺

眼科剪組織樣本剪碎

樣本采集

組織剪組織樣本分離

組織鑷組織樣本分離

醫(yī)用無菌注射器胸腹水的抽取

手術刀組織切除

標簽樣本標識

11

DB4403/T122—2020

表C.2（續(xù)）

階段耗材名稱用途

樣本采集醫(yī)用口罩個人防護

離心管樣本細胞的收集

移液管細胞懸液及培養(yǎng)液的轉(zhuǎn)移

培養(yǎng)瓶細胞培養(yǎng)

細胞建系

細胞刮細胞的刮除和純化

眼科剪組織樣本剪碎

組織鑷組織樣本分離

凍存管儲存樣本

細胞凍存凍存盒放置凍存管

程序降溫盒樣本的程序性降溫

12

DB4403/T122—2020

ED

附錄D

（資料性）

細胞傳代操作流程

D.1儀器

倒置熒光顯微鏡、二氧化碳培養(yǎng)箱（溫度：5℃～65℃，容積不小于80L）、離心機（溫度：-20℃～

40℃，最高離心力達15000g以上）、生物安全柜、細胞計數(shù)儀、移液槍（10μL，100μL，1000μL）。

D.2試劑耗材

底面積75cm2的細胞培養(yǎng)瓶、細胞培養(yǎng)基、胎牛血清、青/鏈霉素、胰蛋白酶、平衡鹽溶液、離心管、

移液管、75%酒精、無塵布、棉球、封口膜、廢液缸。

D.3貼壁細胞工作程序

D.3.1用50mL離心管，收集細胞培養(yǎng)液，并用平衡鹽溶液清洗細胞1～2次，以免剩余培養(yǎng)液影響胰

蛋白酶活性。

D.3.2向瓶內(nèi)加入1mL消化液（含0.05%～0.25%Trypsin—EDTA），置于37℃下進行消化1min～3mi

n，消化期后把培養(yǎng)瓶放在倒置顯微鏡下進行觀察，當發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮、細胞間隙增大后，立即終止消

化。

D.3.3向細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)用移液管加入等體積的收集的細胞培養(yǎng)液，混勻終止消化。

D.3.4使用吸管，吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液，按順序反復輕輕吹打瓶壁細胞，使之從瓶壁脫離形成細胞懸液。

D.3.5用吸管轉(zhuǎn)移細胞懸液至離心管中，以300g～500g轉(zhuǎn)速離心5min。

D.3.6去掉細胞上清液，加入適量平衡鹽溶液清洗細胞2～3次，采用臺盼藍染色進行細胞計數(shù)和檢

活。

D.3.7去掉細胞上清液，在離心管中加入3mL完全培養(yǎng)液，并反復吹打細胞，制成細胞懸液。

D.3.8調(diào)整細胞密度，按照5000/cm2～6000/cm2密度接種細胞至細胞培養(yǎng)瓶，于37℃，5%濃度二氧

化碳培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

D.3.9根據(jù)細胞生長的狀態(tài)進行換液。一般2～3天后應換一次培養(yǎng)液。待細胞長至85%以上融合度，

可繼續(xù)傳代擴大培養(yǎng)。

13

DB4403/T122—2020

FE

附錄E

（資料性）

同工酶分析操作流程

E.1儀器

二氧化碳培養(yǎng)箱（溫度：5℃～65℃，容積不小于80L）、高速冷凍離心機（溫度：-20℃～40℃；

最高離心力達15000g以上）、生物安全柜、細胞計數(shù)儀、凝膠電泳槽、漩渦混勻儀、多層濾紙、割膠

器、電子天平（0.1mg～220g）、4℃冰箱、pH計（分辨率：0.001pH；玻璃電極）、微波爐、多用電

泳儀（10V～300V）。

E.2試劑配制

E.2.1細胞裂解液

Tris0.303g，乙二胺四乙酸（EDTA）0.0186g，質(zhì)量分數(shù)2%TritonX—100，加水定容至50mL，

鹽酸（HCl）調(diào)pH至7.5，4℃保存。

E.2.2巴比妥緩沖液

巴比妥鈉10.3g，巴比妥1.84g，加水定容至1000mL，4℃保存。

E.2.3乳酸脫氫酶（LDH）顯色底物

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）5mg，噻唑藍溴化四唑（MTT）2mg，吩嗪硫酸甲酯（PMS）0.4mg，

1mol/L乳酸鈉1mL，0.1mol/L氯化鈉（NaCl）0.5mL，0.5mol/L的三羥甲基氨基甲烷—鹽酸（Tris—

HCl）（pH8.0）1.5mL，加水定容至10mL。

E.2.4葡萄糖—6—磷酸脫氫酶（G6PD）顯色底物

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP）3mg，噻唑藍溴化四唑（MTT）2mg，吩嗪硫酸甲酯（PMS）0.4

mg，葡萄糖—6—磷酸脫氫酶(G6PD)50mg，氯化鎂（MgCL2）10mg，0.5mol/L的三羥甲基氨基甲烷—鹽

酸（Tris—HCl）（pH8.0）2mL，加水定容10mL。

E.2.5核苷酸磷酸脫氫酶（NP）顯色底物

肌苷20mg，MTT2mg，PMS0.4mg，黃嘌呤氧化酶0.3unit，0.1mol/LNa2HPO41mL，0.5mol/LTris

—HC1（pH7.5）1mL，加水定容至10mL。

E.2.6瓊脂糖凝膠

瓊脂糖0.8g，EDTA0.035g，巴比妥緩沖液100mL加熱溶化。

E.3檢測程序

E.3.1細胞同工酶的提取

14

DB4403/T122—2020

E.3.1.1將待檢腫瘤細胞系、人源標準參考細胞系分別在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，當生長至鋪滿瓶底時，吸出

培養(yǎng)基。

E.3.1.2采用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）清洗細胞單層，加1mL胰蛋白酶，37℃溫箱消化至細胞脫壁，加

2mL含10％小牛血清的細胞培養(yǎng)基終止胰蛋白酶的作用，并將其轉(zhuǎn)移至無菌離心管。

E.3.1.3300g離心10min，棄去上清，加1mLPBS吹打均勻，快速離心，吸干殘留PBS。

E.3.1.4估算細胞的體積，加等體積的細胞裂解液，室溫反應2min～3min，冰上反應30min，4℃，

5000g～8000g離心5min，吸出上清移至新的EP管，-20℃保存。

E.3.2瓊脂糖凝膠制備

E.3.2.1將2片0.175mm厚的市售透明膠片夾在兩塊膠槽中問，用文件夾將膠槽和膠片固定在一起。

E.3.2.2將瓊脂糖凝膠用注射器緩緩從膠槽上的小孔注入膠槽與膠片之間，注入凝膠時注意避免氣泡

的產(chǎn)生，并使凝膠均勻的分布在膠片上，待凝固后放4℃預冷后使用。

E.3.3電泳

E.3.3.1小心將凝膠剝離膠板，將載有凝膠的膠片放入電泳槽內(nèi)，然后將細胞裂解上清液按照每孔1

μL～3μL/孔加到入樣孔中，靜置30s使樣品完全被凝膠吸收后，注入電泳液。

E.3.3.2乳酸脫氫酶電泳電壓為95V，電泳時間為1.5h；葡萄糖—6—磷酸脫氫酶電泳電壓為90V，

電泳時間為1h；核苷酸磷酸脫氫酶電泳電壓為85V，電泳時間為1h。為保證同工酶的活性，電泳過程

均在冰浴上進行。

E.3.4顯色

E.3.4.1停止電泳后，取出凝膠膠片，放置在暗盒內(nèi)，注入3mL～5mL對應底物的顯色液，37℃反應

20min～25min。

E.3.4.2酶譜出現(xiàn)后，在清水中清洗膠片2～3次，用濾紙吸去膠片上的殘留水分即可拍照。

E.4判定標準

E.4.1若待檢細胞與標準參考細胞的三種同工酶條帶數(shù)目均相同，且條帶的遷移距離與標準參考細胞

相同，則判定待檢細胞系為同一種屬細胞系。

E.4.2若待檢細胞與標準參考細胞的三種同工酶條帶數(shù)目相同，但條帶的遷移距離與標準參考細胞不

同，判定待檢細胞系為不同種屬細胞系。

E.4.3若待檢細胞與標準參考細胞的三種同工酶條帶數(shù)目不同，判定待檢細胞系存在種屬間細胞交叉

污染。

15

DB4403/T122—2020

GF

附錄F

（資料性）

腫瘤細胞特異性標記物列表

表F.1給出了腫瘤細胞特異性標記物列表。

表F.1腫瘤細胞特異性標記物列表

腫瘤細胞系種類細胞特異性標記物

肺癌細胞CYFRA21—1、NSE、SCC、CEA、CA50均應表達

肝癌細胞AFP、AFU、CEA、CA19—9均應表達

結(jié)直腸癌細胞CEA、Ki67、CK20、CK7、CA19—9、CA50均應表達

乳腺癌細胞CA15—3、CEA、CA125均應表達

卵巢癌細胞CA125、CEA、CA72—4、β—HCG、AFP均應表達

宮頸癌細胞CEA、CA72—4均應表達

子宮癌細胞CEA、SCC、SF、β—HCG均應表達

胃癌細胞CEA、CA72—4、CA19—9均應表達

黑色素細胞S—100、NKI—C3、HMB—45均應表達

前列腺癌細胞PAP、PSA、F—PSA均應表達

胰腺癌細胞HCG、CEA、AFP均應表達

16

DB4403/T122—2020

HG

附錄G

（資料性）

臺盼藍染色標準流程

G.1儀器

顯微鏡、玻片、蓋玻片、滴管。

G.2試劑耗材

0.4%臺盼藍染液、生理鹽水、血細胞計數(shù)板。

G.3檢測原理

臺盼藍是組織和細胞培養(yǎng)中最常用的死細胞鑒定染色方法之一。正常的活細胞，由于胞膜結(jié)構(gòu)完整，

能夠排斥臺盼藍，使之不能夠進入胞內(nèi)。而喪失活性或細胞膜不完整的細胞，胞膜的通透性增加，可被

臺盼藍染成藍色。通常認為細胞膜完整性喪失，即可認為細胞已經(jīng)死亡。因此，借助臺盼藍染色可以非

常簡便、快速地區(qū)分活細胞和死細胞。臺盼藍染色后，通過顯微鏡下直接計數(shù)或顯微鏡下拍照后計數(shù)，

就可以對細胞存活率進行比較精確的定量。

G.4檢測步驟

G.4.1對于懸浮細胞，離心收集細胞，充分清洗后，用適當緩沖液如PBS，重懸制成單細胞懸液。對

于貼壁細胞，先用胰酶消化細胞，再按照懸浮細胞的方法制備單細胞懸液。

G.4.2取0.5mL單細胞懸液，按照1:1比例與0.5mL濃度為0.4%的臺盼藍染色液充分混勻，室溫染色3

min～10min。

注1：因臺盼藍具有細胞毒性，染色時間過久會導致部分死細胞染色，干擾計數(shù)。

注2：若細胞密度比較高，可取0.2mL單細胞懸液，經(jīng)適當緩沖液稀釋到0.5mL，之后再用0.5mL濃度為0.4%的臺

盼藍染色液染色。

G.4.3取少量上述染色細胞加入血細胞計數(shù)板，于顯微鏡低倍鏡下計數(shù)，分別計算著色細胞（即損傷

細胞和死細胞）和總細胞。

注1：用移液槍加染色細胞時，沿著蓋玻片的邊緣輕輕加液使其完全覆蓋住整個小室。

注2：1mm2方格內(nèi)細胞數(shù)通常控制在20—50個，若細胞數(shù)超過200個，需重新調(diào)整稀釋倍數(shù)。

G.4.4細胞數(shù)目的計算見公式（G.1）。

N=C×V??????????（G.1）

其中：

C=M×D×104??????????（G.2）

式中：

N——細胞數(shù)目（個）；

C——細胞濃度（個/mL）；

V——細胞懸液體積（mL）；

17

DB4403/T122—2020

M——細胞計數(shù)板單個方格的平均細胞數(shù)（個）；

D——稀釋倍數(shù)。

G.4.5細胞活率的計算見公式（G.3）。

Vi=(N總—N著色)/N總×100%??????????（G.3）

式中：

N總——總細胞數(shù)（個）；

N著色——總著色細胞數(shù)（個）。

18

DB4403/T122—2020

IH

附錄H

（資料性）

凝集試驗操作流程

H.1儀器

二氧化碳培養(yǎng)箱（溫度：5℃～65℃，容積不小于80L）、離心機（溫度：-20℃～40℃；最高離

心力達15000g以上）、生物安全柜、細胞計數(shù)儀、凹孔板。

H.2試劑耗材

75cm2細胞培養(yǎng)瓶、腫瘤細胞培養(yǎng)基、胎牛血清、青/鏈霉素、胰蛋白酶、生理鹽水、刀豆蛋白。

H.3檢測程序

H.3.1腫瘤細胞系凝集試驗設計包括空包對照組、腫瘤細胞系的試驗組和人成纖維細胞的陰性對照

組。刀豆蛋白濃度梯度包括0μg/mL、12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL。

H.3.2取生長狀態(tài)良好的腫瘤細胞，采用傳統(tǒng)胰酶消化法收集細胞，調(diào)整細胞密度為1×105個/mL。

H.3.3向若干凹孔板凹中加細胞懸液，每凹孔加0.1mL，再分別加入刀豆蛋白—PBS溶液0.1mL，使刀

豆蛋白的最終濃度依次為：100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL和0μg/mL（對照）。

H.3.4置微型振蕩器上振蕩混勻，靜止5min～10min，觀察凝集現(xiàn)象。

H.4判斷標準

H.4.1若空白對照和陰性對照組在刀豆蛋白低濃度（小于50μg/mL）均無凝集現(xiàn)象產(chǎn)生，判斷該試驗

有效。

H.4.2在試驗有效的前提下，觀察腫瘤細胞系檢測組發(fā)生凝集反應的刀豆蛋白濃度，記錄試驗數(shù)據(jù)并

拍照保存。

19

DB4403/T122—2020

參考文獻

[1]《中華人民共和國藥典（三部）》（2020年版）

[2]《干細胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導原則（試行）—CFDA》,2015.

[3]《中國人類遺傳資源實體瘤永生細胞系建立技術規(guī)程》（討論稿），2007.

[4]郭建華,張吉才,李曉強,等.胸腹水細胞學前檢查各環(huán)節(jié)因素分析[J].國際檢驗醫(yī)學雜志,

2012,33(3):315—317.

[5]蔣敬庭,張學光.腫瘤細胞的分離與純化研究進展[J].醫(yī)學綜述,2009,15(4):522—524.

[6]楊永強,張巧玲.Ficoll密度梯度離心法分離腹水單個核細胞方法的優(yōu)化[J].中外醫(yī)