流式基礎(chǔ)原理及應(yīng)用-血研所

貝克曼庫爾特

流式細胞技術(shù)

劉香嵐(Sunny)ProductSpecialistTelleckmanCoulterFlowCytometryProducts流式細胞術(shù)Kaluza軟件操作23Result4流式細胞術(shù)原理和操作1Result4流式細胞術(shù)應(yīng)用流式細胞術(shù)

流式細胞技術(shù)(Flow

Cytometry,FCM)

–研究范圍：動物細胞、植物細胞、細菌、病毒、微生物、寄生蟲等生物體

以及其中的DNA、蛋白或其他分子，還可以利用微球研究可溶性蛋白

0.1um>50um流式細胞術(shù)

流式細胞術(shù)定義：

在流動的狀態(tài)中檢測細胞或顆粒的各項特性細胞結(jié)構(gòu)細胞大小細胞粒度DNA含量與細胞周期RNA含量蛋白質(zhì)含量細胞功能細胞表面/胞漿/核的特異性抗原細胞活性細胞內(nèi)細胞因子酶活性激素結(jié)合位點細胞受體在上述信號基礎(chǔ)上的細胞分選

檢測特點：特異性強，靈敏度高，速度快，并能實現(xiàn)多參數(shù)分析基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床新藥研究生物學(xué)領(lǐng)域疾病機理等細胞表型分析按照細胞的蛋白表達（或轉(zhuǎn)染）定量按照細胞的DNA量的變化來分類和定量按照細胞功能改變（如分泌細胞因子，受體表達等）來對細胞進行分類和定量按照細胞生物大分子的暴露來分類細胞和定量按照特定細胞的標記對該細胞進行上述指標的深度研究細胞生物學(xué)研究細胞存活率檢測細胞凋亡發(fā)生率檢測細胞免疫功能改變檢測細胞周期檢測納米藥物和材料研究和應(yīng)用納米材料基礎(chǔ)研究，如半導(dǎo)體種類、組成比例、直徑大小與光譜激發(fā)納米材料的應(yīng)用，如吸收和發(fā)射性能、半衰期、標記效率、色譜交叉和補償、標記檢測等納米材料對細胞的毒性性能檢測，如凋亡、激活能力等納米材料導(dǎo)入細胞的途徑和效率研究流式細胞術(shù)微生物及海洋生物學(xué)研究

流式細胞儀---基本構(gòu)造熒光信號—電信號—數(shù)字信號液流系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng)電子和計算機系統(tǒng)形成層流，聚焦細胞產(chǎn)生和收集光信號分選系統(tǒng)流式細胞儀---液流系統(tǒng)樣本流鞘液流流動室:檢測樣本在此與激光正交由于鞘液的作用，待測細胞被限制在液流的軸線上——流體動力學(xué)聚焦流動室側(cè)向及熒光信號前向散射光信號鞘液激光Absorptionspectrum:RangeoverwhichafluorescencecompoundmaybeexcitedEmissionspectrum:Rangeofemittedwavelengthsforaparticularcompound激光—激發(fā)光學(xué)系統(tǒng)濾光片—收集光學(xué)系統(tǒng)流式細胞儀---光學(xué)系統(tǒng)之激光器激光光源提供單一波長、單一方向的穩(wěn)定光照375405488532561638常用激光器種類---激光波長流式細胞儀---光學(xué)系統(tǒng)之濾光片長通濾片（LongPassFilter）：只允許特定波長以上的光線通過（500LP）短通濾片（ShortPassFilter）：只允許特定波長以下的光線通過（500SP）帶通濾片（BandPassFilter）:只允許特定波長的光線通過

（500BP500/50）二向色性濾片(DichroicFilter)：45角放置允許一定波長的光線通過，其

他光線被反射

反射光550DL>550nm<550nm488DL488BK550DL525BP600DL575BP640DL620BP675BP流式細胞儀---電子系統(tǒng)進行信號檢測和分析熒光信號由光電接收器接收，轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘枺煞治鲭妷好}沖的高度、面積和寬度流式細胞儀---電子系統(tǒng)電脈沖信號經(jīng)A/D轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號數(shù)字信號傳送到計算機，進行儲存、作圖、統(tǒng)計分析流式細胞儀---計算機系統(tǒng)流式細胞分析儀的工作原理樣本的檢測與分析---信號散射光信號

熒光信號樣本的檢測與分析---信號散射光信號——前向散射光：在激光束正前方的檢測器所檢測的光信號，主要與細胞相對大小及其表面積有關(guān)樣本的檢測與分析---信號散射光信號——側(cè)向散射光：與激光束垂直方向的檢測器所檢測的光信號，主要與細胞顆粒度及細胞內(nèi)細胞器的相對復(fù)雜性有關(guān)樣本的檢測與分析---信號根據(jù)散射光信號，在人白細胞中鑒別出不同亞群：白細胞淋巴細胞單核細胞

粒細胞FSC樣本的檢測與分析---信號熒光信號FITC激光488nm519nm578nm667nmFITCPEPC5樣本的檢測與分析---數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)顯示:

直方圖(Histogram)

二維點圖(DotPlot)

等高線圖(ContourPlot)

密度圖(Density)等直方圖分析（HistogramPlot）

橫坐標表示散射光或熒光信號相對強度值，其單位是道數(shù)，可以是線性的，也可以是對數(shù)的，縱坐標表示細胞數(shù)樣本的檢測與分析---數(shù)據(jù)散點圖分析（Dotplot）樣本的檢測與分析---數(shù)據(jù)1234數(shù)據(jù)分析---雙參數(shù)等高圖和密度圖電壓調(diào)節(jié)－利用同型對照：設(shè)置背景

電壓volts

增益Gain設(shè)定陰性和陽性信號強度的臨界點電壓的調(diào)節(jié)-確定信號放大程度電壓適當(dāng)電壓太低電壓太高電壓調(diào)節(jié)的原則：同型對照或陰性對照在陰性區(qū)域呈正態(tài)分布，陽性率<2%但不為0樣本的檢測與分析---熒光補償熒光染料EXEM應(yīng)用

熒光染料EXEM應(yīng)用五光十色的熒光素樣本的檢測與分析---熒光補償樣本的檢測與分析---熒光補償520400500600700575665FITCPEPC5laserFITCPE14FITCPEx-meanQ1=Q3y-meanQ3=Q4123423樣本的檢測與分析---熒光補償補償前23FITCPE14FITCPENotenoughLFL2-%LFL1y-meanQ3<Q41234FITCPETooMuchLFL2-%LFL1andTooMuchLFL1-%LFL2y-meanQ3>Q4x-meanQ1<Q31234補償不足過補償FITCPEGOODx-meanQ1=Q3y-meanQ3=Q41234流式結(jié)果分析過程CD45RA-ECDCD27-PC5CD8-PC7CD4-PECD3-FITCSSSSFSCD45RA-ECDCD27-PC5CD4T細胞CD8T細胞通過設(shè)定圖形及各群細胞的邏輯關(guān)系找到目的細胞淋巴細胞T細胞活化活化流式細胞術(shù)Kaluza軟件操作23Result4流式細胞術(shù)原理和操作1Result4流式細胞術(shù)應(yīng)用免疫功能監(jiān)測：HIV；移植HLA配型；移植后排斥：感染；風(fēng)濕免疫性疾病等免疫相關(guān)疾病腫瘤腫瘤疾病預(yù)后及手術(shù)、化療效果評價;多藥耐藥p170檢測血液病白血病淋巴瘤免疫分型、PNH診斷，貧血、ITP等療效評價流式細胞術(shù)的常見應(yīng)用----臨床流式細胞術(shù)的常見應(yīng)用----臨床感染性疾病的鑒別與病情進展判斷腫瘤疾病預(yù)后及手術(shù)、化療效果評價血液系統(tǒng)疾病診斷和預(yù)后：白血病淋巴瘤免疫分型、

PNH診斷，貧血、ITP等療效評價移植后排異反應(yīng)監(jiān)測風(fēng)濕免疫性疾病輔助診斷、療效和預(yù)后判斷不孕不育、流產(chǎn)預(yù)警細胞治療其他免疫相關(guān)疾?。耗I小球腎炎、甲亢、糖尿病等國內(nèi)常規(guī)臨床流式檢測項目39流式細胞術(shù)的常見應(yīng)用----科研細胞周期分析細胞凋亡細胞增殖細胞因子檢測機體免疫功能監(jiān)測干細胞研究……細胞周期檢測G0/G1SG2/M在細胞周期的不同時期，細胞中的核酸（DNA）的含量是完全不同的，因此，可以通過特異性核酸染料如PI，SYTOX-Green等，通過流式細胞儀的檢測，得到細胞周期各個階段的DNA分布狀態(tài)，從而計算出G0/G1、S期和G2/M的比列皮膚呈纖維細胞細胞周期檢測細胞凋亡檢測AnnexinV/PI雙染法測定細胞凋亡示意圖細胞增殖能力檢測CFSE是一種非極性分子，可自由穿透細胞膜，并在細胞內(nèi)被酯酶水解轉(zhuǎn)化成具有熒光特性CFSE，它可以自發(fā)不可逆的通過共價結(jié)合賴氨酸側(cè)鏈或者其他可利用的氨基而摻入細胞內(nèi)和細胞表面的蛋白。當(dāng)細胞分裂時，染料也均勻的分布到子代細胞中，同時結(jié)合了氨基后的CFSE能夠吸收488nm的光，同時發(fā)出強的綠色熒光，這樣，在一個增殖的細胞群中，各連續(xù)代細胞以熒光強度的2倍遞減，流式細胞儀基于這一點從而達到分析細胞增殖的目的細胞因子檢測細胞因子（白介素、干擾素、腫瘤壞死因子……）細胞因子分泌型細胞(Th1、Th2、Th17、Treg……)CBA（Cytometric

Bead

Array）通過利用一系列帶有熒光標記的微小、分散的微球連接特定的捕獲抗體以捕捉溶液系統(tǒng)中的待測物，通過對應(yīng)各種不同檢測物的特異微球上所帶有熒光強度不同從而同時測定分析樣本中多種可溶性成分的數(shù)量細胞因子檢測細胞因子檢測Th1細胞分泌IFN-γ；Th2細胞分泌IL-4、IL-5或IL-13；Th9細胞分泌IL-9；Th17細胞分泌IL-17；Th22分泌IL-22Treg表達Foxp3效應(yīng)CD4+T細胞以往被認為只是由Th1或Th2組成，現(xiàn)在認識到還有Th9、Th17、Th22和Treg。這些細胞的區(qū)別在于它們分泌的細胞因子：穿孔素、和顆粒酶存在于CTL細胞和NK細胞的胞漿顆粒中，用以評價CTL和NK的殺傷活性.細胞因子檢測細胞因子的流式檢測流程選擇合適的細胞類型，如淋巴細胞、單核細胞等選擇合適的激活程序體外刺激，誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生細胞因子激活劑包括：PMA、植物凝集素、Ionomycin和脂多糖（LPS）等在細胞激活期間加入蛋白轉(zhuǎn)運抑制劑brefeldinA或monesin固定/通透細胞用特異的抗細胞因子的單克隆抗體染色流式分析細胞因子檢測細胞因子檢測臨床流式檢測的免疫學(xué)基礎(chǔ)機體免疫功能的監(jiān)測CD3+：總T細胞數(shù)量——免疫大軍的數(shù)量CD4+：輔助調(diào)節(jié)性T細胞——指揮部CD8+：殺傷性T細胞——戰(zhàn)士CD4/CD8：比例均衡Th1/Th2：活化/抑制，反饋機制——參謀Treg：負反饋——權(quán)力制約CD69：早期活化——戰(zhàn)斗準備HLA-DR：持續(xù)活化——投入戰(zhàn)斗NK：免疫監(jiān)視——警察單核巨噬細胞、DC——情報員IMPannel表型鑒定基本方案—描繪主要淋巴細胞亞群和單