一種可快速檢測(cè)大腸桿菌O157：H7 的紙基傳感器的制備與應(yīng)用

食源性致病菌是引發(fā)公共衛(wèi)生安全事件的重要因素之一，其在食品的制造、銷售、處理和消費(fèi)等過(guò)程中都有傳播的可能性[1]。在食源性致病菌中，大腸埃希氏菌是易導(dǎo)致出血性腹瀉和腸炎的致病菌，O157:H7則是典型的菌屬，該致病菌通常存在于未經(jīng)加工的蔬菜、肉制品中，若攝入被大腸桿菌O157:H7污染的食品，會(huì)對(duì)人體造成較大傷害[2]，因此需要建立一類適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的方法來(lái)對(duì)食品進(jìn)行篩查，盡量減少致病菌帶來(lái)的危害。大腸桿菌O157:H7的檢測(cè)方法有傳統(tǒng)的培養(yǎng)法、分子生物學(xué)檢測(cè)、免疫學(xué)方法[3]、生物傳感器法和核酸適配體法等。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法的檢測(cè)周期長(zhǎng)、對(duì)檢測(cè)人員經(jīng)驗(yàn)要求高，免疫學(xué)和分子生物學(xué)檢測(cè)方法的操作復(fù)雜、無(wú)法滿足現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的要求，因此如何在低成本、高效、快速的前提下進(jìn)行檢測(cè)成為亟待解決的問(wèn)題。本研究制備了一種基于適配體的快速檢測(cè)紙基傳感器，用于大腸桿菌O157:H7的檢測(cè)。該傳感器有較好的特異性和重復(fù)性，可在15min內(nèi)快速檢測(cè)出大腸桿菌O157:H7并應(yīng)用于實(shí)際樣品檢測(cè)中。1材料與方法1.1材料與試劑硝酸鎵；99.99%六水合硝酸鋅；硝酸鉻；氨水（28wt%）；鹽酸；異丙醇；氫氧化鈉；超純水；N,N-二甲基甲酰胺（DMF）；N-羥基丁二酰亞胺（NHS）；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）；3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）；無(wú)水乙醇；羥基化聚乙二醇羧酸（HO-PEG12-COOH）；PBS緩沖液（0.01mol·L-1，pH=7.4）；Tris-HCl緩沖液（10mmol·L-1，pH=7.2）；功能化核酸適配體及其互補(bǔ)序列；whatman1號(hào)定性濾紙；吸水棉；底板；大腸埃希氏菌O157:H7（ATCC35150）；麥?zhǔn)媳葷峁?；瓊脂平板?.2儀器設(shè)備CP-225D天平，德國(guó)賽多利斯；便攜式pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；XPDHG-9246A數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱，上海析譜儀器有限公司；馬弗爐，英國(guó)CARBOLITE；DF-101S集熱式磁力攪拌器，上海力辰邦西儀器科技有限公司；MilliqAcademic超純水機(jī)，美國(guó)密理博公司；KQ-50E超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；水熱反應(yīng)釜，力辰科技；TG-16離心機(jī)，上海屹譜；TalosF200透射電子顯微鏡，賽默飛；D8ADVANCEX射線衍射儀，布魯克AXS；RF-6000熒光分光光度計(jì)，日本島津公司；Zeta電位分析儀，PALS美國(guó)布魯克公司；WFH-204B手提式紫外分析儀，杭州齊威儀器有限公司。1.3實(shí)驗(yàn)方法1.3.1材料合成本文采用一步水熱法[4]合成紅色長(zhǎng)余輝納米材料ZnGa2O4:Cr3+，首先用超純水分別配制2mol·L-1硝酸鎵、1mol·L-1硝酸鋅、1mmol·L-1硝酸鉻溶液，再移取1mL硝酸鎵、2mL硝酸鋅、4mL硝酸鉻的水溶液于燒杯中混合均勻，加超純水定容至30mL，定容過(guò)程中用氨水調(diào)節(jié)溶液pH至9.0。隨后，將混合溶液于室溫?cái)嚢?.5h使其預(yù)反應(yīng)，預(yù)反應(yīng)結(jié)束后將溶液轉(zhuǎn)移到聚四氟乙烯內(nèi)襯反應(yīng)釜（內(nèi)襯體積50mL）中，封好后將反應(yīng)釜放入220℃烘箱中（事先預(yù)熱），水熱反應(yīng)約10h。反應(yīng)結(jié)束后，待反應(yīng)釜自然冷卻到室溫，將產(chǎn)物分散于0.01mol·L-1鹽酸中，充分混合后離心收集，加入過(guò)量異丙醇離心洗滌3次，最后用超純水洗滌1次，于真空干燥箱中干燥備用。1.3.2適配體選擇參考文獻(xiàn)[5]合成修飾過(guò)的大腸桿菌O157:H7適配體及DNA互補(bǔ)鏈，用以修飾長(zhǎng)余輝材料的適配體的5'端均修飾了羧基，3'端修飾了生物素，其余適配體5'端均用生物素進(jìn)行了修飾，所有適配體和DNA互補(bǔ)鏈均委托上海生工生物工程有限公司合成，所合成的DNA序列見(jiàn)表1。表1適配體或DNA序列表1.3.3適配體功能化材料（1）羥基化修飾。將200mg紅色長(zhǎng)余輝納米材料放入5mmol·L-1氫氧化鈉溶液中并超聲分散，在室溫條件下攪拌24h，而后放入離心機(jī)中2700r·min-1離心分離5min，將離心產(chǎn)物依次用超純水（自制）洗滌3次，洗滌所得產(chǎn)物于真空干燥箱中，在10-2Pa、50℃條件下干燥6h，收集備用。（2）氨基化修飾。取羥基化的紅色長(zhǎng)余輝材料100mg，超聲分散于40mLDMF中，邊磁力攪拌邊向溶液中加入APTES，加入量約為40μL；滴加結(jié)束后將其置于80℃下恒溫?cái)嚢?2h，2700r·min-1離心3min，分離收集底部沉淀；用DMF洗滌沉淀3次，無(wú)水乙醇洗滌2次，最終產(chǎn)物在室溫下真空干燥。（3）適配體功能化長(zhǎng)余輝納米探針。通過(guò)酰胺縮合反應(yīng)實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)余輝納米顆粒與核酸適配體的偶聯(lián)。具體方法是將5mg氨基功能化的長(zhǎng)余輝納米材料與4nmol的5'端修飾了COOH和3'端修飾了生物素的大腸桿菌O157:H7的適配體1、8nmol的NHS、16nmol的EDC混合于0.01mol·L-1的PBS溶液（pH在7.4左右）中，室溫下避光攪拌。接著將4μmol的HO-PEG12-COOH、8μmol的NHS、16μmol的EDC加入上述溶液中，于室溫下避光攪拌反應(yīng)8h，3000r·min-1離心5min以分離除去未反應(yīng)的適配體，將沉淀用10mmol·L-1Tris-HCl緩沖液（pH=7.2）洗滌3次即可得到適配體功能化的長(zhǎng)余輝納米顆粒，再將其置于緩沖溶液中分散存儲(chǔ)備用。（4）材料表征。將長(zhǎng)余輝材料粉末置于X射線衍射儀中掃描獲取XRD圖譜，將長(zhǎng)余輝材料極少量分散于水溶液中進(jìn)行超聲，再放入熒光分光光度計(jì)測(cè)得激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，將固體粉末和水溶液分別放于紫外燈254nm條件下照射，可觀察到熒光現(xiàn)象。將功能化修飾前后的長(zhǎng)余輝材料分散于純水中，然后置于Zeta電位分析儀中測(cè)得材料的電位變化。1.3.4紙基傳感器的制作將whatman1號(hào)定性濾紙裁剪成如圖1所示形狀，濾紙分成同等大小的3份并進(jìn)行折疊（圖2），用3對(duì)圓形超強(qiáng)磁鐵將3層濾紙吸附住進(jìn)行部分封閉，將折疊好的濾紙放入加熱融化的石蠟液中，浸沒(méi)后立刻取出，待冷卻后將濾紙放入烘箱低溫加熱使石蠟均勻滲透到濾紙間隙中。如圖1所示，圓形區(qū)域未被石蠟浸潤(rùn)的為親水區(qū)，其余已被石蠟浸透的部分為疏水區(qū)。將3mg·mL-1適配體1功能化的長(zhǎng)余輝探針固定在第一層的親水區(qū)，4nmol·L-1適配體2固定在第二層的親水區(qū)，7nmol·mL-1適配體1的DNA互補(bǔ)鏈固定在第三層的親水區(qū)，固定結(jié)束后將紙基置于37℃烘箱內(nèi)加熱8h，在最后一層底部粘合吸水墊和底板，最后密封干燥保存。檢測(cè)原理如下。當(dāng)溶液中含有大腸桿菌O157:H7時(shí)，目標(biāo)致病菌與功能化的長(zhǎng)余輝探針結(jié)合進(jìn)入第二層，第二層的適配體2又與目標(biāo)致病菌相結(jié)合，未結(jié)合的長(zhǎng)余輝探針則隨著毛細(xì)作用進(jìn)入第三層與適配體1的DNA互補(bǔ)鏈相結(jié)合，待反應(yīng)結(jié)束后在紫外燈254nm下照射激發(fā)紙基，則第二層與第三層均有紅色熒光；若溶液中不含目標(biāo)致病菌，則長(zhǎng)余輝探針直接與第三層的適配體1DNA互補(bǔ)相結(jié)合，紫外燈激發(fā)后第二層無(wú)熒光現(xiàn)象，第三層有紅色熒光。圖1濾紙展開(kāi)形狀圖圖2濾紙折疊方式圖1.3.5致病菌檢測(cè)對(duì)購(gòu)買的標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸桿菌O157:H7進(jìn)行活化，在培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)24h，用接種環(huán)取適量細(xì)菌于透明玻璃管中，搖勻后與麥?zhǔn)媳葷峁苓M(jìn)行比對(duì)，配制成109CFU·mL-1濃度的菌液，而后將菌液稀釋，搖勻后吸取1mL菌液置于培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24～48h，用平板計(jì)數(shù)法來(lái)確定細(xì)菌的濃度。將不同濃度的菌液滴加進(jìn)第一層親水區(qū)，向下滲透一段時(shí)間后，用紫外燈照射不同的檢測(cè)層以觀察熒光現(xiàn)象確定檢測(cè)結(jié)果，并將其與無(wú)菌水樣品檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)照。2結(jié)果與分析2.1材料結(jié)構(gòu)表征由圖3可知，將X射線衍射儀所得材料圖譜與標(biāo)準(zhǔn)圖譜JCPDS：86-0415對(duì)比可知，所有衍射峰均與標(biāo)準(zhǔn)圖譜相符合，這表明所制備的紅色長(zhǎng)余輝納米材料具有典型的ZnGa2O4晶相結(jié)構(gòu)。由圖4可知，納米粒子的平均粒徑為8.6nm，尺寸差別較小，顆粒呈不規(guī)則狀，近圓形，分散性較好。圖3ZnGa2O4:Cr3+長(zhǎng)余輝材料的XRD圖譜圖4ZnGa2O4:Cr3+在透射電鏡下的形貌特征圖2.2光學(xué)特性表征由圖5可知，合成的紅色長(zhǎng)余輝納米材料可在217～298nm的紫外光條件下激發(fā)；由圖6可知，該材料在發(fā)射峰684nm處，處于紅色光區(qū)域。由圖7可知，用手提式紫外分析儀在254nm條件下照射超聲后的長(zhǎng)余輝納米粒子溶液，可見(jiàn)溶液呈現(xiàn)明顯的紅色。圖5ZnGa2O4:Cr3+的激發(fā)光譜圖圖6ZnGa2O4:Cr3+的發(fā)射光譜圖圖7紅色長(zhǎng)余輝材料固體粉末和水溶液在紫外燈激發(fā)后的余輝現(xiàn)象圖2.3適配體功能化由圖8可知，對(duì)長(zhǎng)余輝材料（PLNPs）、氨基化的長(zhǎng)余輝材料（PLNPs-NH2）、與適配體連接的長(zhǎng)余輝材料（PLNPs-適配體1）分別進(jìn)行ζ電位的測(cè)定，氨基功能化后的長(zhǎng)余輝材料ζ電位由+6.29mV增加到+10.86mV，而與適配體連接后的ζ電位則減少到-12.93mV，此時(shí)納米顆粒帶少量負(fù)電荷，證明納米材料適配體功能化成功。圖8長(zhǎng)余輝材料功能化修飾前后ζ電位的變化圖2.4菌液驗(yàn)證將7種不同濃度的菌液分別滴加到紙基傳感器，15min后用紫外燈照射觀察。菌液的濃度依次為7.5×106CFU·mL-1、7.5×105CFU·mL-1、7.5×104CFU·mL-1、7.5×103CFU·mL-1、7.5×102CFU·mL-1、7.5×101CFU·mL-1、0CFU·mL-1，當(dāng)菌液濃度大于等于7.5×103CFU·mL-1時(shí)，傳感器第二層和第三層均能看到明顯的紅色熒光，當(dāng)菌液濃度小于7.5×103CFU·mL-1時(shí)，傳感器第二層無(wú)熒光現(xiàn)象，第三層仍有明顯的紅色熒光。這表明此傳感器最小檢出濃度為7.5×103CFU·mL-1。用紙基傳感器對(duì)濃度為104CFU·mL-1的金黃色葡萄球菌菌液、7.5×103CFU·mL-1的大腸桿菌O157:H7和104CFU·mL-1的金黃色葡萄球菌的混合液分別進(jìn)行檢測(cè)。由圖9可知，滴加金黃色葡萄球菌菌液的傳感器只有第三層有紅色熒光，而滴加混合菌液的傳感器第二