高三二輪復(fù)習(xí)生物基因工程課件

基因工程20．人類γ基因啟動子上游的調(diào)控序列中含有BCL11A蛋白結(jié)合位點，該位點結(jié)合BCL11A蛋白后，γ基因的表達被抑制。通過改變該結(jié)合位點的序列，解除對γ基因表的抑制，可對某種地中海貧血癥進行基因治療?？蒲腥藛T擴增了γ基因上游不同長度的片段，將這些片段分別插入表達載體中進行轉(zhuǎn)化和熒光檢測，以確定BCL11A蛋白結(jié)合位點的具體位置。相關(guān)信息如圖所示。（1）為將擴增后的產(chǎn)物定向插入載體指導(dǎo)熒光蛋白基因表達，需在引物末端添加限制酶識別序列。據(jù)圖可知，在F1～F7末端添加的序列所對應(yīng)的限制酶是

，在R末端添加的序列所對應(yīng)的限制酶是

。本實驗中，從產(chǎn)物擴增到載體構(gòu)建完成的整個過程共需要

種酶?？键c：限制酶的選擇和啟動子功能啟動子的方向研究啟動子的方法限制酶的選擇2021年山東（2）將構(gòu)建的載體導(dǎo)入除去BCL11A基因的受體細胞，成功轉(zhuǎn)化后，含F(xiàn)1～F6與R擴增產(chǎn)物的載體表達熒光蛋白，受體細胞有熒光，含F(xiàn)7與R擴增產(chǎn)物的受體細胞無熒光。含F(xiàn)7與R擴增產(chǎn)物的受體細胞無熒光的原因是

（3）向培養(yǎng)液中添加適量的雌激素，含F(xiàn)1～F4與R擴增產(chǎn)物的受體細胞不再有熒光，而含F(xiàn)5～F6與R擴增產(chǎn)物的受體細胞仍有熒光。若γ基因上游調(diào)控序列上與引物序列所對應(yīng)的位置不含有BCL11A蛋白的結(jié)合位點序列，據(jù)此結(jié)果可推測，BCL11A蛋白結(jié)合位點位于

，理由是

。啟動子的調(diào)控2022年山東25.某種類型的白血病由蛋白P引發(fā)，蛋白UBC可使P被蛋白酶識別并降解，藥物A可通過影響這一過程對該病起到治療作用。為探索藥物A治療該病的機理，需構(gòu)建重組載體以獲得融合蛋白FLAG-P和FLAG-P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P，F(xiàn)LAG是一種短肽，連接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能與含有FLAG抗體的介質(zhì)結(jié)合，但不影響P或P△的功能。（1）為構(gòu)建重組載體，需先設(shè)計引物，通過PCR特異性擴增P基因。用于擴增P基因的引物需滿足的條件是兩種引物分別與兩條模板鏈3'端的堿基序列互補配對、為使PCR產(chǎn)物能被限制酶切割，需在引物上添加相應(yīng)的限制酶識別序列，該限制酶識別序列應(yīng)添加在引物的5'端（填“3'端”或“5'端”）?？键c：引物需滿足的條件、限制酶序列添加在引物的位置（2）PCR擴增得到的P基因經(jīng)酶切連接插入載體后，與編碼FLAG的序列形成一個融合基因，如圖甲所示，其中“ATGTGCA”為P基因編碼鏈起始序列。將該重組載體導(dǎo)入細胞后，融合基因轉(zhuǎn)錄出的mRNA序列正確，翻譯出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正確，但P基因?qū)?yīng)的氨基酸序列與P不同。據(jù)圖甲分析，出現(xiàn)該問題的原因是在轉(zhuǎn)錄出的mRNA中，限制酶識別序列對應(yīng)的最后兩個堿基與P基因?qū)?yīng)的第一個堿基構(gòu)成一個密碼子，導(dǎo)致讀碼框改變，翻譯出的氨基酸序列改變。修改擴增P基因時使用的帶有EcoRⅠ識別序列的引物來解決該問題，具體修改方案是在EcoRⅠ識別序列前后增加堿基，使其堿基數(shù)目加上FLAG的堿基數(shù)目為3的倍數(shù)

?？键c：密碼子堿基問題（3）融合蛋白表達成功后，將FLAG-P、FLAG-P△、藥物A和UBC按照圖乙中的組合方式分成5組。各組樣品混勻后分別流經(jīng)含F(xiàn)LAG抗體的介質(zhì)，分離出與介質(zhì)結(jié)合的物質(zhì)并用UBC抗體檢測，檢測結(jié)果如圖丙所示。已知FLAG-P和FLAG-P△不能降解UBC，由①②③組結(jié)果的差異推測，藥物A的作用是促進UBC與FLAG-P的結(jié)合；由②④組或③⑤組的差異推測，P△中缺失的特定序列的作用是P△中缺失的特定序列是與UBC結(jié)合的關(guān)鍵序列

。（4）根據(jù)以上結(jié)果推測，藥物A治療該病的機理是藥物A促進UBC與FLAG-P的結(jié)合，從而促進蛋白P被蛋白酶識別并降解，達到治療目的?？键c：抗體檢測、疾病治療25.科研人員構(gòu)建了可表達J-V5融合蛋白的重組質(zhì)粒并進行了檢測，該質(zhì)粒的部分結(jié)構(gòu)如圖甲所示，其中V5編碼序列表達標簽短肽V5。2023年山東

（1）與圖甲中啟動子結(jié)合的酶是

RNA聚合酶。除圖甲中標出的結(jié)構(gòu)外，作為載體，質(zhì)粒還需具備的結(jié)構(gòu)有限制酶切割位點、標記基因、復(fù)制原點等（答出2個結(jié)構(gòu)即可）。（2）構(gòu)建重組質(zhì)粒后，為了確定J基因連接到質(zhì)粒中且插入方向正確，需進行PCR檢測，若僅用一對引物，應(yīng)選擇圖甲中的引物F2和R1或F1與R2。已知J基因轉(zhuǎn)錄的模板鏈位于b鏈，由此可知引物F1與圖甲中J基因的a鏈（填“a鏈”或“b鏈”）相應(yīng)部分的序列相同。（3）重組質(zhì)粒在受體細胞內(nèi)正確表達后，用抗J蛋白抗體和抗V5抗體分別檢測相應(yīng)蛋白是否表達以及表達水平，結(jié)果如圖乙所示。其中，出現(xiàn)條帶1證明細胞內(nèi)表達了J-V5融合蛋白，條帶2所檢出的蛋白不是（填“是”或“不是”）由重組質(zhì)粒上的J基因表達的?？键c：啟動子、載體組成、目的基因插入質(zhì)粒時引物的選擇、檢測、電泳【解析】【分析】基因工程的關(guān)鍵步驟是構(gòu)建基因表達載體，基因表達載體主要由啟動子、目的基因、標記基因和終止子組成，其中標記基因用于篩選重組DNA分子，可以是四環(huán)素、氨芐青霉素等抗性基因，也可以是熒光蛋白基因或產(chǎn)物能顯色的基因?！拘?詳解】基因表達載體的構(gòu)建啟動子是為了啟動下游基因的“表達”，表達首先需要轉(zhuǎn)錄，因此RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位才是轉(zhuǎn)錄的起始。作為運載體必須具備的條件：①要具有限制酶的切割位點；②要有標記基因（如抗性基因），以便于重組后重組子的篩選；③能在宿主細胞中穩(wěn)定存在并復(fù)制；④是安全的，對受體細胞無害，而且要易從供體細胞分離出來，圖中甲有啟動子和終止子等，因此質(zhì)粒還需具備的結(jié)構(gòu)有限制酶的切割位點、標記基因、復(fù)制原點等?！拘?詳解】據(jù)圖甲可知，引物F2與R1或F1與R2結(jié)合部位包含J基因的堿基序列，因此推測為了確定J基因連接到質(zhì)粒中且插入方向正確，進行PCR檢測時，若僅用一對引物，應(yīng)選擇圖甲中的引物F2和R1或F1與R2。b是模板鏈，而根據(jù)圖上啟動子和終止子的位置可知轉(zhuǎn)錄方向是圖上從左向右，對應(yīng)的模板鏈方向應(yīng)該是3’-5'，非模板鏈（也就是a鏈）是5'-3'；考慮到DNA復(fù)制的方向是子鏈的5’-3'，引物基礎(chǔ)上延伸的方向肯定是5'-3'，所以引物結(jié)合的單鏈其方向是3'-5'；圖中F1是前引物，在左側(cè)，所以其配對的單鏈是3’-5'的b鏈，故其序列應(yīng)該與a鏈相應(yīng)部分的序列相同?！拘?詳解】據(jù)圖乙可知，用抗J蛋白抗體和抗V5抗體分別檢測，均出現(xiàn)條帶1，說明條帶1是J-V5融合蛋白?？笿蛋白抗體檢測出現(xiàn)條帶2，抗V5抗體檢測不出現(xiàn)條帶2，說明條帶2所檢出蛋白不是由重組質(zhì)粒上的J基因表達的?；蚬こ痰幕竟ぞ吆突静僮鞒绦蚧蚬こ?/p>

基因工程是指按照人們的愿望，通過轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。從技術(shù)操作層面看，由于基因工程是在DNA分子水平上進行設(shè)計和施工的，因此又叫作重組DNA技術(shù)。（章首頁）01基因工程(重組DNA技術(shù)/轉(zhuǎn)基因技術(shù))的概念理解操作環(huán)境生物體外操作對象基因操作水平DNA分子水平基本過程剪切→拼接→導(dǎo)入→表達原理基因重組結(jié)果創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品分子運輸車分子手術(shù)刀分子縫合針限制性內(nèi)切核酸酶----“分子手術(shù)刀”主要來自原核生物數(shù)千種▲限制酶不是一種酶，而是一類酶。來源種類特點GAATTCCTTAAG能識別雙鏈

DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開。02結(jié)果產(chǎn)生黏性末端或平末端GAATTCCTTAAG限制性內(nèi)切核酸酶----“分子手術(shù)刀”作用部位識別序列長度特定切點上的磷酸二酯鍵大多數(shù)是6個核苷酸序列磷酸二酯鍵02限制性內(nèi)切核酸酶----“分子手術(shù)刀”EcoRⅠ中軸線粘性末端平末端SamⅠ02限制性內(nèi)切核酸酶----“分子手術(shù)刀”注意①能被限制性酶特異性識別的切割位點一般都具有回文序列：即在切割位點，DNA一條鏈正向讀的堿基序列與另一條反向讀的堿基序列完全一致。②在切割含目的基因的DNA分子時，需要在目的基因的兩端都用限制性核酸內(nèi)切酶切割，會產(chǎn)生4個末端。02DNA重組技術(shù)的基本工具:(1)限制性內(nèi)切核酸酶(也稱“限制酶”)原核生物特定核苷酸序列黏性末端思考：①原核生物中存在限制酶的作用是什么？提示原核生物中限制酶的作用是切割外源DNA以保證自身安全，防止外來病原物的危害。②限制酶來源于原核生物，為什么不能切割自己的DNA分子？提示限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在該酶的識別序列或識別序列已經(jīng)被修飾。DNA鏈接酶----“分子縫合針”將雙鏈DNA雙鏈片段“縫合”起來，恢復(fù)被限制酶切開的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵。E.coliDNA連接酶T4DNA連接酶從大腸桿菌中分離得到只能鏈接互補黏性末端從T4噬菌體中分離得到黏性末端與平末端均可連接，但連接平末端的效率相對比較低。作用種類03DNA鏈接酶----“分子縫合針”E.coliDNA連接酶&T4DNA連接酶E.coliDNA連接酶T4DNA連接酶磷酸二酯鍵作用部位★DNA連接酶沒有識別特異性03DNA鏈接酶----“分子縫合針”★思考：DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎？為什么？相同點：都是催化磷酸二酯鍵形成的酶不同點：DNA聚合酶連接的是游離的脫氧核苷酸，需要模板；DNA連接酶連接的是DNA片段。03DNA鏈接酶----“分子縫合針”名稱作用部位作用結(jié)果限制酶磷酸二酯鍵將DNA切成兩個片段DNA連接酶磷酸二酯鍵將兩個DNA片段連接為一個DNA分子DNA聚合酶磷酸二酯鍵將單個脫氧核苷酸依次連接到單鏈末端DNA(水解)酶磷酸二酯鍵將DNA片段水解為單個脫氧核苷酸解旋酶堿基對之間的氫鍵將雙鏈DNA分子局部解旋為單鏈，形成兩條長鏈歸納總結(jié)幾種相關(guān)酶的比較03(2)DNA連接酶磷酸二酯鍵大腸桿菌黏性末端黏性末端基因進入受體細胞的載體----“分子運輸車”質(zhì)粒是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡單、獨立于真核細胞細胞核或原核細胞擬核DNA之外，并具有自我復(fù)制能力的環(huán)狀雙鏈DNA分子。質(zhì)粒04質(zhì)粒、噬菌體、動植物病毒等基因進入受體細胞的載體----“分子運輸車”作用將目的基因轉(zhuǎn)入受體細胞&在受體細胞內(nèi)對目的基因進行大量復(fù)制通常是用質(zhì)粒，噬菌體、動植物病毒也可以。種類04基因進入受體細胞的載體----“分子運輸車”便于插入（攜帶）目的基因☆真正被用作載體的質(zhì)粒，都是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進行過人工改造的。運載體需具備的條件①能在受體細胞中穩(wěn)定保存并復(fù)制②有一個至多個限制酶切割位點③具有標記基因，便于篩查含有重組DNA分子的細胞④對受體細胞無害、易分離04基因進入受體細胞的載體----“分子運輸車”載體上標記基因的標記原理普通培養(yǎng)基不含抗生素選擇培養(yǎng)基50μg/ml四環(huán)素04(3)載體環(huán)狀雙鏈DNA分子噬菌體有一個至多個自我復(fù)制染色體DNA標記對受體細胞無害、易分離圖解限制酶的選擇原則(1)不破壞目的基因原則：如圖甲中可選擇PstⅠ，而不選擇SmaⅠ。(2)保留標記基因、啟動子、終止子、復(fù)制原點原則：質(zhì)粒作為載體必須具備標記基因，所以所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結(jié)構(gòu)，如圖乙中不選擇SmaⅠ。(3)確保出現(xiàn)相同黏性末端原則：通常選擇與切割目的基因相同的限制酶，如圖甲中PstⅠ；為避免目的基因和質(zhì)粒自身環(huán)化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，如圖甲也可選擇PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶。DNA的粗提取與鑒定05一、實驗原理①利用DNA、RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)在理化性質(zhì)方面的差異進行提取和分離

DNA在不同NaCl溶液中的溶解度不同，可溶于2M的NaCl溶液中

DNA不溶于（冷）酒精，但某些蛋白質(zhì)溶于酒精②在一定的溫度下（沸水?。?，DNA遇二苯胺試劑會呈現(xiàn)藍色①研磨：30g洋蔥切碎＋10mL研磨液，充分研磨。②過濾：紗布過濾得濾液③4℃冰箱放置或離心：1500r/min離心5min，取上清液。④加冷酒精（95%）：入等體積冷酒精，靜置2～3min，用玻璃棒沿一個方向攪拌卷起絲狀物。研磨液成分作用SDS使蛋白質(zhì)變性EDTA抑制DNA酶活性Tris-HCl緩沖液穩(wěn)定DNANaCl溶解DNA二、實驗步驟DNA的粗提取與鑒定05二、實驗步驟⑤鑒定：絲狀物或沉淀物＋二苯胺試劑4mL混勻，沸水浴加熱5min，冷卻后觀察到藍色（二苯胺試劑4mL不加DNA做對照）。從左至右：少量DNA、大量DNA、空白對照DNA的粗提取與鑒定06例1.下表為常用的限制性內(nèi)切核酸酶(限制酶)及其識別序列和切割位點，由此推斷以下說法中，錯誤的是（）注：Y為C或T，R為A或G。A.HindⅡ、SmaⅠ兩種限制酶切割后形成平末端B.Sau3AⅠ限制酶的切割位點在識別序列的外部C.BamHⅠ和Sau3AⅠ兩種限制酶切割后形成相同的黏性末端D.一種限制酶一定只能識別一種核苷酸序列限制酶名稱識別序列和切割位點限制酶名稱識別序列和切割位點BamHⅠG↓GATCCKpnⅠGGTAC↓CEcoRⅠC↓AATTCSau3AⅠ↓GATCHindⅡGTY↓RACSmaⅠCCC↓GGGDDNA的粗提取與鑒定06例2.第三代疫苗——DNA疫苗是指將編碼保護性抗原蛋白的基因(如圖甲)插入到適宜的質(zhì)粒(如圖乙)中得到的重組DNA分子，將其導(dǎo)入人體內(nèi)，在人體細胞內(nèi)表達的產(chǎn)物可直接誘導(dǎo)機體免疫應(yīng)答，且可持續(xù)一段時間。限制性內(nèi)切核酸酶的切點分別是BglⅡ、EcoRⅠ和Sau3AⅠ。下列分析錯誤的是（）A.構(gòu)建DNA疫苗時，可用BglⅡ和

Sau3AⅠ切割目的基因和質(zhì)粒B.圖乙中只用EcoRⅠ切割后的質(zhì)粒，含有2個游離的磷酸基團C.用EcoRⅠ切割目的基因和質(zhì)粒，再用DNA連接酶連接，只產(chǎn)生1種連接產(chǎn)物D.抗原基因在體內(nèi)表達時不需要解旋酶C基因工程的基本操作程序目的基因的篩選與獲取基因表達載體的構(gòu)建將目的基因?qū)胧荏w細胞目的基因的檢測與鑒定07從生物材料獲取目的基因基因工程的基本操作程序071.目的基因的篩選與獲取生物材料DNARNA一定大小范圍的DNAcDNA逆轉(zhuǎn)錄基因組文庫cDNA文庫基因文庫獲取目的基因PCR導(dǎo)入受體菌中保存限制酶酶切包括①從相關(guān)的已知結(jié)構(gòu)和功能清晰的基因中進行篩選是較為有效的方法之一。②利用序列數(shù)據(jù)庫和序列比對工具進行篩選。幾種獲取目的基因方法：項目從基因文庫中獲取人工合成方法從基因組文庫中獲取從cDNA文庫中獲取化學(xué)合成法逆轉(zhuǎn)錄法聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）根據(jù)DNA半保留復(fù)制的原理，在體外（PCR擴增儀）提供參與DNA復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件，對目的基因的核苷酸序列進行大量復(fù)制的技術(shù)?；蚬こ痰幕静僮鞒绦?71.目的基因的篩選與獲取耐高溫的DNA聚合酶（Taq酶）DNA模板引物穩(wěn)定的緩沖溶液（一般添加Mg2+）PCR條件:四種脫氧核苷酸(dNTP)激活真核細胞和細菌的DNA聚合酶

利用PCR獲取和擴增目的基因注：引物是一小段能與________的一段堿基序列________的___________。

用于PCR的引物有

種，長度通常為20~30個核苷酸。DNA母鏈互補配對短單鏈核酸3’5’DNA母鏈3’5’DNA母鏈3’5’引物3’5’引物2

▲引物:在DNA復(fù)制時，DNA聚合酶不能直接從模板鏈的一端直接開始合成子鏈，必須由引物提供3′端之后才能開始連接脫氧核苷酸。是能與DNA母鏈互補配對的一小段短單鏈核酸序列.基因工程的基本操作程序071.目的基因的篩選與獲取--PCR思考用PCR可以擴增mRNA嗎？不能！由于RNA不穩(wěn)定，需要將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后再進行擴增單鏈RNA逆轉(zhuǎn)錄酶雜交雙鏈DNA鏈RNA鏈核酸酶H單鏈DNADNA聚合酶雙鏈DNAPCR擴增DNA模板Step1：加熱至90℃以上使雙鏈分開Step2:冷卻至50℃左右使引物與DNA結(jié)合引物Step3:DNA合成+DNA聚合酶+dATP+dGTP+dCTP+dTTP第一輪的產(chǎn)物①變性90℃以上②復(fù)性③延伸冷卻加熱50℃左右引物模板結(jié)合72℃左右DNA從5’端到3’端延伸。72℃時，基因工程的基本操作程序071.目的基因的篩選與獲取--PCR①變性②復(fù)性③延伸循環(huán)基因工程的基本操作程序071.目的基因的篩選與獲取--PCR思考獲取目的基因時至少要經(jīng)過幾次循環(huán)才能分離出目的基因？三次才能得到目的基因如何對產(chǎn)物進行檢測鑒定？思考如何對產(chǎn)物進行檢測鑒定？瓊脂糖凝膠電泳基因工程的基本操作程序071.目的基因的篩選與獲取--PCR

DNA分子具有可解離的基團，在一定的pH下,這些基團可以帶上正電荷或負電荷,在電場的作用下,這些帶電分子會向著與它所帶電荷相反的電極移動，這個過程就叫電泳。思考如何對產(chǎn)物進行檢測鑒定？瓊脂糖凝膠電泳凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長為300納米的紫外燈下被檢測出來。

DNA分子具有可解離的基團，在一定的pH下，這些基團可以帶上正電荷或負電荷，在電場的作用下，這些帶電分子會向著與它所帶電荷相反的電極移動，這個過程就叫電泳?；蚬こ痰幕静僮鞒绦?71.目的基因的篩選與獲取--PCRPCR技術(shù)和DNA復(fù)制的比較基因工程的基本操作程序072.基因表達載體的構(gòu)建(核心工作)游離的DNA片段進入受體細胞，一般會直接被分解，就算可以進行轉(zhuǎn)錄和翻譯成蛋白質(zhì)，游離的DNA片段也無法隨著細胞分裂進行復(fù)制，導(dǎo)致子代細胞不再含有目的基因。解決辦法？思考質(zhì)粒細菌染色體植物染色體細胞核表達載體基因表達載體的作用：①讓目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并遺傳給下一代；②使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用?！罨虮磉_載體的構(gòu)建是基因工程的核心工作。啟動子：一段特殊DNA序列，位于基因的上游，是RNA聚合酶的識別和結(jié)合位點，啟動轉(zhuǎn)錄過程。終止子：一段特殊DNA序列，位于基因的上游，終止轉(zhuǎn)錄?；蚬こ痰幕静僮鞒绦?72.基因表達載體的構(gòu)建(核心工作)列表比較啟動子、終止子、起始密碼子、終止密碼子項目啟動子終止子起始密碼子終止密碼子本質(zhì)_________________________位置目的基因上游目的基因下游mRNA首端mRNA尾端功能__________________________________________________________________________________________________________________________________________DNADNAmRNAmRNA使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停下來翻譯的起始信號(編碼氨基酸)翻譯的結(jié)束信號(不編碼氨基酸)RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA基因工程的基本操作程序072.基因表達載體的構(gòu)建(核心工作)思考限制酶的選擇構(gòu)建載體時，需要用同種限制酶切割載體和目的基因，以獲得相同的黏性末端，便于兩者順利連接。但是由于被切割后的質(zhì)粒本身也具備相同的黏性末端，所以會有一定概率的自身環(huán)化，你有辦法解決這個問題嗎？請?zhí)岢鲎约旱目捶??；蚬こ痰幕静僮鞒绦?72.基因表達載體的構(gòu)建(核心工作)①單酶切法目的基因3.基因表達載體的構(gòu)建過程思考：單酶切的方法缺陷是什么？單酶切缺點:質(zhì)粒重新環(huán)化目的基因自身環(huán)化質(zhì)粒與目的基因反向連接

(后果)如何避免上述問題？abab雙酶切的優(yōu)點:防止質(zhì)粒重新環(huán)化防止質(zhì)粒與目的基因反向連接防止目的基因自身環(huán)化②雙酶切法構(gòu)建過程抗蟲棉的培育過程2.基因表達載體的構(gòu)建1.目的基因的篩選與獲取3.將目的基因?qū)胧荏w細胞4.目的基因的檢測與鑒定Bt基因Ti質(zhì)粒重組DNA分子將目的基因插入染色體DNA中

從社會中來基因工程的基本操作程序073.將目的基因?qū)胧荏w細胞目的基因?qū)胧荏w細胞細胞種類植物細胞動物細胞微生物細胞常用方法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法、花粉管通道法顯微注射法Ca2+處理法（感受態(tài)細胞法）受體細胞體細胞受精卵原核細胞轉(zhuǎn)化過程以農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法為例：將目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA上→農(nóng)桿菌→導(dǎo)入植物細胞→整合到受體細胞的DNA上→表達將含有目的基因的表達載體提純→取受精卵→顯微注射→受精卵發(fā)育→獲得具有新性狀的動物Ca2+處理細胞→感受態(tài)細胞→重組表達載體與感受態(tài)細胞混合→感受態(tài)細胞吸收DNA分子基因工程的基本操作程序073.將目的基因?qū)胧荏w細胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌生活在土壤中的微生物，自然條件下可侵染雙子葉植物和裸子植物，而對大多數(shù)單子葉植物沒有侵染能力。農(nóng)桿菌細胞內(nèi)含有Ti質(zhì)粒，當(dāng)它侵染植物細胞后，能將Ti質(zhì)粒上的T-DNA（可轉(zhuǎn)移的DNA）轉(zhuǎn)移到被侵染的細胞，并且將其整合到該細胞的染色體DNA上?；蚬こ痰幕静僮鞒绦?73.將目的基因?qū)胧荏w細胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法122.將新鮮的從葉片上取下的圓形小葉與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，然后篩選轉(zhuǎn)化細胞，并再生成植株；1.將花序直接浸沒在含農(nóng)桿菌的溶液中一段時間，然后培養(yǎng)植株并獲得種子，再進行篩選、鑒定?；蚬こ痰幕静僮鞒绦?73.將目的基因?qū)胧荏w細胞兩次拼接：第一次拼接是將目的基因拼接到Ti質(zhì)粒的T-DNA上；第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T-DNA拼接到受體細胞染色體的DNA上。兩次導(dǎo)入：第一次導(dǎo)入是將含目的基因的Ti質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌；第二次導(dǎo)入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA導(dǎo)入受體細胞。

提醒：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中的兩次拼接、兩次導(dǎo)入基因工程的基本操作程序074.目的基因的檢測與鑒定分子水平檢測目的基因DNA分子雜交檢測mRNA檢測表達的蛋白質(zhì)分子雜交抗原—抗體雜交PCR反應(yīng)PCR反應(yīng)標記基因標記基因檢測目的基因DNA分子雜交檢測mRNA檢測表達的蛋白質(zhì)分子雜交抗原—抗體雜交基因工程的基本操作程序074.目的基因的檢測與鑒定分子水平PCR檢測普通培養(yǎng)基不含抗生素選擇培養(yǎng)基50μg/ml四環(huán)素抗性鑒定基因工程的基本操作程序074.目的基因的檢測與鑒定個體水平抗蟲鑒定棉鈴蟲棉鈴蟲（死亡）基因工程的基本操作程序074.目的基因的檢測與鑒定個體水平基因工程的應(yīng)用和蛋白質(zhì)工程基因工程在農(nóng)牧業(yè)方面的應(yīng)用①轉(zhuǎn)基因抗蟲植物②轉(zhuǎn)基因抗病植物③轉(zhuǎn)基因抗除草劑植物④轉(zhuǎn)基因改良植物的品質(zhì)提高作物抗逆能力改良作物的品質(zhì)改良動物的品質(zhì)⑤用于提高動物生長速度⑥用于改善畜產(chǎn)品的品質(zhì)01基因工程在農(nóng)牧業(yè)方面的應(yīng)用①轉(zhuǎn)基因抗蟲植物提高作物抗逆能力從某些生物中分離出抗蟲基因?qū)胱魑?，使之具有抗蟲性狀①-1優(yōu)點：減少化學(xué)農(nóng)藥的使用、降低生產(chǎn)成本、提高產(chǎn)量Bt毒蛋白基因

蛋白酶抑制劑基因

淀粉酶抑制劑基因植物凝集素基因等

①-2抗蟲基因：①-3實例：轉(zhuǎn)基因抗蟲棉、玉米、大豆、水稻和馬鈴薯等。轉(zhuǎn)基因抗蟲棉01基因工程在農(nóng)牧業(yè)方面的應(yīng)用②轉(zhuǎn)基因抗病植物提高作物抗逆能力將某些病毒、真菌等的抗病基因?qū)胱魑?，培育出抗病作物。?1優(yōu)點：減少化學(xué)農(nóng)藥的使用、降低生產(chǎn)成本、提高產(chǎn)量②-2抗病基因：②-3實例：抗病毒轉(zhuǎn)基因甜椒、番木瓜和煙草等抗病毒的目的基因抗真菌的目的基因病毒外殼蛋白基因病毒復(fù)制酶基因幾丁質(zhì)酶基因抗毒素合成基因01基因工程在農(nóng)牧業(yè)方面的應(yīng)用②轉(zhuǎn)基因抗病植物提高作物抗逆能力易感（非轉(zhuǎn)基因）番木瓜品種被PRSV感染。在非轉(zhuǎn)基因番木瓜田的植物中沒有收獲果實。工程抗病毒木瓜領(lǐng)域完全免受PRSV感染。病毒外殼蛋白基因(CP)的機理a.在植物細胞中積累的外殼蛋白會將入侵的病毒核酸包裹，抑制核酸的復(fù)制和表達；b.抑制病毒脫外殼；c.外殼蛋白基因轉(zhuǎn)錄出的RNA和病毒RNA相互作用。01基因工程在農(nóng)牧業(yè)方面的應(yīng)用③轉(zhuǎn)基因抗除草劑植物提高作物抗逆能力抗草甘膦玉米抗草甘膦大豆實驗01基因工程在醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域的應(yīng)用干擾素是動物或人體受到病毒侵染后產(chǎn)生的一種細胞因子，是一種具有干擾病毒復(fù)制作用的糖蛋白，因此在臨床上常作為抗病毒的特效藥?！锷a(chǎn)過程01基因工程在醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域的應(yīng)用反芻動物乳腺人生長激素基因顯微注射01基因工程在食品工業(yè)方面的應(yīng)用阿斯巴甜天冬氨酸-苯丙氨酸利用基因工程菌除了可以生產(chǎn)藥物，還能生產(chǎn)食品工業(yè)用酶、氨基酸和維生素等。01

以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其與生物功能的關(guān)系作為基礎(chǔ)，通過改造或合成基因，來改造現(xiàn)有蛋白質(zhì)，或制造一種新的蛋白質(zhì)，以滿足人類生產(chǎn)和生活的需求。(教材P93黑體字)---第二代基因工程途徑目的蛋白質(zhì)工程蛋白質(zhì)工程的原理和利用02基因工程的局限性：原則上只能生產(chǎn)自然界已存在的蛋白質(zhì)。天然蛋白質(zhì)符合特定物種生存需要不一定符合人類生產(chǎn)、生活需要蛋白質(zhì)工程改造蛋白質(zhì)工程的原理和利用02干擾素改造干擾素（半胱氨酸）體外很難保存干擾素（絲氨酸）體外可以保存半年賴氨酸（人體必需氨基酸）玉米中含量較低蛋白質(zhì)工程改造蛋白質(zhì)工程的原理和利用02天冬氨酸激酶二氫吡啶二羧酸合成酶前體物質(zhì)賴氨酸玉米活性很低，造成賴氨酸含量較低天冬氨酸激酶（352位的蘇氨酸）二氫吡啶二羧酸合成酶（104位的天冬酰胺）天冬氨酸激酶（異亮氨酸）二氫吡啶二羧酸合成酶（異亮氨酸）改造