對羥基苯甲酸酯的HPLC分析

對羥基苯甲酸酯的HPLC分析二、HPLC簡介1967年,高效液相色譜法(high-performanceliquidchromatography,HPLC)正式問世。

高壓:流動(dòng)相為液體,為了能迅速通過色譜柱,必須對載液加高壓,300～600×105Pa。高速:分析速度快、通常分析一個(gè)樣品在15～30分鐘,有些樣品甚至在5分鐘內(nèi)即可完成,一般小于1小時(shí)。高效:分離效能高?？蛇x擇固定相和流動(dòng)相以達(dá)到最佳分離效果,比工業(yè)精餾塔和氣相色譜得分離效能高出許多倍。高靈敏度:紫外檢測器可達(dá)10-9g／mL,熒光檢測器可達(dá)

10-11g／mL

。3HPLC應(yīng)用廣泛由于HPLC分離分析得高靈敏度、定量得準(zhǔn)確性,特適于非揮發(fā)性和熱不穩(wěn)定組分得分析,因此,在醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)、生命科學(xué)、化工、環(huán)保等領(lǐng)域都有著廣泛得應(yīng)用。如氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸、碳水化合物、藥品、多糖、高聚物、農(nóng)藥、抗生素、膽固醇、金屬有機(jī)物等分析,大多就是通過HPLC來完成得。各種HPLC方法得應(yīng)用范圍及對象4液相色譜(HPLC)氣相色譜(GC)相同點(diǎn)色譜柱可反復(fù)使用,分離效能高,高靈敏度,進(jìn)樣量小,分析速度快,使用范圍廣分析對象高沸點(diǎn)、不穩(wěn)定得天然產(chǎn)物、生物大分子、高分子化合物、離子型樣品氣體、沸點(diǎn)較低、熱穩(wěn)定性好得化合物流動(dòng)相不同極性得液體(有一定親和作用)惰性氣體(無親和性,只起運(yùn)載作用)溫度一般室溫較高檢測器紫外吸收檢測器(光電二極管陣列檢測器),熒光檢測器,電化學(xué)檢測器,蒸發(fā)光散射檢測器,質(zhì)譜檢測器,示差折光檢測器氫火焰離子化檢測器(FID),熱導(dǎo)檢測器(TCD),氮磷檢測器(NPD),火焰光度檢測器(FPD),電子捕獲檢測器(ECD)等類HPLC與GC得比較Agilent1100儀器結(jié)構(gòu)圖手執(zhí)控制器檢測器柱溫箱自動(dòng)進(jìn)樣器泵脫氣機(jī)溶劑柜三、Agilent-1100液相色譜儀高壓輸液系統(tǒng):單元、雙元、

四元泵進(jìn)樣系統(tǒng):手動(dòng)、自動(dòng)分離系統(tǒng):C18、C8色譜柱檢測系統(tǒng):檢測器61、高壓輸液系統(tǒng)儲(chǔ)液器:0、5L～2L得玻璃瓶(白色、棕色)。脫氣裝置:將氣體從溶劑中除去,離線脫氣和在線真空脫氣。高壓輸液泵:恒壓泵、恒流泵恒流泵使用最廣泛,有單活塞和雙活塞往復(fù)泵。流量準(zhǔn)確、可調(diào),流速為0、5～2mL/min,泵最大流量范圍為5～10mL/min(排氣泡)。流動(dòng)相HPLC級溶劑水為超純水過濾(最大0、45μm,0、2μm最好)脫氣,尤其在低流速時(shí)相溶8液相色譜手動(dòng)進(jìn)樣器2、進(jìn)樣系統(tǒng)9準(zhǔn)備時(shí),流動(dòng)相直接進(jìn)柱,進(jìn)樣口1與定量管連接,樣品充滿定量管后,多余樣品從2流出。進(jìn)樣時(shí),泵將流動(dòng)相壓入定量管,將樣品全部攜帶進(jìn)入色譜柱分析。注射器10氣相色譜注射器得針頭為尖,液相色譜得注射器針頭為平,兩者不能混用。色譜柱就是液相色譜得心臟部件,她包括柱管與固定相兩部分。柱體為直型不銹鋼管,內(nèi)徑1～6mm,柱長１0～30cm,固定相粒徑5～10μm。發(fā)展趨勢就是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。色譜柱3、色譜柱反相柱------固定相通常就是以硅膠為基質(zhì),表面鍵合有極性相對較弱官能團(tuán)得鍵合相。樣品流出色譜柱得順序就是極性較強(qiáng)得組分最先被沖洗出,而極性弱得組分會(huì)在色譜柱上有更強(qiáng)得保留。

常用得反向填料有:C18(ODS)、C8(MOS)、C4(Butyl)、C6H5(Phenyl)等。大家有疑問的，可以詢問和交流可以互相討論下，但要小聲點(diǎn)正相柱------固定相通常為硅膠以及其她具有極性官能團(tuán)胺基團(tuán),如(NH2)和氰基團(tuán)(CN)得鍵合相填料。

由于硅膠表面得硅羥基(SiOH)或其她極性基團(tuán)極性較強(qiáng),因此,分離得次序就是依據(jù)樣品中各組分得極性大小,即極性較弱得組份最先被沖洗出色譜柱。14手性色譜柱-------就是由具有光學(xué)活性得單體,固定在硅膠或其她聚合物上制成手性固定相,來實(shí)現(xiàn)外消旋物得廣泛分離。特點(diǎn):具有專一性、通用性不廣。價(jià)格較貴。

紫外吸收檢測器(UltravioletVisibleDetector,UVD)目前在HPLC中應(yīng)用最廣泛得檢測器。包括:

可變波長紫外檢測器(VWD)二極管陣列檢測器(DAD)熒光檢測器(FluorescenceDetector,FD)示差折光檢測器(RefractiveIndexDetector,RID)4、液相色譜檢測器TheGoodUser下列優(yōu)良/常規(guī)實(shí)驗(yàn)操作能夠延長儀器壽命:流動(dòng)相和樣品進(jìn)行過濾。保證溶劑得相溶性。儀器使用完畢,沖洗整個(gè)系統(tǒng),去掉鹽份,防止污染。對儀器進(jìn)行定期維護(hù)和保養(yǎng)。定期使用甲醇或異丙醇沖洗系統(tǒng)。色譜過程:在有互不相溶得兩相——流動(dòng)相和固定相得體系中,當(dāng)兩相作相對運(yùn)動(dòng)時(shí),第三組分(即溶質(zhì)或吸附質(zhì))連續(xù)不斷地在兩相之間進(jìn)行分配得過程。由于流動(dòng)相、固定相以及溶質(zhì)混合物性質(zhì)得不同,在色譜過程中溶質(zhì)混合物中得各組分表現(xiàn)出不同得色譜行為,從而使各組分彼此相互分離。18四、基本分離原理色譜分析法得實(shí)質(zhì):不同溶質(zhì)分子因結(jié)構(gòu)不同而與流動(dòng)相及固定相得相互作用力不同,從而引起在色譜柱內(nèi)運(yùn)行過程中作用機(jī)理得差異。經(jīng)過柱內(nèi)多次作用得疊加后在宏觀上引起其在柱內(nèi)停留時(shí)間(保留時(shí)間)得差異,形成事實(shí)上得分離。19基本分離原理主要色譜類型分配色譜:液液分配色譜(Liquid-liquidpartitionchromatography)化學(xué)鍵合相色譜(Chemicallyboundedphasechromatography,CBPC)反相離子對色譜液-固吸附色譜(Liquid-solidadsorptionchromatography,LSAC)離子交換色譜(Ion-exchangechromatography)空間排阻色譜(Size-exclusionchromatography)親和色譜法(Affinitychromatography)分配色譜

反相分配色譜:流動(dòng)相極性＞固定相極性正相分配色譜:流動(dòng)相極性＜固定相極性反相:固定相:C18,C8流動(dòng)相:水,甲醇,乙腈等極性溶劑得混合溶劑適合極性小得芳香族化合物正相:固定相:-CN,-NH2流動(dòng)相:烷烴,異丙醇,四氫呋喃等得混合溶劑適合于極性差異大得化合物2223液相色譜流動(dòng)相液相色譜分析中,在紫外區(qū)有明顯吸收,可以利用紫外檢測器進(jìn)行檢測,其工作原理就是Lambert-Beer定律。24五、基本檢測原理定性定量分析得原理用標(biāo)準(zhǔn)物比對法定性:特定組分在同色譜條件下有不變得保留值(時(shí)間、體積等),可將之與已知純物質(zhì)得相應(yīng)保留值作比對得方法進(jìn)行定性分析。25三聚氰胺三聚氰酸豬肉中三聚氰胺和三聚氰酸的分析用外標(biāo)法定量:以不同量標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)樣得到峰面積,然后作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線,求出回歸方程,得到相關(guān)系數(shù)。然后進(jìn)樣得到被測試樣得峰面積從曲線中查到含量。方法適用于樣品復(fù)雜,但只對部分組分感興趣時(shí)。26定性定量分析得原理校正歸一化法定量:因不同組分得紫外吸收情況不同,等量樣品得吸光度值不相等。因而需要采用校正歸一化法定量:方法適用于樣品不很復(fù)雜,且部分組分都能流出色譜柱并在檢測器上有響應(yīng)時(shí)。27定性定量分析得原理Agilent-1100液相色譜儀:28四元高壓泵C18色譜柱手動(dòng)進(jìn)樣器可變波長紫外檢測器色譜工作站六、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容實(shí)驗(yàn)步驟——I打開計(jì)算機(jī)啟動(dòng)“bootp”文件,然后打開儀器電源建立計(jì)算機(jī)和儀器得連接。啟動(dòng)工作站(online),調(diào)整好流動(dòng)相流量和檢測波長,等待基線平直。29前期準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)步驟——II在甲醇:水=80:20、70:30、65:35得不同配比流動(dòng)相中分別取未知試樣25μL進(jìn)樣分析,記錄保留時(shí)間和各組分間得分離度,以分離度大于1、5且保留時(shí)間最短為原則選定最佳流動(dòng)相配比。注意:每次更換流動(dòng)相都需等待5min左右以平衡色譜系統(tǒng)。30條件試驗(yàn)I—流動(dòng)相配比實(shí)驗(yàn)步驟——III

在最佳流動(dòng)相配比條件下,以0、8、1、0、1、2mL/min不同得流動(dòng)相流速下取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液25μL進(jìn)樣分析,以同樣原則選定最佳流動(dòng)相流速。問題I:每次更換流動(dòng)相還需等待5min嗎？問題II:可以利用本步驟實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行定量校正因子得確認(rèn)嗎？