朊病毒結(jié)構(gòu)研究和致病機(jī)理分析

1、朊病毒結(jié)構(gòu)研究和致病機(jī)理分析摘要朊病毒病是人和動(dòng)物的一種退行性腦病，主要包括羊騷癢病，瘋牛病，以及人的克雅氏綜合癥等。其致病因子被認(rèn)為是一種由正常細(xì)胞PrP蛋白經(jīng)非正常折疊所形成的蛋白質(zhì)（PrPsc）。PrPsc和PrPc來自于同一基因具有相同的氨基酸序列，但在二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)上有很大的不同?？茖W(xué)界認(rèn)為朊蛋白是一種不含核酸和脂類的疏水性糖蛋白關(guān)鍵詞：朊病毒 PrPc PrPsc 重組朊蛋白 高級(jí)結(jié)構(gòu) 朊病毒（Prion Protein , PrP）是一種蛋白質(zhì)亞病毒，是只有蛋白質(zhì)而沒有核酸的病毒，形態(tài)特征為小型蛋白質(zhì)顆粒，大約有250個(gè)氨基酸組成，大小僅為最小病毒的1%。它是由動(dòng)物機(jī)體中高度

2、保守的朊病毒蛋白基因編碼的蛋白質(zhì)并能在機(jī)體的多種細(xì)胞中表達(dá)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)及神經(jīng)元細(xì)胞中表達(dá)量最高。朊病毒具有兩種不同的分子構(gòu)象：一種是存在于正常機(jī)體或感染動(dòng)物的細(xì)胞中，沒有致病作用，稱為細(xì)胞朊蛋白（PrPc）,另一種是僅存在于感染動(dòng)物的細(xì)胞中，稱為朊病毒蛋白（PrPsc）。兩種蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)完全相同，但二極結(jié)構(gòu)及高級(jí)結(jié)構(gòu)則有著顯著差異。此種病毒可導(dǎo)致庫(kù)魯病（Ku-rmm）、克雅氏綜合癥（CJD）、格斯特曼綜合癥（GSS）、致死性家族失眠癥（FFI）等常見人類疾病以及羊瘙癢病和瘋牛病等動(dòng)物疾病1。朊病毒的傳播途徑包括：使用動(dòng)物肉骨粉飼料、牛骨粉湯；醫(yī)源性感染，如使用腦垂體生長(zhǎng)激素、促性腺激素和

3、硬腦膜移植、角膜移植、輸血等。朊病毒特點(diǎn)是耐受蛋白酶的消化和常規(guī)消毒作用，由于它不含核酸，用常規(guī)的PCR技術(shù)還無法檢測(cè)出來。朊病毒的復(fù)制并非以核酸為模板，而是以蛋白質(zhì)為模板。斯坦利由于發(fā)現(xiàn)PrPSC（一普里朊）和PrPC具有相同的一級(jí)結(jié)構(gòu)而具有不同的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，打破了以往蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)決定高級(jí)結(jié)構(gòu)的定律，而獲得了1997年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)2。1982年普魯宰納提出了朊病毒致病的“蛋白質(zhì)構(gòu)象致病假說”，以后魏斯曼等人對(duì)其逐步完善。其要點(diǎn)為：1、朊病毒蛋白有兩種構(gòu)象：正常型PrPc和致病型PrPsc，兩者的主要區(qū)別在于其空間構(gòu)想上的差異。PrPc僅存在螺旋，而PrPsc有多個(gè)折疊存在，后

4、者溶解度低，且抗蛋白酶解；2、PrPsc可脅迫PrPc轉(zhuǎn)化為PrPsc，實(shí)現(xiàn)自我復(fù)制，并產(chǎn)生病理效應(yīng)；3、基因突變可導(dǎo)致細(xì)胞型PrPc中的螺旋結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，至一定量是產(chǎn)生自發(fā)性轉(zhuǎn)化，片層增加，最終變?yōu)镻rPsc型，并通過多米諾效應(yīng)倍增致病3。朊病毒的一級(jí)結(jié)構(gòu)PrP前體全長(zhǎng)為253個(gè)（人）264個(gè)（牛）氨基酸，分子質(zhì)量為3335KD。 PrP前體的N端的22個(gè)疏水氨基酸殘基為信號(hào)肽序列。C端的23個(gè)（人為22個(gè)）疏水氨基酸殘基是糖基磷酸肌醇結(jié)合位點(diǎn)（GPI）。這兩部分將通過翻譯后修飾水解除去，因此人的成熟PrP僅為中間的第23位第231位氨基酸共209個(gè)殘基組成的序列。N端的2395位氨基酸殘基之

5、間有一個(gè)富含組氨酸和甘氨酸的八肽重復(fù)區(qū)（PHGGGWGO）（5191位氨基酸），第96112位氨基酸序列是PrP的結(jié)構(gòu)控制區(qū)，113135位有一段跨膜區(qū)，135231位之間是3個(gè)束狀螺旋區(qū)域4。 成熟的PrP分子有兩個(gè)N型糖基化位點(diǎn)，分別為第181位和第197位的兩個(gè)天冬酰胺（Asn）殘基，在第179位和第214位的兩個(gè)半胱氨酸（Cys）殘基之間有一個(gè)二硫鍵，第183位和第192位的2個(gè)蘇氨酸（Thr）磷酸化序列一致，第145位的酪氨酸（Tyr）被硫化，第155位的酪氨酸是其磷酸化位點(diǎn)之一（除靈長(zhǎng)類及嚙齒類動(dòng)物之外），第147位第163位的氨基酸之間有一芳烴回文序列。 此外PrP含有3組不同的

6、短肽重復(fù)，第一組為6肽重復(fù)結(jié)構(gòu)；第二組為8肽重復(fù)結(jié)構(gòu)（PHGGGWGQ）（其中第一個(gè)重復(fù)是9肽：PQGGGGWGQ）；第三組是2個(gè)肽的串聯(lián)重復(fù)，與前面所提到的芳烴回文序列部分重合，所有這些重復(fù)似乎為PrP獨(dú)有2。研究發(fā)現(xiàn)PrP序列中的糖基化位點(diǎn)，形成二硫鍵的Cys位點(diǎn)和疏水的跨膜區(qū)最為保守。其次為N端的信號(hào)肽水解位點(diǎn)，C端的糖基磷酸肌醇結(jié)合位點(diǎn)（GPI）和螺旋結(jié)構(gòu)區(qū)域的序列，八肽重復(fù)序列極為保守，均為P（H/Q）GGG（G/-）WGQ，但不同物種之間的重復(fù)拷貝數(shù)有所不同。PrP經(jīng)過蛋白酶K水解后，其正常的PrPc被完全水解掉，而有侵染特性的PrPsc則被水解掉N端的67個(gè)氨基酸殘基和C端的25

7、個(gè)氨基酸，變?yōu)榉肿淤|(zhì)量只有2730KD的PrP2730。據(jù)研究推測(cè)蛋白酶K的N端切點(diǎn)位于富含G的八肽重復(fù)區(qū)域，在8990位點(diǎn)的G-W間的肽鍵斷裂。這種具有抗蛋白酶K功能的PrP27-30（PrP-res）的出現(xiàn)被認(rèn)為是朊蛋白病毒致病的關(guān)鍵5。一般認(rèn)為PrPc三維結(jié)構(gòu)形似“風(fēng)箏”，其N端存在著缺乏有序結(jié)構(gòu)的片段，這一結(jié)構(gòu)片段高度柔順，可以在溶液中隨意擺動(dòng)，猶如風(fēng)箏的“尾巴”，在其C端則含有3個(gè)螺旋，2個(gè)反向平行的-折疊及一個(gè)二硫鍵，有多處被糖基化、磷酸化、硫基化等化學(xué)修飾的氨基酸位點(diǎn)，結(jié)構(gòu)嚴(yán)密，形態(tài)固定，構(gòu)成一個(gè)球狀結(jié)構(gòu)區(qū)域，是一個(gè)自折疊單位，整體看來形似風(fēng)箏的頭和軀干。最近提出的BoPrP23

8、-230NMR結(jié)構(gòu)模型與HuPrP23-230NMR結(jié)構(gòu)模型高度相似，也說明了朊蛋白病的代表瘋牛病從牛傳染給人的可能5。PrPsc及其經(jīng)過蛋白酶水解后形成的PrP2730極為難溶，以往的變換紅外光譜（FTIR）和核磁共振（NMR）等方法已不可能研究及預(yù)測(cè)出其較為準(zhǔn)確的三維模型。因此在以上研究出的PrPc的結(jié)構(gòu)模型基礎(chǔ)上，人們?cè)噷⑵渲械牟糠致菪臑檎郫B，進(jìn)而探索其新的PrPsc結(jié)構(gòu)模型。PrPCPrPSC PrPSC在N端切割可以產(chǎn)生PrP27-30，這種分子是一種蛋白酶抗性蛋白，能夠聚集成為棒狀淀粉樣蛋白。二級(jí)結(jié)構(gòu)出現(xiàn)a 螺旋 b折疊轉(zhuǎn)換，PrPC的a螺旋含量達(dá)到42%， b片層僅占3%；Pr

9、PSC 的a螺旋含量降到30%， b片層達(dá)到45%；PrP27-30 a螺旋含量則僅為21%，而b片層達(dá)到54%。 具有大量的折疊的PrPsc溶解度會(huì)降低，抗蛋白酶水解能力會(huì)增強(qiáng)，在轉(zhuǎn)變過程中，唯一的二硫鍵仍保持完好，主要轉(zhuǎn)變部位在第90112位的氨基酸殘基之間6 ，b片層含量的增加可能是聚合成淀粉樣原纖維的最直接原因。Prusiner實(shí)驗(yàn)室的Wille最近提出了PrPsc的二維結(jié)晶結(jié)構(gòu)模型。這種模型顯示出跟以往不同的特點(diǎn)是螺旋不是轉(zhuǎn)變?yōu)檎郫B，而是轉(zhuǎn)變?yōu)槁菪?，整個(gè)二維結(jié)晶結(jié)構(gòu)模型呈六邊形結(jié)構(gòu)，N端的螺旋位于六角單元之內(nèi)，與位于六角形邊上的第二個(gè)螺旋和第三個(gè)螺旋及位于六角形單元之間的糖基相對(duì)稱7

10、。他的這個(gè)模型是通過電鏡發(fā)現(xiàn)的，結(jié)晶結(jié)構(gòu)只能在高分辨率的條件下被發(fā)現(xiàn)，光譜研究條件下折疊和螺旋是不能被區(qū)分的，所以這點(diǎn)差異在早期的研究中沒有被發(fā)現(xiàn)。朊病毒特殊的理化性質(zhì)1. 高壓蒸汽滅菌（134138）18分鐘不能使其完全滅活。2. 對(duì)紫外線（波長(zhǎng)254nm）照射的抵抗力比一般的病毒高40200倍，但是對(duì)237nm的紫外線敏感。3. 對(duì)一般的離子輻射和超聲波抵抗力很強(qiáng)。4. 對(duì)許多微生物有致死作用的一般化學(xué)消毒劑對(duì)朊病毒卻無法起到坡壞作用，如37的20%的福爾馬林溶液中可存活28個(gè)月。5. 對(duì)多種核酸酶（RNA酶和DNA酶）有抵抗作用，但可以被胰蛋白酶降解。這一點(diǎn)也證明了朊蛋白中不含有核酸。6

11、. 一些蛋白質(zhì)變性劑或氨基酸化學(xué)修飾劑對(duì)其具有滅活或抑制作用，如尿素、SDS等處理則使其失去活性。朊病毒獨(dú)特的生化特性1. 不形成包涵體，不含非宿主蛋白，不誘生干擾素，對(duì)干擾素也不敏感，不干擾其他病毒誘生干擾素，也不受普通病毒干擾。2. 不破壞宿主B細(xì)胞和T細(xì)胞的免疫功能，也不引起宿主的免疫反應(yīng)。3. 在電鏡下見不到其病原顆粒，但可檢測(cè)出癢病相關(guān)纖維（SCeapre Associate Fibrils，SAF）4. 朊蛋白病毒一旦致病，免疫增強(qiáng)劑和免疫抑制劑均不能改變致病過程。5. 朊蛋白病毒（PrPsc）在溫和的清潔提取物中大量聚合成癢病相關(guān)纖維（SAF）或短桿結(jié)構(gòu)，即在非變性去污劑中不溶，

12、而細(xì)胞朊蛋白（PrPc）則可以完全溶于其中，只以單體或是二聚體形式存在，故用核磁共振（NMR）和X光譜分析就可以檢測(cè)到PrPc的三維構(gòu)象，卻不能辨別PrPsc的構(gòu)象。6. PrPsc具有相對(duì)的抗蛋白酶水解特性，如在用蛋白酶K進(jìn)行水解時(shí)，PrPsc只被水解掉其N端的67個(gè)氨基酸殘基，形成PrP2730成為其致病的“先驅(qū)”。而PrPc則可被完全水解掉11，故PrPsc的半衰期特別長(zhǎng)，而PrPc的半衰期短。7. PrPsc和PrPc都依賴于磷酸肌醇磷脂酶結(jié)合位點(diǎn)（GPI）附著在細(xì)胞表面，經(jīng)過磷酸肌醇磷脂酶C（PUPLC）酶解后，PrPsc不能從膜上釋放，而PrPc則可以。用Trion X-114進(jìn)行

13、相分離后，PrPc處于水相。而PrPsc則處于Trion X-114相中。8. 用特異的抗體與朊蛋白反應(yīng)，PrPsc有血清反應(yīng)，而PrPc則沒有反應(yīng)。說明兩者的高級(jí)結(jié)構(gòu)是不同的8。阮病毒的致病機(jī)理阮病毒是一種只含有蛋白質(zhì)而不含核酸的分子生物并且只能在寄生宿主細(xì)胞內(nèi)生存。因此，合成阮病毒所需的信息有可能是存在于寄主細(xì)胞質(zhì)中，而阮病毒的作用，僅在于激活在寄主細(xì)胞中為朊病毒編碼的基因，使得朊病毒得以復(fù)制繁殖。另一種學(xué)說認(rèn)為朊病毒的蛋白質(zhì)能為自己編碼遺傳信息。這種假說與傳統(tǒng)的分子生物學(xué)中的“中心法則”是相違背的，因?yàn)殡貌《緵]有核酸。于是人們假設(shè)朊病毒復(fù)制可能的方法，一認(rèn)為是通過逆轉(zhuǎn)譯過程產(chǎn)生為朊病毒編

14、碼的DNA或RNA（如為RNA則還需進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄）必須存在逆轉(zhuǎn)譯酶，甚至還要有逆轉(zhuǎn)錄沒。二為蛋白質(zhì)指導(dǎo)下的蛋白質(zhì)合成，即蛋白質(zhì)本身可作為遺傳信息。宿主細(xì)胞的朊病毒蛋白能夠被轉(zhuǎn)化為錯(cuò)誤折疊且具有傳染性的PrPsc形式，并最終引發(fā)朊病毒疾病。如今，英國(guó)科學(xué)家通過開發(fā)出一種新的細(xì)胞體系，從而為研究朊病毒蛋白如何被轉(zhuǎn)化為錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)提供了新的視點(diǎn)。研究人員認(rèn)為，這一發(fā)現(xiàn)為朊病毒疾病藥物的研制鋪平了道路。為了更為詳細(xì)地研究朊病毒的轉(zhuǎn)化，倫敦大學(xué)學(xué)院的R. Goold和同事開發(fā)的朊病毒蛋白在羧基端表達(dá)了一個(gè)MYC標(biāo)簽。它們被轉(zhuǎn)染進(jìn)入一個(gè)易感朊病毒的小鼠細(xì)胞系該細(xì)胞系內(nèi)生的朊病毒蛋白已被“沉默”了。研究人

15、員發(fā)現(xiàn)，被MYC標(biāo)記的結(jié)構(gòu)在野生型水平上被表達(dá)并且正常地局部化，同時(shí)在暴露于朊病毒的情況下會(huì)完全轉(zhuǎn)化為MYC標(biāo)記的PrPsc。為了證實(shí)這些細(xì)胞在產(chǎn)生具有傳染性的朊病毒，它們的提取物被用來感染小鼠，后者隨后發(fā)展出了神經(jīng)病理類型的朊病毒疾病。之前的研究表明，重新合成的PrPsc在暴露于傳染物質(zhì)72小時(shí)（或更長(zhǎng)）后將會(huì)出現(xiàn)。有趣的是，研究人員發(fā)現(xiàn)，一些MYC細(xì)胞會(huì)在兩個(gè)小時(shí)內(nèi)積聚成PrPsc，并且實(shí)際上僅僅1到2分鐘的暴露便足以導(dǎo)致轉(zhuǎn)化。因此研究人員指出，轉(zhuǎn)化比之前的認(rèn)識(shí)快得多。 質(zhì)膜暗示了朊病毒轉(zhuǎn)化的位點(diǎn)，事實(shí)上，在細(xì)胞暴露于傳染物質(zhì)僅1分鐘的時(shí)間里，PrPsc僅僅出現(xiàn)于質(zhì)膜上。然而，細(xì)胞內(nèi)的Pr

16、Psc在暴露2分鐘后才被發(fā)現(xiàn)，這意味著它被迅速內(nèi)吞，并輸送進(jìn)入細(xì)胞。實(shí)際上，PrPsc在細(xì)胞內(nèi)的位置被發(fā)現(xiàn)依賴于暴露的時(shí)間長(zhǎng)度，即PrPsc在最早的時(shí)間點(diǎn)被特有地置于質(zhì)膜上，并隨后分布在細(xì)胞內(nèi)部。為了證明朊病毒轉(zhuǎn)化能夠發(fā)生在質(zhì)膜上，研究人員抑制了內(nèi)吞作用，這并沒有防止PrPsc的形成。重要的是，在經(jīng)過特定磷酸肌醇磷脂酶C或完全破壞脂筏的介質(zhì)處理后，PrPsc的水平在MYC細(xì)胞中顯著下降。因此，最初的朊病毒轉(zhuǎn)化似乎首先發(fā)生在質(zhì)膜上，或許也在脂筏中。然而，通過在PrPsc被內(nèi)吞后加速轉(zhuǎn)化，細(xì)胞內(nèi)的分隔可能在其中扮演了一個(gè)角色9。人工重組朊蛋白的成功，一方面，使原本一直爭(zhēng)論不休的國(guó)際學(xué)術(shù)界，在“朊病

17、毒”假說上有了理論突破。它表明了，蛋白質(zhì)也能夠進(jìn)行信息遺傳。因?yàn)殡貌《緵]有核酸亦沒有能夠自行運(yùn)作的完整系統(tǒng)，但卻能夠侵入并掠奪周邊細(xì)胞，將其也感染成病毒，從而進(jìn)行大規(guī)模的細(xì)胞破壞。于是人們假設(shè)朊病毒可能是通過蛋白質(zhì)指導(dǎo)下的蛋白質(zhì)擴(kuò)增，即蛋白質(zhì)本身可作為遺傳信息。另一方面，“朊病毒”假說得到論證，可能催生出生物醫(yī)學(xué)研究的一個(gè)新領(lǐng)域蛋白質(zhì)變化的誘導(dǎo)機(jī)制。即在論證了蛋白質(zhì)本身可作為遺傳信息的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步證明并非只有朊蛋白才可能誘變成朊病毒，別的蛋白質(zhì)也可能存在相似的轉(zhuǎn)變，那么，在其它神經(jīng)退行性疾病，如老年癡呆、帕金森病等是否存在類似機(jī)制，引起了人們的廣泛關(guān)注。從現(xiàn)實(shí)意義來說，它有助于發(fā)展準(zhǔn)確可靠的

18、診斷技術(shù)，全面監(jiān)測(cè)、檢測(cè)朊病毒病，特別是做到對(duì)瘋牛病和醫(yī)源性感染的早期預(yù)防。由于假說得到論證，科學(xué)家們現(xiàn)在正著手研制一種快速檢測(cè)試劑，以便檢測(cè)出進(jìn)出口的牛羊畜肉上是否含有會(huì)使人傳染瘋牛病的“朊病毒”。另外，這一研究成果也是首次建立了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。在小鼠身上進(jìn)一步試驗(yàn)，以了解更多朊病毒的相關(guān)情況。根據(jù)目前報(bào)道，因鼠和人的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)差異大，存在一定的種屬屏障，人鼠不會(huì)互相傳染。參考文獻(xiàn)1. 趙克霞 朊病毒研究新進(jìn)展 淮南師范學(xué)院學(xué)報(bào) 2002年第3 期第四卷（總第15期）2. 奚正德，馬寶驪 毒朊，感染的一種新的生物學(xué)原理-1997年度諾貝爾生理/醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)評(píng)析（J）.cell,1985,40(4,) 735-7463. Prusiner, S. B. (1998). Prions. Proc Natl Acad Sci USA 95(23),13363-83.4. 何鳳田 朊 病 毒 研 究 進(jìn) 展 .生命的化學(xué) 2001年21 卷第6 期 5. 侯佩強(qiáng),田承業(yè),李克利 朊病毒及朊病毒病 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2002-04, 33（2）：15-156. 黃銀霞,董小平 PrPc轉(zhuǎn)化成PrPsc的影響因素研究進(jìn)展 國(guó)外醫(yī)學(xué)病毒學(xué)分冊(cè)2005年6月第12卷第3期 Section Virology Foreign Med Sci, June 2005