第十三章基因工程.ppt

1、1.教學目的和要求 （1）掌握基因工程的基本原理 （2）學習基因工程的基本內容和技術 （3）掌握內切酶、連接酶的功能 2.教學重點 （1）掌握基因工程的基本原理和技術 （2）學習目的DNA的分離,第十三章基因工程,第十三章基因工程（Gene Engineering）,在各種酶的作用下，將目的基因的DNA分子與載體DNA分子相連接，形成重組的DNA分子，以一定的方式導入原無該類分子的宿主細胞，并使宿主生物變?yōu)樽匀唤缭瓉頉]有并能連續(xù)傳代的新生物。 要點： 供體、載體、受體 基因工程分狹義（上游）：重組、克隆、表達的設計和構建。 廣義（下游）：表達工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)和產物的純化。 目的：DNA擴增，外

2、源基因表達產物，表達調控，改造生物遺傳特性等。,基因工程,限制性內切酶和載體是基因工程的眾多理論與技術基礎中最重要的基石。 基因工程的基本步驟可概括為： 目的基因的獲得(基因克隆)； 目的基因與載體連接(DNA分子重組)； 重組DNA分子導入受體； 轉化子的篩選、鑒定。,限制性內切酶與DNA連接酶,細菌細胞內特異性降解外源(異源)核酸分子的核酸酶。其作用： 特異性降解異源DNA分子(甲基化修飾差異)； I類限制酶隨機切割雙鏈DNA分子，II類限制酶識別、切割特殊的回文(對稱)序列； II類限制酶交錯切割DNA雙鏈，產生粘性單鏈末端。 來源不同、具有相同粘性末端DNA片段在DNA連接酶的作用下可

3、準確連接成重組DNA分子。 通常使用來自T4噬菌體DNA連接酶。 重組DNA技術是基因工程最核心的技術。,載體(vector),用于承載、克隆、轉移目的基因(DNA片段)，能自我復制的DNA分子。 在基因克隆時：將目的片段轉移到宿主細胞中進行復制克隆克隆載體； 在基因導入受體時：將目的片段轉移到受體細胞中并進行使之表達轉化載體或表達載體。,常用基因工程載體有： 細菌質粒(克隆)； 噬菌體(克隆)； 柯斯質粒(克隆)； 穿梭質粒(克隆/表達)； 細菌人工染色體(克隆/表達)； 酵母人工染色體(克隆/表達)； Ti質粒及其衍生載體(轉化)。,(一)、目的基因的獲得,基因工程最主要的特點是其定向性，

4、也就是對特定的基因進行操作。因此分離目的基因并獲得足夠的拷貝數(shù)(基因克隆)是基因工程及相關研究工作的前提。 1. 基因庫構建與目的基因分離； 2. PCR擴增、克隆基因； 3. 基因合成(化學法、酶促法)。 獲得目的基因后可進行的研究還包括：序列分析、結構分析、表達機制以及表達機制研究。,克隆的含義,名詞(pl. clones)：克隆、無性(繁殖)系。 生物個體、細胞的無性繁殖系； 同一基因或DNA片段的多份拷貝。 動詞(cloning)：克隆。 細胞克?。簭膯蝹€細胞產生一組具有同樣遺傳組成的細胞； 分子克?。韩@得單個基因/DNA片段多份拷貝。常用的方法有將帶有目的片段的重組DNA分子導入到特

5、定宿主細胞中，利用宿主細胞DNA復制系統(tǒng)進行復制；利用DNA聚合酶在無細胞系統(tǒng)中復制(PCR, 聚合酶鏈式反應)。,基因庫構建與目的基因分離,基因庫(基因文庫)：包含特定基因組所有基因、DNA區(qū)段的全部分子克隆的集合體。 根據分子克隆中所含核酸片段的類型，基因庫可分為：核基因庫、染色體庫、cDNA庫和線粒體庫等。 構建基因庫的基本過程以及從基因庫中篩選含目的基因克隆(亞克隆)的方法。,(二)、轉基因受體,受體的種類和特性對目的基因導入、導入后篩選、受體的再生等都有很大的影響。 植物基因工程常用受體：組織、器官、懸浮培養(yǎng)細胞、未成熟胚、合子以及原生質體等?？煞謩e通過器官發(fā)生、胚狀體或直接發(fā)育形成

6、轉基因植株。 動物基因工程受體主要有兩類：一是受精卵或早期胚胎，發(fā)育形成轉基因動物。轉基因動物獲得的性狀可以穩(wěn)定的遺傳，表明外源基因可以整合到受體的染色體上。另一類受體是體細胞無性系。,(三)、目的基因導入受體,將目的基因導入受體，并整合到受體染色體上是基因工程目標實現(xiàn)的關鍵環(huán)節(jié)。 在基因工程研究領域的人們傾向于把所有將外源基因導入受體的過程稱為轉化，將接受外源基因并整合到染色體上的細胞、個體稱為轉化體/轉化子。 最常用轉化方法是： 載體導入； 理化方法導入(微注射、基因槍、電穿孔法、化學法)； 還有一種特殊的方法是將外源總DNA導入植物。,1. 載體法導入外源基因,載體法將目的基因連接到特定

7、的載體(轉化載體)上，利用載體進入細胞并整合到受體染色體上的能力實現(xiàn)外源基因轉化。 Ti質粒及其衍生載體是最常用的植物基因工程轉化載體，具有導入外源基因并整合到染色體上的能力。 將目的基因與載體連接的過程就是重組DNA分子構建的過程。 將含有轉化載體(重組DNA分子)的根癌農桿菌與受體共培養(yǎng)就可以實現(xiàn)轉化。,2. 理化方法導入外源基因,理化方法是采用物理、化學方法使受體細胞膜產生局部破損或缺陷，被動吸納外源DNA片段。 (1)微注射/顯微注射。顯微鏡下用注射器將DNA片段注入受體細胞(動物受精卵)。：0.5-10m尖頭玻璃管。 (2)基因槍。將DNA片段(載體)包在鎢或金微粒表面(1-3m)，

8、用靜電或火藥爆炸等驅動微粒射入受體。 (3)電穿孔法。將受體細胞置于脈沖電場中，可以使細胞膜產生短暫的(30nm)左右的微孔，吸收DNA片段。 (4)化學法。如PEG(聚乙二醇)可以刺激原生質體產生吸收DNA片段。 常用PEG與電穿孔法結合，提高外源DNA的吸收率。,*3. 外源總DNA導入植物,國內生物科技工作者受基因工程在從分子水平進行基因轉移的啟發(fā)，設計了一些外源DNA導入植物的方法。 下述兩種方法均是采用供體植物的全部DNA提取物作為操作材料，省去了目的基因獲得的過程，所以稱為外源總DNA導入。 減壓滲透法 花粉管通道導入法,*(四)、轉化體的篩選與鑒定,轉化體篩選： 根據轉基因技術設

9、計進行，如：載體上帶有特異性狀標記，特別是某種抗生素抗性等。 轉化體鑒定有兩個層次： 目的基因是否進入受體(可以是大腸桿菌、酵母、植物或動物)，得到轉化體。 常用方法：限制性酶譜分析、核酸分子雜交、核酸序列測定、序列分析、RFLP等一切可鑒定特定DNA片段的方法。,基因工程的特點：從分子水平出發(fā)，以DNA為操作對象，直接對基因進行操作。 基因工程的意義： 基因工程的成就與展望： 原核生物 真核生物 轉基因動物 轉基因植物,*二、染色體工程,染色體工程是物種間遺傳轉移的最傳統(tǒng)的方式，也是目前廣泛進入生產應用的遺傳工程。利用染色體替換來改變生物遺傳特性，如利用染色體的易位、缺體、三體等方法，獲得新

10、的染色體組合。 其重要性因作物不同而異： 對蕃茄而言，世界上任何具有商業(yè)價值的栽培品種都帶有一個從野生種導入的抗枯萎病性狀，其它六個野生種則是耐鹽性、抗蟲性等性狀的來源。 小麥許多抗白粉病基因和抗銹病基因都來源于其野生近緣物種。 相反，蠶蟲改良則完全是在栽培種內進行雜交選擇?，F(xiàn)在還不能從其它任何種導入基因到該作物中。,(一)、 種間有性雜交,生殖隔離是物種形成的原因之一，也是染色體工程面臨的第一個難題，獲得種間有性雜種的難易直接影響外源基因導入栽培作物。 對不同的作物而言，種間雜交障礙的機制可能截然不同，其表現(xiàn)階段也各不相同。目前認為，種間雜交產生雜種的障礙可能表現(xiàn)在以下幾個階段： 受精前柱頭

11、和花柱中的障礙； 受精過程中的障礙； 受精后胚與種子發(fā)育過程中的障礙。,受精前障礙與克服,障礙機制： 物種間花粉管與雌蕊不親和，在花粉管到達胚珠之前，停止伸長而不能受精。 主要克服辦法： 主要是選擇適當?shù)氖诜蹠r期，采用正反雜交、蒙導授粉、植物生長調節(jié)劑等。 另外，有明確試驗證據表明，栽培物種和野生種內均存在可雜交性遺傳變異，并受簡單遺傳控制。利用可雜交性基因，能提高種間雜交的效率。,受精過程的障礙與克服,被子植物受精過程屬于雙受精，對種間雜交受精過程的生殖生物學研究表明：種間雜交的失敗往往是由于雙受精之一失敗引起的。 訖今為止，人們對受精的控制機制知之甚少，所以這一領域明顯是一個有風險，但又極

12、可能富有成效的研究領域。,受精后發(fā)育障礙與克服,受精過程的障礙機制： 受精胚珠發(fā)育過程中也經常由于胚、胚乳和母本組織發(fā)育異?；虬l(fā)育不平衡而最終不能產生種間雜種種子。 克服方法： 常用技術是從生理角度進行調節(jié)，如：采用植物生長調節(jié)劑或去除母本植株的營養(yǎng)生長中心。 提高親本倍性水平，可能有利于胚珠發(fā)育。 通過離體培養(yǎng)方法可以挽救可能(即將)敗育的雜種胚。,(二)、雙二倍體的合成,獲得種間雜種不一定就能在物種間進行遺傳轉移。物種間的不親和性不僅表現(xiàn)在受精前、受精及受精后各過程中；親緣關系較遠的物種間雜種往往存在不同程度不育性；因而難以進行基因轉移。事實上許多種間雜交試驗都僅限于獲得雜種F1。 加倍雜

13、種染色體數(shù)目，雙二倍體中親本染色體均成對存在，可能產生可育配子； 穩(wěn)定雙二倍體可作為新物種直接用于生產。但由于合成雙二倍體往往常有野生種的不利性狀，農藝價值降低。,(三)、 削減、添加、代換、易位,絕大多數(shù)雙二倍體遺傳不穩(wěn)定，在種間雜種及其雙二倍體基礎上，人們設計了許多染色體操作方案，以導入外源目的基因，并盡可能避免導入對受體有害的遺傳物質。理想的情況是只摻入目的基因，而排除外源物種的其它基因。 由于遺傳重組可能性有限，所以導入整條染色體(異附加系、異代換系)是利用外源基因的一種重要方式。 外源染色體上連鎖的不利基因往往極大地限制附加系和異代換系的利用價值，因而可以采用：輻射、遺傳、單體附加等

14、方式誘導外源染色體與栽培物種染色體易位。,(四)、 染色體工程中的現(xiàn)代技術,在傳統(tǒng)遠緣雜交的基礎上采用的現(xiàn)代技術主要是： 離體胚(子房)培養(yǎng)技術； 植物染色體顯帶技術； 染色體分子原位雜交技術等。 染色體工程仍然是外源基因轉移最有效、最接近實際應用的技術。,*三、細胞工程,利用細胞的全能性，采用組織與細胞培養(yǎng)技術對動、植物進行修飾，為人類提供優(yōu)良品種、產品和保存珍貴物種。主要包括體細胞融合，核移植，細胞器攝取和染色體片段的重組等。 細胞工程主要技術和研究領域包括： 細胞、原生質體的分離、培養(yǎng)； 細胞、原生質體植株再生； 體細胞無性系變異的誘導、篩選與應用； 以細胞、原生質體作為基因工程受體；

15、細胞、原生質體融合、雜種細胞篩選、鑒定與應用。,(一)、細胞、原生質體植株再生,采用體細胞雜交在物種間進行遺傳轉移與應用的必要條件是：細胞、原生質體遺傳全能性能充分實現(xiàn)，再生成新的生物個體。 植物：細胞和原生質體再生技術已經比較成熟。 曾經是人們公認難題的禾本科植物原生質體再生在近二十多年來也已取得巨大進展。 動物： “多利”的誕生表明，動物細胞(包括人體細胞)再生成為個體都是可能，其技術實現(xiàn)需要的僅僅是時間。,(二)、植物原生質體作為基因工程的受體,最初常用的轉基因受體有葉圓片、幼胚、愈傷組織等植物組織器官。 在這些組織、器官中： 細胞壁的存在會增加操作的難度； 產生細胞嵌合體現(xiàn)象，難以篩選

16、轉化子。 因此原生質體是最具潛力的植物基因工程受體，轉化效率高、篩選方便。,(三)、細胞、原生質體融合,體細胞融合是指兩個不同種類的細胞，加上融合劑，在一定條件下，彼此融合成雜交細胞，使來自兩個親本細胞的基因有可能都被表達，這就打破了遠緣生物不能雜交的屏障，提供了創(chuàng)造新物種的可能。 動物細胞不具有細胞壁，細胞融合技術較植物成熟和成功，但局限于獲得雜種細胞及其無性細胞系。 用雜種細胞核代替維爾穆特獲得克隆羊所采用的乳腺細胞核可以獲得物種間雜種生物個體。如今已在動物間實現(xiàn)了小鼠和田鼠，小鼠和小雞，甚至于小鼠和人等許多遠緣和超遠緣的體細胞雜交。 人與小鼠雜種細胞的無性細胞系曾在人類基因染色體定位研究上發(fā)揮重要的作用。,植物細胞融合由于細胞壁的存在而受到極大的限制。因此，去除細胞壁分離原生質體的技術是植物細胞雜交的基礎。獲得雜種細胞及其再生植株后，即可進行物種間細胞核、染色體以及細胞器的轉移。植物間的體細胞融合所得到的雜交細胞，已達到了完整的植株水平，獲得了新的雜交植物，如 “西紅柿馬鈴薯”、“擬南芥油菜”和“蘑菇白菜”等。,（四）細胞核移植,細胞核移植對動物優(yōu)良雜交種的無