基因敲除技術及其進展

1、基因敲除技術研究進展及其在代謝工程上的應用The Current Status of Gene Knockout and its Application in Metabolic Engineering天津大學化工學院二零壹六年六月摘 要基因敲除技術是20世紀80年代發(fā)展起來一項重要的分子生物學技術，在微生物代謝工程，動植物改造以及功能基因研究方面具有廣泛的應用。本文介紹了基因敲除的策略和在代謝工程中的作用，著重介紹了四種新興的基因敲除策略：RNAi，ZFN，TALENs以及最近研究火熱的CRISPR/Cas9。并在最后展望了基因敲除技術尤其是新興技術在相關領域的發(fā)展趨勢，為基因敲除技術的進一

2、步發(fā)展提供了參考。關鍵詞： 基因敲除 代謝工程 同源重組 CRISPR/Cas9 ABSTRACTGene Knockout is an important molecular biotechnology which has developed sine 1980. It has been proved efficient in microbial metabolic engineering, transform of nimals and plants and functional genomics. In this review, we mainly introduced the stra

3、tegies of gene knockout and its application in metabolic engineering.And four new strategies RNAi, ZFN, TALENs and CRISPR/Cas9 were highlighted in detail. At last, developing frontiers and application prospects of gene knockout were further discussed.KEY WORDS：gene knockout, metabolic engineering, h

4、omologous recombination, CRISPR/Cas9目 錄第一章 基因敲除技術11.1基因敲除相關背景11.2基因敲除技術在代謝工程中的應用2第二章 基因敲除策略32.1傳統(tǒng)的基因敲除策略32.1.1利用同源重組進行基因敲除32.1.2利用隨機插入突變進行基因敲除42.2新興的基因敲除策略52.2.1 利用RNA干擾引起的基因敲除52.2.2 鋅指核酸酶基因打靶技術52.2.3 TALENs 靶向基因敲除技術62.2.4 CRISPR/CAS9基因敲除技術7第三章 前景展望9參考文獻10致謝11第一章 基因敲除技術1.1基因敲除相關背景隨著測序技術的迅速發(fā)展，生物體基因功能

5、的研究已經(jīng)成為當下最熱門的課題?，F(xiàn)階段基因功能的研究主要是通過減弱或中止某一基因表達，觀察生物體整體功能變化，推測該基因的相關功能，然后將基因與生物整體功能相關聯(lián)進行深入探究，為最終確定基因功能提供依據(jù)1。隨著功能基因組學研究的深入，相關技術也得到不斷地發(fā)展與完善，其中最為常用的便是基因敲除技術。基因敲除是20世紀80年代末發(fā)展起來的一門新技術，2007年獲得諾貝爾生理或醫(yī)學獎1。該技術是以DNA同源重組技術和胚胎干細胞技術為基礎， 經(jīng)過30余年的發(fā)展，現(xiàn)今已經(jīng)有多種基因敲除技術被應用于分子生物學、遺傳學等諸多領域2。而近年來新興起了ZFNs、TALENS、Cas9等多種基因高效靶向修飾和調控

6、技術。2012年1月基因組編輯核酸酶技術的Nature Methods雜志評選為年度研究方法3。2012年12月被Science雜志評為2012年度十大科學進展之一4。這些技術極大地提高了基因敲除的效率，且具有極高的特異性，為研究基因功能創(chuàng)造了新的途徑必將極大地推動生物學、醫(yī)學研究的發(fā)展?；蚯贸夹g分為完全基因敲除和條件型基因敲除。完全基因敲除是指通過同源重組法完全消除細胞或者動物個體中的靶基因活性。條件型基因敲除是指通過定位重組系統(tǒng)實現(xiàn)特定時間和空間的基因敲除5?，F(xiàn)階段條件型基因敲除以噬菌體的Cre/Loxp系統(tǒng)和釀酒質粒的FLP/FRT系統(tǒng)應用最為廣泛?；蚯贸夹g已從最初簡單的完全敲除

7、發(fā)展到條件敲除階段，現(xiàn)正朝著特定組織基因敲除、特定時間基因敲除的可調控敲除方向發(fā)展。然而，基因敲除也有其無法克服的缺點和不足：1）在敲除過程中，被破壞的常常只是靶基因的部分外顯子而并不是整個編碼區(qū)，殘留的編碼序列有可能組合出新的未知的功能，這將給表型分析帶來麻煩；2） 敲除掉某個基因并不一定就能獲知該基因的功能，其原因在于許多基因在功能上是冗余的，敲除掉一個在功能上冗余的基因，并不能造成容易識別的表型，因為基因家族的其它成員可以提供同樣的功能；3）對于某些必需基因，敲除后會造成細胞死亡，也就無法研究這些必需基因的功能；4）實驗費用偏高，同一個打靶載體在不同遺傳背景下進行基因敲除，獲得的表型差異

8、很大6。1.2基因敲除技術在代謝工程中的應用具體而言，代謝工程是利用基因工程技術或其他物理、化學方法對細胞的代謝途徑進行精確地修飾與改造，對細胞內目標物質的代謝流進行擴展、減小、阻斷或構建新的代謝途徑，從而有目的、有理性地改變微生物原有代謝特性，改進或者構建新的微生物表型，并與微生物基因調控、代謝調控及生化工程相結合，提高目的代謝產物活性或產量、或合成新的代謝產物的工程技術科學7。代謝工程的難題就是如何使微生物的代謝主流流經(jīng)理想載流途徑。在發(fā)酵生產中, 為了達到這一目的，從營養(yǎng)物質進入細胞到產物產生通常需要從三個方面加以控制8，即：a. 使來自上游和各個注入分支的碳架物質能暢通地流向目的產物；

9、b. 阻塞或去除與目的產物的形成無關或關系不大的代謝支流，使碳架物質相對集中地流向目的產物；c. 消除或削弱目的產物進一步代謝的途徑。在上述各過程中，起關鍵作用的無疑是酶，而基因敲除技術的出現(xiàn)使快速失活成為現(xiàn)實，從而達到調節(jié)代謝流，優(yōu)化代謝途徑的目的。通過基因敲除技術，可研究被敲除基因的生物學功能，還可以進行功能基因的插入及染色體基因的替換，進而可以阻斷微生物細胞的代謝旁路，減弱毒/副作用，強化目標產物的產量或質量，降低能耗，從而成為具有重要工業(yè)應用價值的微生物細胞工廠研究中的重要內容9。第二章 基因敲除策略以下本文將通過兩個方面講述基因敲除技術，一是傳統(tǒng)的基因敲除策略；二是新興的基因敲除策略

10、。并對這些策略做一些簡單介紹以及概括。2.1傳統(tǒng)的基因敲除策略2.1.1利用同源重組進行基因敲除經(jīng)典的基因敲除策略是利用上述同源重組基本原理，通過體外改造一定長度/形式的基因，與細胞染色體上的靶基因發(fā)生同源重組 (插入或置換)，從而改變細胞的遺傳特性。從同源重組的基本原理出發(fā)，分別針對同源重組的底物類型 (單鏈/雙鏈、線性/環(huán)狀)、重要蛋白 (RecA 酶、RecBCD 酶等及噬菌體中具有相似功能的酶) 和功能位點 (Chi 位點) 等進行分子設計，即可開發(fā)出各種不同的基因敲除方法，根據(jù)同源重組載體的不同，可以把基因敲除方法分為線性單鏈 DNA (ssDNA)、線性雙鏈 DNA(dsDNA)

11、以及環(huán)狀雙鏈DNA (質粒載體) 等3類：1. 線性單鏈 DNA 敲除策略不但打靶載體易于構建，且其重組效率是雙鏈 DNA的10100倍10；2. 采用線性雙鏈DNA進行同源重組，是近年來基因敲除方法的熱點之一。其優(yōu)點是可以避免較為繁瑣的基因克隆和質粒載體構建步驟，而直接采用PCR方法擴增獲得目標同源重組片段。然而，線性雙鏈DNA 易于被細胞內的 RecBCD 酶降解，為了解決上述問題，可以在線性雙鏈 DNA 的兩側引入Chi位點，保護DNA不被 RecBCD 酶降解，并能強化RecBCD 酶介導的同源重組效率11。3. 構建環(huán)狀質粒載體進行目標基因敲除的方法，是實現(xiàn)微生物基因敲除的經(jīng)典策略，

12、主要通過微生物 本 身 的 RecA 重 組 系 統(tǒng) ( 主 要 包 括 RecA 和RecBCD 等蛋白) 發(fā)揮作用。RecA 蛋白是單鏈結合蛋白，促進各類 DNA 分子間的同源聯(lián)會、配對、鏈交換和分支遷移RecBCD 是由 RecB、 RecC 和 RecD三個蛋白組成的復合體，它能與雙鏈切口結合使DNA 鏈解開，并在Chi位點形成單鏈，然后由RecA蛋白促進同源重組。由于RecBCD 具有核酸外切酶V的活性，所以線性DNA 分子在細菌體內會被降解。因此，必須通過環(huán)狀質粒載體克隆來完成同源重組片段的分子設計和構建9。常用的環(huán)狀質粒載體敲除策略有4種12：a. 非復制型質粒載體敲除法對野生菌

13、做基因敲除，可以先考慮用非復制型載體。由于構建好的敲除載體在受體菌中是不復制的，因此轉化之后，在選擇壓力下，未發(fā)生重組的轉化子由于敲除載體不能復制隨著菌體生長而被稀釋。b. 不穩(wěn)定型質粒載體敲除法若受體菌感受態(tài)較難制備，可考慮采用不穩(wěn)定型敲除載體。這種質粒在受體菌中分配不穩(wěn)定 ,在無壓力選擇或低磷條件下培養(yǎng)510代會出現(xiàn)很多質粒丟失的細胞。因此轉化后可先控制培養(yǎng)條件使敲除載體隨細胞復制以增加轉化子的數(shù)目，然后再在無壓力選擇或低磷條件下讓質粒丟失，最后在選擇壓力下篩選敲除子。c. 溫度敏感型 ( Ts型) 質粒載體敲除法 1993年，Biswas等13利用Ts型質粒建立了革蘭氏陽性菌高效的基因敲

14、除系統(tǒng)。Biswas所用質粒pG+host5在37時不復制，而28時以滾環(huán)模式進行復制。因此轉化后在選擇壓力下37培養(yǎng)會導致第一次同源重組sco(single-crossover)，之后將溫度降至28，會促使質粒發(fā)生滾環(huán)復制，這種復制機制會導致發(fā)生第二次dco(double-cross-over)。重組后，目的基因或是被敲除，或是回復成野生型。d. 結合轉化敲除法如果要進行基因敲除的目標菌不易制備感受態(tài)或感受態(tài)效率很低，則可以通過尋找“中介菌”來完成基因轉移的過程。2.1.2利用隨機插入突變進行基因敲除大規(guī)模的隨機插入突變理論上可實現(xiàn)在基因組范圍內敲除任一基因。這項技術具有效率高、基因完全失活

15、以及容易分離鑒定等優(yōu)點。目前較為有效的方法是隨機插入突變可以分為T-DNA插入突變和轉座子插入突變，兩者是在植物中使用廣泛的基因敲除手段：AT-DNA插入失活技術是利用根癌農桿菌T-DNA介導轉化，將一段帶有報告基因的DNA序列標簽整合到基因組DNA上?？梢灾苯釉谥参锘蚪MDNA中產生穩(wěn)定的插入突變，而且插人位點的隨機性較強，但是只適用于那些容易被T-DNA轉化的植物，且常常會引起染色體重排現(xiàn)象，使突變體表型與T-DNA插入無關而難以進行遺傳學分析。這種方法在擬南芥中可產生3540的突變率，19的突變體具有外觀可察覺到的表型特征。B轉座子插入突變是利用轉座子在染色體上可移動的特點，當其跳躍插入

16、到某個功能基因時，就會引起該基因的失活，并誘導產生突變型。植物特別適合于轉位插入突變，因為獲得的基因突變可以保留在雜合子的植株中，而通過Fl代植株自交產生的F2代植株中可獲得純合子的突變體植株。利用轉座子進行基因敲除具有很大便利，僅需已知外顯子，載體構建簡單，可攜帶多種不同抗性基因，同時處理多基因14。轉座子插入突變只適用于存在內源活性轉位子的植物種類，但這樣的植物并不多。2.2新興的基因敲除策略2.2.1 利用RNA干擾引起的基因敲除RNA干擾（RNA Interference， RNAi）是指內源性或外源性雙鏈 RNA（double-stranded RNA， dsRNA）進入細胞后，在細

17、胞內特異性降解與其同源的mRNA，從而抑制相應基因的表達，使細胞表現(xiàn)出特定基因缺失的表型，該現(xiàn)象也被稱為基因沉默15。dsRNA在Dicer酶的作用下可產生一系列長度為2122 nt的siRNA(small interfefence RNA)，siRNA分子、核酸酶以及螺旋酶等結合形成RNA誘導沉默復合物(RNAinduced silencing complex，RISC)，RISC以ATP依賴的方式催化雙鏈siRNA解旋，利用RISC內部的單鏈siRNA，通過堿基配對識別與之互補的靶RNA，切割靶RNA，并由RNA酶降解，從而導致目的基因的沉默。因此，通過將dsRNA分子導人細胞內，特異性地

18、降解細胞內與其同源mRNA，封閉內源性基因的表達來失活該基因同樣可以實現(xiàn)基因的敲除。2.2.2 鋅指核酸酶基因打靶技術鋅指核酸酶基因打靶技術(Zinc finger nucleases，ZFNs)的核心設計思想是將2個有特定功能的結構域，即特異性識別模塊和功能模塊融合，形成具有特定功能的蛋白16。單個ZFN的DNA結合結構域一般包含36個Cys2一His2鋅指蛋白重復單位，能特異性識別1個三聯(lián)體堿基。與鋅指蛋白組相連的非特異性核酸內切酶來自FokI的C端的96個氨基酸殘基組成的DNA剪切域，每個FokI單體與一個鋅指蛋白組相連構成一個ZFN，識別特定的位點，當2個識別位點相距68 bp距離時，

19、2個單體ZFN相互作用產生酶切功。在此特異位點產生1個DNA雙鏈切口(Double strands breaks，DSB)，然后利用細胞固有的同源重組或非同源末端連接修復機制進行切口修復，從而達到精確定點修飾的目的。圖2-1 ZFN結構示意圖Figure2-1 The structure of ZFN2.2.3 TALENs 靶向基因敲除技術TALENs(Transcription Activatorlike(TAL)Effector Nucleases)靶向基因敲除技術是一種嶄新的分子生物學工具，被認為是基因敲除技術發(fā)展的里程碑。TALENs的設計和構建是基于植物病原體黃單胞菌(Xantho

20、monas)分泌的一種轉錄激活子樣效應因子(Transcription activatorlike effector，TALE)可以識別DNA序列的原理。TALE蛋白的核酸結合域的氨基酸序列與其靶位點的核苷酸序列有恒定的對應關系，由34個氨基酸重復序列組成一個單元，重復1718次，34個氨基酸中的第12和13個氨基酸(Repeat Variant Diresidue，RVD)對應識別1個目標堿基。利用TAL的序列模塊，可組裝成特異結合任意DNA序列的模塊蛋白。TALE蛋白中的DNA結合域與FokI核酸內切酶的切割域融合，在特異的位點打斷目標基因，進而在該位點進行DNA操作，如敲入(Knocki

21、n)、敲出(Knockout)或點突變17。TALENs成功解決了常規(guī)的ZENs方法不能識別任意目標基因序列，以及識別序列經(jīng)常受上下游序列影響等問題，而具有與ZENs相等或更好的活性，無基因序列、細胞、物種限制，試驗設計簡單準確，成本低，成功率幾乎可達100，毒性低，脫靶情況少，使基因操作變得更加簡單、方便。圖2-2 TALENs 靶向基因敲除技術結構圖Figure2-2 The structure of TALENs2.2.4 CRISPR/CAS9基因敲除技術2013年初，一種全新的人工核酸內切酶clustered regularly interspaced short palindrom

22、ic repeats(CRISPR)CRISPRassociated(Cas)9出現(xiàn)，主要由細菌和古細菌通過一種不斷進化適應的免疫防御系統(tǒng)改造而成，II型CRISPR/Cas9免疫系統(tǒng)依賴Cas9內切酶家族靶向和剪切外源DNA。其特點是制作簡單，成本低，作用高效18。作為一種新的基因編輯技術，CRISPR/Cas9有靶向精確性高、試驗周期短、無物種限制、具有好的活性等特點和優(yōu)勢。不僅如此，CRISPR/Cas系統(tǒng)還可以同時針對同一細胞(ES)中的多個位點能實現(xiàn)多靶點同時酶切，人們運用該技術成功獲得斑馬魚等模式動物基因敲除模型，使得多個基因敲除、敲入成為可能。Cas9內切酶在crRNA(CRIS

23、PR RNA )和反式激活 crRNA(trans -acting CRISPR RNA，tracrRNA)的復合物的指引下，識別保守的間隔相鄰基序 ( protospacer adjacent motifs，PAM)，在PAM稍前幾個堿基處切割，形成雙鏈斷裂的DNA，細胞啟動同源重組和非同源末端連接修復機制，然后對修復位點進行修飾或插入新的遺傳信息，導致基因失活。 CRISPR/Cas9 技術是繼ES細胞打靶、ZFN 和TALEN 等技術后可用于定點構建基因敲除動物的第四種方法。該技術只需設計一個100bp 左右的sgRNA 就可實現(xiàn)特異性識別，而ZFN和TALEN則需要設計改變核酸酶前面的

24、序列以針對不同的靶點。TALEN 技術可在幾個月內得到基因敲除動物，而 CRISPR/Cas9 技術則更快，只需要34周。最近Tsai等改進技術，將CRISPR/Cas9技術的靶向功能與FokI核酸內切酶結合，以二聚體的形式進行切割(圖2-3)，由于所切割的DNA長度比單獨使用CRISPR/Cas9技術增大了兩倍，提高了基因組編輯的準確性，大大降低了脫靶效應19。圖2-3 sgRNA介導的Cas9和FokI復合系統(tǒng)定向基因組修飾作用示意圖Figure2-3 The function of sgRNA guided Cas9 and FoKI combined system 第三章 前景展望綜上

25、所述，基因敲除技術從八十年代發(fā)展至今近三十年，從起始的經(jīng)典基因敲除策略到如今研究火熱的CRISPR/Cas9，基因敲除技術已經(jīng)取得了巨大的發(fā)展。盡管利用人工核酸酶ZFN、TALENs和細菌獲得性免疫系統(tǒng)CRISPR目前還處于研究的初期階段，其在基因敲除方面已表現(xiàn)出巨大的潛力和廣闊的應用前景，被認為是靶向基因修飾的革新技術。雖然這些新技術依然還有許多未知因素并沒有研究透徹，但是可以相信其在微生物代謝工程以及動植物改造等方面將會發(fā)揮越來越重要的作用。參考文獻1 劉雪靜, 王歡, 嚴放, 高明明, 劉國慶, 黃薇. 大中型動物基因敲除技術的研究進展. 生理科學進展 2015:11-6.2 周維, 付

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