基因敲除技術(shù)及其進(jìn)展

1、基因敲除技術(shù)研究進(jìn)展及其在代謝工程上的應(yīng)用The Current Status of Gene Knockout and its Application in Metabolic Engineering天津大學(xué)化工學(xué)院二零壹六年六月摘 要基因敲除技術(shù)是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來一項重要的分子生物學(xué)技術(shù)，在微生物代謝工程，動植物改造以及功能基因研究方面具有廣泛的應(yīng)用。本文介紹了基因敲除的策略和在代謝工程中的作用，著重介紹了四種新興的基因敲除策略：RNAi，ZFN，TALENs以及最近研究火熱的CRISPR/Cas9。并在最后展望了基因敲除技術(shù)尤其是新興技術(shù)在相關(guān)領(lǐng)域的發(fā)展趨勢，為基因敲除技術(shù)的進(jìn)一

2、步發(fā)展提供了參考。關(guān)鍵詞： 基因敲除 代謝工程 同源重組 CRISPR/Cas9 ABSTRACTGene Knockout is an important molecular biotechnology which has developed sine 1980. It has been proved efficient in microbial metabolic engineering, transform of nimals and plants and functional genomics. In this review, we mainly introduced the stra

3、tegies of gene knockout and its application in metabolic engineering.And four new strategies RNAi, ZFN, TALENs and CRISPR/Cas9 were highlighted in detail. At last, developing frontiers and application prospects of gene knockout were further discussed.KEY WORDS：gene knockout, metabolic engineering, h

4、omologous recombination, CRISPR/Cas9目 錄第一章 基因敲除技術(shù)11.1基因敲除相關(guān)背景11.2基因敲除技術(shù)在代謝工程中的應(yīng)用2第二章 基因敲除策略32.1傳統(tǒng)的基因敲除策略32.1.1利用同源重組進(jìn)行基因敲除32.1.2利用隨機(jī)插入突變進(jìn)行基因敲除42.2新興的基因敲除策略52.2.1 利用RNA干擾引起的基因敲除52.2.2 鋅指核酸酶基因打靶技術(shù)52.2.3 TALENs 靶向基因敲除技術(shù)62.2.4 CRISPR/CAS9基因敲除技術(shù)7第三章 前景展望9參考文獻(xiàn)10致謝11第一章 基因敲除技術(shù)1.1基因敲除相關(guān)背景隨著測序技術(shù)的迅速發(fā)展，生物體基因功能

5、的研究已經(jīng)成為當(dāng)下最熱門的課題。現(xiàn)階段基因功能的研究主要是通過減弱或中止某一基因表達(dá)，觀察生物體整體功能變化，推測該基因的相關(guān)功能，然后將基因與生物整體功能相關(guān)聯(lián)進(jìn)行深入探究，為最終確定基因功能提供依據(jù)1。隨著功能基因組學(xué)研究的深入，相關(guān)技術(shù)也得到不斷地發(fā)展與完善，其中最為常用的便是基因敲除技術(shù)?；蚯贸?0世紀(jì)80年代末發(fā)展起來的一門新技術(shù)，2007年獲得諾貝爾生理或醫(yī)學(xué)獎1。該技術(shù)是以DNA同源重組技術(shù)和胚胎干細(xì)胞技術(shù)為基礎(chǔ)， 經(jīng)過30余年的發(fā)展，現(xiàn)今已經(jīng)有多種基因敲除技術(shù)被應(yīng)用于分子生物學(xué)、遺傳學(xué)等諸多領(lǐng)域2。而近年來新興起了ZFNs、TALENS、Cas9等多種基因高效靶向修飾和調(diào)控

6、技術(shù)。2012年1月基因組編輯核酸酶技術(shù)的Nature Methods雜志評選為年度研究方法3。2012年12月被Science雜志評為2012年度十大科學(xué)進(jìn)展之一4。這些技術(shù)極大地提高了基因敲除的效率，且具有極高的特異性，為研究基因功能創(chuàng)造了新的途徑必將極大地推動生物學(xué)、醫(yī)學(xué)研究的發(fā)展?；蚯贸夹g(shù)分為完全基因敲除和條件型基因敲除。完全基因敲除是指通過同源重組法完全消除細(xì)胞或者動物個體中的靶基因活性。條件型基因敲除是指通過定位重組系統(tǒng)實現(xiàn)特定時間和空間的基因敲除5?，F(xiàn)階段條件型基因敲除以噬菌體的Cre/Loxp系統(tǒng)和釀酒質(zhì)粒的FLP/FRT系統(tǒng)應(yīng)用最為廣泛?；蚯贸夹g(shù)已從最初簡單的完全敲除

7、發(fā)展到條件敲除階段，現(xiàn)正朝著特定組織基因敲除、特定時間基因敲除的可調(diào)控敲除方向發(fā)展。然而，基因敲除也有其無法克服的缺點和不足：1）在敲除過程中，被破壞的常常只是靶基因的部分外顯子而并不是整個編碼區(qū)，殘留的編碼序列有可能組合出新的未知的功能，這將給表型分析帶來麻煩；2） 敲除掉某個基因并不一定就能獲知該基因的功能，其原因在于許多基因在功能上是冗余的，敲除掉一個在功能上冗余的基因，并不能造成容易識別的表型，因為基因家族的其它成員可以提供同樣的功能；3）對于某些必需基因，敲除后會造成細(xì)胞死亡，也就無法研究這些必需基因的功能；4）實驗費用偏高，同一個打靶載體在不同遺傳背景下進(jìn)行基因敲除，獲得的表型差異

8、很大6。1.2基因敲除技術(shù)在代謝工程中的應(yīng)用具體而言，代謝工程是利用基因工程技術(shù)或其他物理、化學(xué)方法對細(xì)胞的代謝途徑進(jìn)行精確地修飾與改造，對細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)物質(zhì)的代謝流進(jìn)行擴(kuò)展、減小、阻斷或構(gòu)建新的代謝途徑，從而有目的、有理性地改變微生物原有代謝特性，改進(jìn)或者構(gòu)建新的微生物表型，并與微生物基因調(diào)控、代謝調(diào)控及生化工程相結(jié)合，提高目的代謝產(chǎn)物活性或產(chǎn)量、或合成新的代謝產(chǎn)物的工程技術(shù)科學(xué)7。代謝工程的難題就是如何使微生物的代謝主流流經(jīng)理想載流途徑。在發(fā)酵生產(chǎn)中, 為了達(dá)到這一目的，從營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞到產(chǎn)物產(chǎn)生通常需要從三個方面加以控制8，即：a. 使來自上游和各個注入分支的碳架物質(zhì)能暢通地流向目的產(chǎn)物；

9、b. 阻塞或去除與目的產(chǎn)物的形成無關(guān)或關(guān)系不大的代謝支流，使碳架物質(zhì)相對集中地流向目的產(chǎn)物；c. 消除或削弱目的產(chǎn)物進(jìn)一步代謝的途徑。在上述各過程中，起關(guān)鍵作用的無疑是酶，而基因敲除技術(shù)的出現(xiàn)使快速失活成為現(xiàn)實，從而達(dá)到調(diào)節(jié)代謝流，優(yōu)化代謝途徑的目的。通過基因敲除技術(shù)，可研究被敲除基因的生物學(xué)功能，還可以進(jìn)行功能基因的插入及染色體基因的替換，進(jìn)而可以阻斷微生物細(xì)胞的代謝旁路，減弱毒/副作用，強(qiáng)化目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量或質(zhì)量，降低能耗，從而成為具有重要工業(yè)應(yīng)用價值的微生物細(xì)胞工廠研究中的重要內(nèi)容9。第二章 基因敲除策略以下本文將通過兩個方面講述基因敲除技術(shù)，一是傳統(tǒng)的基因敲除策略；二是新興的基因敲除策略

10、。并對這些策略做一些簡單介紹以及概括。2.1傳統(tǒng)的基因敲除策略2.1.1利用同源重組進(jìn)行基因敲除經(jīng)典的基因敲除策略是利用上述同源重組基本原理，通過體外改造一定長度/形式的基因，與細(xì)胞染色體上的靶基因發(fā)生同源重組 (插入或置換)，從而改變細(xì)胞的遺傳特性。從同源重組的基本原理出發(fā)，分別針對同源重組的底物類型 (單鏈/雙鏈、線性/環(huán)狀)、重要蛋白 (RecA 酶、RecBCD 酶等及噬菌體中具有相似功能的酶) 和功能位點 (Chi 位點) 等進(jìn)行分子設(shè)計，即可開發(fā)出各種不同的基因敲除方法，根據(jù)同源重組載體的不同，可以把基因敲除方法分為線性單鏈 DNA (ssDNA)、線性雙鏈 DNA(dsDNA)

11、以及環(huán)狀雙鏈DNA (質(zhì)粒載體) 等3類：1. 線性單鏈 DNA 敲除策略不但打靶載體易于構(gòu)建，且其重組效率是雙鏈 DNA的10100倍10；2. 采用線性雙鏈DNA進(jìn)行同源重組，是近年來基因敲除方法的熱點之一。其優(yōu)點是可以避免較為繁瑣的基因克隆和質(zhì)粒載體構(gòu)建步驟，而直接采用PCR方法擴(kuò)增獲得目標(biāo)同源重組片段。然而，線性雙鏈DNA 易于被細(xì)胞內(nèi)的 RecBCD 酶降解，為了解決上述問題，可以在線性雙鏈 DNA 的兩側(cè)引入Chi位點，保護(hù)DNA不被 RecBCD 酶降解，并能強(qiáng)化RecBCD 酶介導(dǎo)的同源重組效率11。3. 構(gòu)建環(huán)狀質(zhì)粒載體進(jìn)行目標(biāo)基因敲除的方法，是實現(xiàn)微生物基因敲除的經(jīng)典策略，

12、主要通過微生物 本 身 的 RecA 重 組 系 統(tǒng) ( 主 要 包 括 RecA 和RecBCD 等蛋白) 發(fā)揮作用。RecA 蛋白是單鏈結(jié)合蛋白，促進(jìn)各類 DNA 分子間的同源聯(lián)會、配對、鏈交換和分支遷移RecBCD 是由 RecB、 RecC 和 RecD三個蛋白組成的復(fù)合體，它能與雙鏈切口結(jié)合使DNA 鏈解開，并在Chi位點形成單鏈，然后由RecA蛋白促進(jìn)同源重組。由于RecBCD 具有核酸外切酶V的活性，所以線性DNA 分子在細(xì)菌體內(nèi)會被降解。因此，必須通過環(huán)狀質(zhì)粒載體克隆來完成同源重組片段的分子設(shè)計和構(gòu)建9。常用的環(huán)狀質(zhì)粒載體敲除策略有4種12：a. 非復(fù)制型質(zhì)粒載體敲除法對野生菌

13、做基因敲除，可以先考慮用非復(fù)制型載體。由于構(gòu)建好的敲除載體在受體菌中是不復(fù)制的，因此轉(zhuǎn)化之后，在選擇壓力下，未發(fā)生重組的轉(zhuǎn)化子由于敲除載體不能復(fù)制隨著菌體生長而被稀釋。b. 不穩(wěn)定型質(zhì)粒載體敲除法若受體菌感受態(tài)較難制備，可考慮采用不穩(wěn)定型敲除載體。這種質(zhì)粒在受體菌中分配不穩(wěn)定 ,在無壓力選擇或低磷條件下培養(yǎng)510代會出現(xiàn)很多質(zhì)粒丟失的細(xì)胞。因此轉(zhuǎn)化后可先控制培養(yǎng)條件使敲除載體隨細(xì)胞復(fù)制以增加轉(zhuǎn)化子的數(shù)目，然后再在無壓力選擇或低磷條件下讓質(zhì)粒丟失，最后在選擇壓力下篩選敲除子。c. 溫度敏感型 ( Ts型) 質(zhì)粒載體敲除法 1993年，Biswas等13利用Ts型質(zhì)粒建立了革蘭氏陽性菌高效的基因敲

14、除系統(tǒng)。Biswas所用質(zhì)粒pG+host5在37時不復(fù)制，而28時以滾環(huán)模式進(jìn)行復(fù)制。因此轉(zhuǎn)化后在選擇壓力下37培養(yǎng)會導(dǎo)致第一次同源重組sco(single-crossover)，之后將溫度降至28，會促使質(zhì)粒發(fā)生滾環(huán)復(fù)制，這種復(fù)制機(jī)制會導(dǎo)致發(fā)生第二次dco(double-cross-over)。重組后，目的基因或是被敲除，或是回復(fù)成野生型。d. 結(jié)合轉(zhuǎn)化敲除法如果要進(jìn)行基因敲除的目標(biāo)菌不易制備感受態(tài)或感受態(tài)效率很低，則可以通過尋找“中介菌”來完成基因轉(zhuǎn)移的過程。2.1.2利用隨機(jī)插入突變進(jìn)行基因敲除大規(guī)模的隨機(jī)插入突變理論上可實現(xiàn)在基因組范圍內(nèi)敲除任一基因。這項技術(shù)具有效率高、基因完全失活

15、以及容易分離鑒定等優(yōu)點。目前較為有效的方法是隨機(jī)插入突變可以分為T-DNA插入突變和轉(zhuǎn)座子插入突變，兩者是在植物中使用廣泛的基因敲除手段：AT-DNA插入失活技術(shù)是利用根癌農(nóng)桿菌T-DNA介導(dǎo)轉(zhuǎn)化，將一段帶有報告基因的DNA序列標(biāo)簽整合到基因組DNA上?？梢灾苯釉谥参锘蚪MDNA中產(chǎn)生穩(wěn)定的插入突變，而且插人位點的隨機(jī)性較強(qiáng)，但是只適用于那些容易被T-DNA轉(zhuǎn)化的植物，且常常會引起染色體重排現(xiàn)象，使突變體表型與T-DNA插入無關(guān)而難以進(jìn)行遺傳學(xué)分析。這種方法在擬南芥中可產(chǎn)生3540的突變率，19的突變體具有外觀可察覺到的表型特征。B轉(zhuǎn)座子插入突變是利用轉(zhuǎn)座子在染色體上可移動的特點，當(dāng)其跳躍插入

16、到某個功能基因時，就會引起該基因的失活，并誘導(dǎo)產(chǎn)生突變型。植物特別適合于轉(zhuǎn)位插入突變，因為獲得的基因突變可以保留在雜合子的植株中，而通過Fl代植株自交產(chǎn)生的F2代植株中可獲得純合子的突變體植株。利用轉(zhuǎn)座子進(jìn)行基因敲除具有很大便利，僅需已知外顯子，載體構(gòu)建簡單，可攜帶多種不同抗性基因，同時處理多基因14。轉(zhuǎn)座子插入突變只適用于存在內(nèi)源活性轉(zhuǎn)位子的植物種類，但這樣的植物并不多。2.2新興的基因敲除策略2.2.1 利用RNA干擾引起的基因敲除RNA干擾（RNA Interference， RNAi）是指內(nèi)源性或外源性雙鏈 RNA（double-stranded RNA， dsRNA）進(jìn)入細(xì)胞后，在細(xì)

17、胞內(nèi)特異性降解與其同源的mRNA，從而抑制相應(yīng)基因的表達(dá)，使細(xì)胞表現(xiàn)出特定基因缺失的表型，該現(xiàn)象也被稱為基因沉默15。dsRNA在Dicer酶的作用下可產(chǎn)生一系列長度為2122 nt的siRNA(small interfefence RNA)，siRNA分子、核酸酶以及螺旋酶等結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RNAinduced silencing complex，RISC)，RISC以ATP依賴的方式催化雙鏈siRNA解旋，利用RISC內(nèi)部的單鏈siRNA，通過堿基配對識別與之互補(bǔ)的靶RNA，切割靶RNA，并由RNA酶降解，從而導(dǎo)致目的基因的沉默。因此，通過將dsRNA分子導(dǎo)人細(xì)胞內(nèi)，特異性地

18、降解細(xì)胞內(nèi)與其同源mRNA，封閉內(nèi)源性基因的表達(dá)來失活該基因同樣可以實現(xiàn)基因的敲除。2.2.2 鋅指核酸酶基因打靶技術(shù)鋅指核酸酶基因打靶技術(shù)(Zinc finger nucleases，ZFNs)的核心設(shè)計思想是將2個有特定功能的結(jié)構(gòu)域，即特異性識別模塊和功能模塊融合，形成具有特定功能的蛋白16。單個ZFN的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域一般包含36個Cys2一His2鋅指蛋白重復(fù)單位，能特異性識別1個三聯(lián)體堿基。與鋅指蛋白組相連的非特異性核酸內(nèi)切酶來自FokI的C端的96個氨基酸殘基組成的DNA剪切域，每個FokI單體與一個鋅指蛋白組相連構(gòu)成一個ZFN，識別特定的位點，當(dāng)2個識別位點相距68 bp距離時，

19、2個單體ZFN相互作用產(chǎn)生酶切功。在此特異位點產(chǎn)生1個DNA雙鏈切口(Double strands breaks，DSB)，然后利用細(xì)胞固有的同源重組或非同源末端連接修復(fù)機(jī)制進(jìn)行切口修復(fù)，從而達(dá)到精確定點修飾的目的。圖2-1 ZFN結(jié)構(gòu)示意圖Figure2-1 The structure of ZFN2.2.3 TALENs 靶向基因敲除技術(shù)TALENs(Transcription Activatorlike(TAL)Effector Nucleases)靶向基因敲除技術(shù)是一種嶄新的分子生物學(xué)工具，被認(rèn)為是基因敲除技術(shù)發(fā)展的里程碑。TALENs的設(shè)計和構(gòu)建是基于植物病原體黃單胞菌(Xantho

20、monas)分泌的一種轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子(Transcription activatorlike effector，TALE)可以識別DNA序列的原理。TALE蛋白的核酸結(jié)合域的氨基酸序列與其靶位點的核苷酸序列有恒定的對應(yīng)關(guān)系，由34個氨基酸重復(fù)序列組成一個單元，重復(fù)1718次，34個氨基酸中的第12和13個氨基酸(Repeat Variant Diresidue，RVD)對應(yīng)識別1個目標(biāo)堿基。利用TAL的序列模塊，可組裝成特異結(jié)合任意DNA序列的模塊蛋白。TALE蛋白中的DNA結(jié)合域與FokI核酸內(nèi)切酶的切割域融合，在特異的位點打斷目標(biāo)基因，進(jìn)而在該位點進(jìn)行DNA操作，如敲入(Knocki

21、n)、敲出(Knockout)或點突變17。TALENs成功解決了常規(guī)的ZENs方法不能識別任意目標(biāo)基因序列，以及識別序列經(jīng)常受上下游序列影響等問題，而具有與ZENs相等或更好的活性，無基因序列、細(xì)胞、物種限制，試驗設(shè)計簡單準(zhǔn)確，成本低，成功率幾乎可達(dá)100，毒性低，脫靶情況少，使基因操作變得更加簡單、方便。圖2-2 TALENs 靶向基因敲除技術(shù)結(jié)構(gòu)圖Figure2-2 The structure of TALENs2.2.4 CRISPR/CAS9基因敲除技術(shù)2013年初，一種全新的人工核酸內(nèi)切酶clustered regularly interspaced short palindrom

22、ic repeats(CRISPR)CRISPRassociated(Cas)9出現(xiàn)，主要由細(xì)菌和古細(xì)菌通過一種不斷進(jìn)化適應(yīng)的免疫防御系統(tǒng)改造而成，II型CRISPR/Cas9免疫系統(tǒng)依賴Cas9內(nèi)切酶家族靶向和剪切外源DNA。其特點是制作簡單，成本低，作用高效18。作為一種新的基因編輯技術(shù)，CRISPR/Cas9有靶向精確性高、試驗周期短、無物種限制、具有好的活性等特點和優(yōu)勢。不僅如此，CRISPR/Cas系統(tǒng)還可以同時針對同一細(xì)胞(ES)中的多個位點能實現(xiàn)多靶點同時酶切，人們運用該技術(shù)成功獲得斑馬魚等模式動物基因敲除模型，使得多個基因敲除、敲入成為可能。Cas9內(nèi)切酶在crRNA(CRIS

23、PR RNA )和反式激活 crRNA(trans -acting CRISPR RNA，tracrRNA)的復(fù)合物的指引下，識別保守的間隔相鄰基序 ( protospacer adjacent motifs，PAM)，在PAM稍前幾個堿基處切割，形成雙鏈斷裂的DNA，細(xì)胞啟動同源重組和非同源末端連接修復(fù)機(jī)制，然后對修復(fù)位點進(jìn)行修飾或插入新的遺傳信息，導(dǎo)致基因失活。 CRISPR/Cas9 技術(shù)是繼ES細(xì)胞打靶、ZFN 和TALEN 等技術(shù)后可用于定點構(gòu)建基因敲除動物的第四種方法。該技術(shù)只需設(shè)計一個100bp 左右的sgRNA 就可實現(xiàn)特異性識別，而ZFN和TALEN則需要設(shè)計改變核酸酶前面的

24、序列以針對不同的靶點。TALEN 技術(shù)可在幾個月內(nèi)得到基因敲除動物，而 CRISPR/Cas9 技術(shù)則更快，只需要34周。最近Tsai等改進(jìn)技術(shù)，將CRISPR/Cas9技術(shù)的靶向功能與FokI核酸內(nèi)切酶結(jié)合，以二聚體的形式進(jìn)行切割(圖2-3)，由于所切割的DNA長度比單獨使用CRISPR/Cas9技術(shù)增大了兩倍，提高了基因組編輯的準(zhǔn)確性，大大降低了脫靶效應(yīng)19。圖2-3 sgRNA介導(dǎo)的Cas9和FokI復(fù)合系統(tǒng)定向基因組修飾作用示意圖Figure2-3 The function of sgRNA guided Cas9 and FoKI combined system 第三章 前景展望綜上

25、所述，基因敲除技術(shù)從八十年代發(fā)展至今近三十年，從起始的經(jīng)典基因敲除策略到如今研究火熱的CRISPR/Cas9，基因敲除技術(shù)已經(jīng)取得了巨大的發(fā)展。盡管利用人工核酸酶ZFN、TALENs和細(xì)菌獲得性免疫系統(tǒng)CRISPR目前還處于研究的初期階段，其在基因敲除方面已表現(xiàn)出巨大的潛力和廣闊的應(yīng)用前景，被認(rèn)為是靶向基因修飾的革新技術(shù)。雖然這些新技術(shù)依然還有許多未知因素并沒有研究透徹，但是可以相信其在微生物代謝工程以及動植物改造等方面將會發(fā)揮越來越重要的作用。參考文獻(xiàn)1 劉雪靜, 王歡, 嚴(yán)放, 高明明, 劉國慶, 黃薇. 大中型動物基因敲除技術(shù)的研究進(jìn)展. 生理科學(xué)進(jìn)展 2015:11-6.2 周維, 付

26、喜愛, 張德顯, 田春蓮, 漢麗梅, 劉明春. 基因敲除技術(shù)的研究進(jìn)展. 中國獸醫(yī)雜志 2015;51:67-9.3 Method of the Year 2011. Nature methods 2012;9:1-.4 The Runners-Up. Science 2012;338:1525-32.5 朱玉賢. 現(xiàn)代分子生物學(xué): 高等教育出版社; 2007.6 宋安東, 張沙沙, 王風(fēng)芹, 謝慧, 田原. 基因敲除在工業(yè)微生物育種方面的應(yīng)用. 生物學(xué)雜志 2011;28:68-72.7 Bailey JE. Toward a science of metabolic engineering

27、. Science 1991;252:1668-75.8 張星元. 微生物生物工程的3個基本觀點. 無錫輕工大學(xué)學(xué)報:食品與生物技術(shù) 2001;20:436-9.9 于慧敏, 馬玉超. 工業(yè)微生物代謝途徑調(diào)控的基因敲除策略. 生物工程學(xué)報 2010;26:1199-208.10 Ellis HM, Yu D, Ditizio T, Court DL. High efficiency mutagenesis, repair, and engineering of chromosomal DNA using single-stranded oligonucleotides. Proceedings

28、 of the National Academy of Sciences 2001;98:6742-6.11 Smith GR. Homologous recombination in E. coli: Multiple pathways for multiple reasons. Cell 1989;58:807-9.12 謝承佳, 何冰芳, 李霜. 基因敲除技術(shù)及其在微生物代謝工程方面的應(yīng)用. 生物加工過程 2007;5:10-4.13 Biswas I, Gruss A, Ehrlich SD, Maguin E. High-efficiency gene inactivation and replacement system for gram-positive bacteria. Journal of Bacteriology 1993;175:3628-35.14 Zhang C, Ki