圓二色譜CD原理.ppt

1、A,1,圓二色性光譜及其應(yīng)用 （Circular Dichroism，CD）,A,2,光學(xué)活性分子對(duì)左、右圓偏光的吸收率的差值,A,3,1、自然光,光具有波、粒二象性，是橫電磁波。只有橫波才有偏振現(xiàn)象: 光矢量的振動(dòng)方向與光的傳播方向垂直， 在垂直于光傳播方向的平面內(nèi), 有不同的振動(dòng)方向。 電場(chǎng)矢量E和磁場(chǎng)矢量H互相垂直、位相相同。,A,4,由于感光作用都是E 引起的，因而，將E 作為光矢量。 振動(dòng)面：E 與光傳播方向組成的平面。,A,5,從統(tǒng)計(jì)規(guī)律上說(shuō)，自然光的光振動(dòng): 在垂直于光速的平面上遍布所有方向， 沿各方向振動(dòng)的光矢量呈對(duì)稱分布, 相應(yīng)光矢量的振幅（光強(qiáng)度）相等。,A,6,（1）高亮

2、度的點(diǎn)光源； （2）日光色。色溫接近6000K； （3）在可見(jiàn)光區(qū)連續(xù)光譜； （4）高顯色性，顯色指數(shù)95； （5）在整個(gè)壽命期內(nèi)維持光色特性； （6）高電弧穩(wěn)定性； （7）熱重啟能力； （8）啟動(dòng)后即能達(dá)到接近最大光輸出； （9）電弧光斑小、易聚光。,超高壓短弧氙燈: 在高壓純凈氙氣中放電發(fā)光。,A,7,自然光,平面偏振光,圓偏振光,樣品,橢圓偏振光,A,8,雙折射現(xiàn)象： 一束光射入各向異性晶體后有兩束折射光。 尼科耳棱鏡。,2、光的偏振,在生物樣品中，肌肉纖維、骨骼和牙齒等具有各向異性，淀粉粒、染色體和紡錘體等具有雙折射性，因此被用于組織細(xì)胞的化學(xué)研究。,A,9,A,10,o光和e光：頻率

3、相同、振動(dòng)方向相互垂直、平面偏振光,A,11,自然光入射到某些晶體（電氣石、硫酸金雞鈉堿晶體等）時(shí)，晶片吸收振動(dòng)面與晶軸垂直的光，而只允許振動(dòng)面平行于晶軸的光通過(guò)。,A,12,自然光,平面偏振光,A,13,也稱線（完全）偏振光，簡(jiǎn)稱偏振光。 它的振動(dòng)面稱為其偏振面。 振動(dòng)方向保持不變 振幅發(fā)生周期性變化 E之端點(diǎn)在空間的軌跡為一平面正弦曲線 投影到垂直于光傳播方向的平面上為一直線段,3、平面偏振光（Plane polarized light）,A,14,4、布儒斯特角,當(dāng)入射光射到兩種介質(zhì)界面上時(shí)，反射光和折射光的偏振情況與入射光不同。,A,15,5、四分之一波片,使o光和e光的光程相差1/4

4、波長(zhǎng)的晶片。此時(shí)，相位差為/2，透射的合成光是長(zhǎng)軸與晶軸重疊的正橢圓偏振光。,A,16,朝光源看， 電場(chǎng)矢量方向按順時(shí)針?lè)较蛐D(zhuǎn)的，稱為右圓偏振光； 電場(chǎng)矢量方向按逆時(shí)針?lè)较蛐D(zhuǎn)的，稱為左圓偏振光。,若入射平面偏振光的電矢量與晶體晶軸的夾角45，則Eo = Ee，合成光是圓偏振光（Circular polarized light）。,A,17,6、光的疊加,一束自然光可以看作是兩束相互垂直而沒(méi)有相位關(guān)系的平面偏振光的加和。,A,18,A,19,振幅相等、振動(dòng)方向相互垂直、相位相差1/4波長(zhǎng)的兩平面偏振光合成圓偏振光,右旋,A,20,7、旋光色散（Optical rotatory dispers

5、ion，ORD）,旋光性：光學(xué)活性分子對(duì)左、右圓偏光的折射率不同，透射光雖然仍然為平面偏振光，但其偏振面旋轉(zhuǎn)了一定的角度。 旋光物質(zhì)又稱為光學(xué)活性物質(zhì)。 旋光度：偏振面旋轉(zhuǎn)的角度,旋光色散：不同波長(zhǎng)的偏振光的旋轉(zhuǎn)角度不同。 旋光儀是測(cè)量旋光性與波長(zhǎng)的函數(shù)關(guān)系，從而得到一個(gè)旋光色散譜。,A,21,圓雙折射：某個(gè)物質(zhì)對(duì)于左、右圓偏光的折射率分別為nL和nR， 若 nL = nR，則為光學(xué)各向同性物質(zhì)； 若 nL nR，則為光學(xué)各向異性物質(zhì)；左、右圓偏光的相位改變， 若nLnR，透射光的偏振面右旋。 若nLnR，透射光的偏振面左旋。,旋光現(xiàn)象是圓雙折射的一種特殊形式。 旋光物質(zhì)使左、右圓偏振光的速度

6、不同，即其色散大小的折射率不同， 旋光現(xiàn)象的產(chǎn)生是由于光學(xué)各向異性物質(zhì)的折射率nLnR的結(jié)果。,A,22,旋光，雙折射,A,23,化合物在正常情況下，處于低能的基態(tài)，電子占據(jù)所有的成鍵軌道（、n軌道）。如果電子吸收了外界的能量，它就從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)能級(jí)。 如果所有的躍遷僅在基態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)和第一激發(fā)態(tài)之間，吸收光譜將是很狹窄而不連續(xù)的譜線。 由于分子的價(jià)電子躍遷總伴隨著振動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)的躍遷，所以，紫外分光光度計(jì)測(cè)定物質(zhì)的吸收光譜，雖然有一最大吸收峰值，但都是具有一定波長(zhǎng)寬度并相對(duì)平滑的曲線。,8、光的吸收和圓二色性（circular dichroism, CD）,A,24,光的吸收,若溶液

7、中的溶質(zhì)對(duì)某一波長(zhǎng)的入射光有吸收，則透射光的光強(qiáng)度小于入射光。,A,25,圓二色性的存在將通過(guò)該物質(zhì)傳播的左、右圓偏光變成橢圓偏振光。并且只在發(fā)生吸收的波長(zhǎng)處才能觀察到。,A,26,理論計(jì)算的圓二色性與該橢圓偏振光的摩爾橢圓率的關(guān)系：, = 100/（c l） = 3300（ L-R）,：介質(zhì)對(duì)圓偏振光的摩爾消光系數(shù)， c ：樣品摩爾濃度， l ：樣品厚度（cm ）， 單位：/（mol cm） 或 cm2/dmol。,A,27,圓二色性的表示,吸收（率）差 = L - R A = AL AR 橢圓度，摩爾橢圓度 = 2.303（AL AR）/4 = 3298（L - R） 3300 （L -

8、R） 在蛋白質(zhì)研究中，常用平均殘基摩爾橢圓度,A,28,園二色雙折射,A,29,9、ORD與CD光譜,同時(shí)產(chǎn)生， 包括同樣的分子結(jié)構(gòu)信息：光學(xué)活性物質(zhì)分子中的不對(duì)稱生色團(tuán)。 CD反映光與分子間能量的交換，旋光性則是與分子中電子的運(yùn)動(dòng)有關(guān)。 可以由Kronig-Krammers轉(zhuǎn)換方程相互轉(zhuǎn)換。,A,30,CD譜的極值處與吸收峰一致（科頓效應(yīng)，cotton effect），因而分子中不同生色團(tuán)對(duì)于譜的貢獻(xiàn)比在ORD中更容易分辨。 ORD是漸近線，兩端不回歸,A,31,CD比ORD容易辨別重疊峰,CD比ORD弱帶易檢測(cè),CD比ORD更容易擬合,CD比ORD提供較多意義明確的信息,表明有三個(gè)生色團(tuán)，

9、其中兩個(gè)有光學(xué)活性,A,32,CD能夠提供的信息：,primary structure, secondary structure tertiary structure,Alpha-helix, beta-sheet 肽鏈骨架的構(gòu)象變化,蛋白質(zhì)的紫外吸收光譜主要有兩個(gè)峰： 190-250nm：肽鍵 280-290nm：酪氨酸t(yī)yr，色氨酸t(yī)rp,A,33,10、 J-810圓二色光譜儀,S1-S2:第一級(jí)單色器；S2-S3:第二級(jí)單色器; M：球面反光鏡；P：晶體石英棱鏡；L:透鏡；F:濾光器；,A,34,由CDM交互形成的左、右旋圓偏光通過(guò)光學(xué)活性物質(zhì)，透射光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化,當(dāng)調(diào)制電壓過(guò)其峰

10、值（正和負(fù)）時(shí)， RL時(shí)，透過(guò)的右旋圓偏光的光強(qiáng)對(duì)應(yīng)于最大值，而左旋最?。▽?shí)線）； RL時(shí)，透過(guò)的左旋圓偏光的光強(qiáng)對(duì)應(yīng)于最大值，而右旋最?。ㄌ摼€）。 PMT的輸出信號(hào)由正比于IA的直流分量和正比于S的交流分量所組成。,A,35,圓二色光譜儀工作原理,用相同強(qiáng)度，相同頻率的左、右旋圓偏光交替照射樣品測(cè)得透過(guò)樣品后的強(qiáng)度IR和IL,由于IR和IL十分接近，令I(lǐng)A=（IL+IR）/2，S= IR IL,只放大相應(yīng)于S的PMT輸出電壓Es（交流信號(hào)），而不放大相應(yīng)IA的輸出電壓EA。（適當(dāng)選取放大倍數(shù)G值，使ESG與EA可比）。,A,36,Peltier Cell Holder,CD/Total Fl

11、uorescence,FMO,Stopped Flow,-20200,A,37,The peptide bond is inherently asymmetric and is always optically active,蛋白質(zhì)的光學(xué)活性,A,38,1、氨基酸的圓二色性,可見(jiàn)光區(qū)：各種氨基酸都沒(méi)有光吸收。 紫外光區(qū)：只有芳香族色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸有吸收。 氨基酸分子內(nèi)的紫外生色基團(tuán)：吲哚基、酚羥基、苯基、二硫鍵、咪唑基和羧基等。,A,39,2、肽的圓二色譜,活性肽構(gòu)象與其生理功能的關(guān)系 肽的構(gòu)象也是蛋白質(zhì)構(gòu)象的一種模型。 肽的圓二色性為研究肽在溶液中的構(gòu)象提供了重要信息。,A,40,F

12、ar-UV (250-170nm) Secondary Structure: -helix, -sheet, -turn, random Tertiary Structure Class: all-, +, /, all-I, all-II Near-UV (320-250nm)： aromatic side chain Near-UV Near-infrared (300-1000nm)： colored proteins,A,41,苯丙氨酸（ phenylalanine， Phe）：255、261和268nm附近； 酪氨酸（ tyrosine， Tyr） ：277nm左右； 色氨酸（ tr

13、yptophan， Trp） ： 279、284和291nm附近； 二硫鍵的變化反映在整個(gè)近紫外區(qū)。,芳香氨基酸殘基及二硫鍵處于不對(duì)稱微環(huán)境時(shí)，在近紫外區(qū)表現(xiàn)出CD信號(hào),A,42,Far UV CD spectra of poly-L-Lys,1、100% -螺旋 2、100% -折疊 3、100%無(wú)規(guī)卷曲,A,43,Main CD features of protein 2ndary structures,A,44,3、估算蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)含量,僅適合含量較高的蛋白質(zhì)！,將測(cè)得的CD曲線與標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合。 xa+ xb + xc = 1.0 qt = xaqa + xbqb + xcqc 改變x

14、a、xb和xc，使qt與樣本曲線最佳擬合（最小二乘法，least squares minimization ）,未知結(jié)構(gòu)的蛋白的CD信號(hào),A,45,myoglobin,qt = xaqa + xbqb + xcqc fits best with xa = 80% xb = 0% xc = 20% agrees well with structure 78% helix, 22% coil For further details: /cd/cdtutorial.htm,A,46,GCN4-p1,0oC：100% helix 75oC：0% helix

15、what about 50oC? qt = xoqo + x75q75 fits best with xo = 50% x75= 50% Shows that at 50oC 1/2 of peptide a-helix dimer 1/2 of peptide random coil monomer,A,47,Lau, Taneja and Hodges (1984) J.Biol.Chem. 259:13253-13261,螺旋二聚體分解為單螺旋,三氟乙醇 （trifluoroethanol，TFE）誘導(dǎo)肽鏈形成螺旋,TFE對(duì)卷曲螺旋（coiled-coil）的影響,A,48, chymo

16、trypsin (all b) lysozyme (a + b) triosephosphate isomerase(a/b) myoglobin (all a),CD signal of a protein depends on its 2ndary structure,A,49,A,50,pH變化引起的 肌球素變性前后CD譜的動(dòng)力學(xué)變化,A,51,稀釋前后的熒光和CD譜 從伸展到折疊,螺旋含量的變化的動(dòng)力學(xué)檢測(cè),Kinetic Trace at 222nm(secondary structure region),A,52,Kinetic traces at 289nm (Aromatic

17、side chain region),細(xì)胞色素c伸展和折疊狀態(tài)的CD和熒光光譜 反映了芳環(huán)側(cè)鏈（色氨酸殘基）的變化,鹽酸胍中的細(xì)胞色素c(伸展?fàn)顟B(tài)) 與PBS混合后的CD和熒光光譜,A,53,6、磁圓二色譜 （ Magnetic Circular Dichroism ，MCD）,磁性材料對(duì)左、右圓偏光的吸收不同而產(chǎn)生的二色性現(xiàn)象。 利用法拉第效應(yīng)，在外加磁場(chǎng)的作用下，許多原來(lái)沒(méi)有光學(xué)活性的物質(zhì)也具有了光學(xué)活性，原來(lái)可測(cè)得CD譜的，在磁場(chǎng)中CD信號(hào)可增大幾個(gè)數(shù)量級(jí)。 7000 Gauss,A,54,實(shí)驗(yàn)要點(diǎn),A,55,Sample concentration,A good suggestion

18、is to run in advance an absorption UV-VIS spectra. CD spectroscopy calls for same requirements as UV-VIS: best S/N is obtained with absorbance level in the range 0.6 to 1.2. Its usually difficult to get proper data when absorbance (of sample + solvent) is over 2 O.D.,A,56,樣品杯：高度均勻的熔融石英，不會(huì)帶來(lái)附加的圓二色性。

19、光程：0.01cm-1cm，為了降低溶劑影響，一般提高樣品濃度，用短光程。,cell pathlength,A,57,Nitrogen flushing,Flushing the optics with dry nitrogen is a must: Xe lamp has a quartz envelope, so if operated in air itll develop a lot of ozone, harmful for the mirrors below 195nm oxygen will absorb radiation,A,58,HT plot,The HT plot is

20、 very important, since readings above 600-650V mean that not enough light is reaching the detector so a sample dilution or the use of shorter path cell are required. the HT plot is in realty a single beam spectra of our sample, since there is a direct relation between HT and sample absorbance. By da

21、ta manipulation HT conversion into absorbance and buffer baseline subtraction is possible. Alternatively single beam absorbance scale can be used already in CH2 during data collection, loosing however a bit the alerting functions of this channel.,A,59,A,60,Bandwidth (SBW) selection,Setting of slits

22、should be as large as possible (to decrease noise level), but compatible to the natural bandwidth (NBW) of the bands to be scanned. As a rule SBW should be kept at least 1/10 of the NBW, otherwise the band will be distorted. If NBW is not known a series of fast survey spectra at different SBW will h

23、elp proper selection. Trade in of accuracy versus sensitivity (i.e. the use of larger than theoretical SBW) is occasionally required. 2 nm in the far UV region 1 nm in the aromatic region (where fine structures may be present), optimal band-pass (as large as possible, but not loosing information) ca

24、n be determined after a trial,A,61,標(biāo)準(zhǔn)操作時(shí)譜帶寬度選為1nm； 高分辨率測(cè)量用較窄的狹縫寬度，此時(shí)PMT電壓較高，信噪比差； 當(dāng)樣品的光密度很高、CD很小時(shí)，就要保持測(cè)試CD峰多需要的足夠濃度，并用較寬的狹縫寬度。此時(shí)，由于樣品OD值過(guò)高，可能存在有熒光或雜散光引起的某些假象。,A,62,Number of data point,data pitch, i.e. number of data points per nm, will not directly influence the noise level. However if post run fur

25、ther data processing will be applied to reduce the noise, its advisable to collect as many data points as possible to increase the efficiency of the post run filtering algorithm,A,63,Accumulation,another way to improve S/N is to average more spectra. Here too the S/N will improve with the square root of the number of accumulations. Averaging is very effective since it compensates short term random noise, but itll not compensate long term drifts (mainly of thermal origin). So if long accumulations are used we recommend a suitab