基因組文庫構建.ppt

1、1、第四章基因組文庫的構建、基因組文庫(genomic library )即基因文庫(genomicbank )是一個含有生物所有基因的隨機片段的重組DNA克隆組。 構建基因庫時，首先純化生物的總DNA，用機械切或酶切成一定大小的片段，連接到適當?shù)妮d體(通常噬菌體)，在體外包裝細菌轉染，含有不同DNA片段的重組噬菌體粒子這就是基因庫。 這些DNA片段包含了基因組的所有基因。 2、cDNA文庫(cDNA文庫):克隆的重組cDNA的總和通常存在于細菌或酵母中。 這些克隆表示從特定種類或器官的所有mRNA中制備的cDNA。 cDNA分子克隆(cDNA克隆) :將cDNA片段安裝在載體上轉化細菌，擴大

2、多克隆的過程，最終構建cDNA文庫。 3、建庫的目的：1.從復雜的基因組中分離單拷貝的基因2 .從復雜總mRNA來源的cDNA庫中分離稀有cDNA克隆。 建庫要點：如何生產(chǎn)足夠數(shù)量的重組DNA應注意：1.保證載體DNA和目標DNA不被外來DNA序列污染2 .盡可能使用“電話克隆”。 4，5，第一節(jié)DNA克隆片段的產(chǎn)生和分離，1 .基因組DNA的片段1 .用限制酶片段：將DNA消化，不通過凝膠電泳部門，直接連接載體的克隆方法被稱為霰彈槍法(shot-gan approach )的問題根據(jù)每個載體可以插入13kb的DNA的計算，基因庫至少包含1030萬個重組質粒。 從其中篩選目標基因的工作量非常大

3、。 目的基因內部可能有一個以上的酶切位點，一個基因載于幾個重組質粒上，進行完全篩選更不容易。 6，2 .隨機分段：可制作超聲波： 300bp的短篇分段。 高速攪拌： 1500轉/分30分鐘可以切斷平均長度為8kb的分子群。 3 .雙酶消化酶消化的產(chǎn)物一般分子大，考慮到噬菌體插入片段不超過25kb，因此選擇識別4bp的限制酶(切割平均長256bp )，識別6bp的限制酶切割平均長4096 bp . 7 .雙酶切產(chǎn)生的DNA片段的平均大小不超過1kb，但采用雙酶部分消化，產(chǎn)物的分子量可達到1030kb，它們有時按照隨機順序重疊，用蔗糖梯度離心和凝膠電泳可以將這些片段群按大小分開，分子量約2 二.如

4、果DNA片段大小的支部知道目的基因克隆片段的大小范圍，克隆前可以用蔗糖梯度離心或瓊脂糖凝膠電泳將DNA集團在大小的支部分離。 三、目的基因克隆片段的豐富性。 8，4 .克隆數(shù)確定，任何DNA序列出現(xiàn)在文庫的概率： N:此序列需要克隆總數(shù)p:克隆的DNA序列在文庫中設置的出現(xiàn)概率一般為99%； I :克隆DNA片段的長度，假設為17kb的G:基因組DNA的全長，例如人為3109bp、9，將上式=8.1105 N代入數(shù)據(jù)的意思是，克隆大小為17kb的人DNA的情況下，所構筑的基因庫10、cDNA文庫、1 .概況： cDNA文庫是通過逆轉錄mRNA制備雙鏈cDNA (雙鏈cDNA )建立的。 構建c

5、DNA文庫的策略有： (1)依賴于目標mRNA的相對豐度；(2)篩選方法：除了簡單的分子雜交法以外，還可以用多種方法對表達產(chǎn)物進行鑒定。 11、cDNA文庫的優(yōu)點，(1)通過將遺傳物質制成RNA病毒，可以制作文庫(2)由于克隆數(shù)遠遠少于基因組文庫，所以容易篩選(3)從分化特異細胞的cDNA文庫分離為特異表達的基因(4)倉庫建設時排除其他RNA，降低假陽性率。 (5) cDNA文庫可以在細菌中表達，可以用各種策略篩選。 12，但是應該注意的是，(1)細胞內不同的mRNA的存在度不同，低存在度的mRNA要求高克隆數(shù)(用公式計算)。 (2)某些基因表達具有嚴峻的時空性，得到其mRNA并不容易。從不同

6、的發(fā)育階段或不同組織細胞的mRNA制備的cDNA文庫中包含一些共同和特異的序列。 這可以用于分離差異表達的基因。 (3)cDNA文庫的DNA中沒有內含子、調節(jié)元件、基因間DNA。 不能用于基因結構和調節(jié)的研究。 一個基因可以通過不同的切斷形成不同部分重疊的cDNA克隆。 制備13，cDNA文庫，分離代表細胞中的主要tRNA (trna和trna由于其豐富和大小的一致性，可以通過分級直接分離)。 mRNA的提取可以用胸腺嘧啶柱分離。 被反轉。 cDNA的第一鏈合成用oligo(dT )引物可以在中部添加另一種引物，因為長的mRNA沒有完全轉錄。 第二鏈cDNA的合成通過自引物進行，更有效的方法之

7、一是在cDNA的第一鏈上添加多胞嘧啶等尾巴，以oligo(G )為引物開始第二鏈的合成。 這樣產(chǎn)生的雙鏈cDNA，通過加合物或均聚尾插入載體。 在第14、15、第二節(jié)構建文庫載體，1.噬菌體載體的基礎：裸噬菌體重組DNA轉化為宿主細胞，或包裝后轉染宿主細胞。 載體篩選：在細菌苔上形成菌斑。 重組篩選：可見插入載體標記的插入失活(通過中斷cI基因阻止溶解性，產(chǎn)生的噬菌體更清晰的現(xiàn)代載體具有l(wèi)acZ基因，用蘭白進行篩選。 16、取代載體Spi-表型(對P2感染失去敏感性)是由中心“填充片段”gam和red基因座的喪失引起的。 施主DNA的大?。翰迦胼d體：0-10kbp； 取代載體：9-23kbp。

8、 插入大小的范圍被限制在有效形成菌斑的野生型基因組的75-105%。 主要應用：插入載體：cDNA克隆和表達庫的噬菌體展示。 取代載體：基因組DNA克隆。 17，2 .粘多糖顆粒(cosmid )載體的基礎：包含噬菌體cos位點的質粒； 導入宿主：體外包裝，轉染宿主細胞的載體篩選：類似于質粒重組篩選：可見標記插入失活和小片段插入的陽性篩選的施主DNA大?。?30-45kbp。 插入尺寸的范圍被限制在有效形成菌斑的野生型基因組的75-105%。 主要應用：基因組文庫的構建。 18，19，3 .質粒載體構建cDNA文庫，20，4 .大容量克隆載體，21，(1)細菌人工染色體，BACs， fosmi

9、ds )基礎：大腸桿菌f質粒導入宿主：轉化載體篩選：顯性選擇標記重組篩選：插入片段尺寸施主DNA尺寸： 300kbp主應用：大基因組分析回顧：低頻重排和嵌合分子。 載體保持每個細胞一個或兩個拷貝，并生成少量的施主DNA。 22，23，24，(2) P1載體和P1人工染色體(P1 artificial chromosomes，PACs )基礎：噬菌體P1導入宿主：體外包裝和轉錄載體篩選：顯性選擇標記重組篩選：中斷致死標記載體維持低拷貝，但可以通過誘導噬菌體p-1的溶菌酶循環(huán)放大。 25，(3)酵母人工染色體(yeast artificial chromsomes，YACs )基礎：釀造酵母的中心

10、顆粒、端粒和ARS導入宿主：轉化酵母原生質體篩選：顯性篩選標志(營養(yǎng)缺陷型的恢復) 重組篩選：插入片段大小施主DNA大?。?2000kbp主要應用：大基因組分析，YAC轉基因小鼠回顧： YAC的缺點是高頻自發(fā)缺失，與克隆嵌合化。 重組載體的大小，需要進行電泳分析，有時很難區(qū)分內源性染色體。 YAC維持低復印。 26、27、第三節(jié)文庫的篩選，一.基因組DNA文庫的篩選DNA文庫是分離目的基因的常用方法，數(shù)千萬的克隆中僅含有極少數(shù)目的基因，而且很多基因的產(chǎn)物沒有可選擇的表型特征(2)用免疫和生化方法檢測基因產(chǎn)物；(3)用特異性引物進行PCR擴增。28，2.cdna的篩選，(1)最佳cdna文庫的m

11、RNA在細胞中高水平特異性表達(2)目的mRNA的豐度極低時，應選擇其豐度相對高的細胞構建文庫，計算文庫應具有的克隆數(shù)29，30，探針的特異性可以通過以下策略解決：以基因特異性序列為探針長度在1720Nt以上控制退火溫度。 堿的簡并性，通過選擇簡并度最低的序列可以解決選擇使用頻率最高的密碼子簡并密碼子的第三個堿為h； 應用混合探針控制退火溫度。 31，3 .使用寡核苷酸探針分離目的基因1 .寡核苷酸探針的來源(1)從一種分離的基因序列可以是另一種核酸探針(2)由與蛋白質保存區(qū)相鄰的67個氨基酸導出合成核酸探針。 合成探針時，必須考慮探針的特異性堿的簡并性。 32，4 .克服假陽性克隆，使用混合

12、探針分離克隆基因取得了良好的效果，但發(fā)生了相當數(shù)量的假陽性。 作為克服假陽性的方法， (1)的“guessmer”探針估計體探針基于特定種已知蛋白質的密碼子使用頻率，選擇包含密碼子退縮度最低的蛋白質的片段并人工合成的低退縮性寡核苷酸探針33、34、推測體探針只要85%的堿基能量與目的基因配對就可以雜交。 推測連續(xù)配對區(qū)長(達到1012Nt )時，身體的探測作用強度足以鑒定含有目的基因的陽性克隆。 如果錯誤的核苷酸均勻分散在探針分子的各個部位，該推測體探針就不與目的基因的序列雜交。 提高雜交溫度減少假陽性。35，(2)PCR推測體技術，測定尿酸氧化酶末端的32aa的序列從該階段的兩側序列推測，合

13、成一組引物從豬肝中提取mRNA，逆轉錄成cDNA，用上述引物特異性擴增該cDNA。 將擴增產(chǎn)物連接載體進行克隆，用唯一的推測體探針進行雜交，選擇陽性克隆。 這個推測體探測器用32aa序列導出了推測。 分離的克隆中部為上述32aa，兩端為引物序列。 以該插入序列為探針，在嚴格條件下篩選噬菌體cDNA庫。 36、37、5 .用差分雜交或減法雜交方法分離克隆目標基因，(1)差分雜交(diffential hybridization) 1.差分雜交必須具有兩個細胞組：一個細胞組中目標基因正常表達，另一個細胞2 .調制兩種不同的mRNA提取物。 含有一定比例的目的基因mRNA的總mRNA不含另一個目的基

14、因mRNA的總mRNA； 3 .通過以這兩種總mRNA為探針的平行雜交篩選目標基因cDNA克隆文庫。 38、39、(二)減雜交，減少雜交的缺點：(一)靈敏度低(二)再現(xiàn)性差(三)需要大量的雜交膜，工作量多，花費時間，因此可以通過減雜交來篩選，通過減雜交來分析突變基因(41，(三).分離克隆目的基因，DDRT-PCR，42，43，(4)用免疫方法分離克隆的目的基因，1 .用目標蛋白質制備抗體，2 .用該抗體制備抗體，擴大信號。 3 .標記抗體4 .進行免疫實驗。 篩選、44、45、46、6.YAC文庫，理論上分離成大量的基因組克隆，如果構建它們的限制圖，就可以識別重復的基因組克隆，進一步構建全基

15、因組的物理圖。 實際上很難。 (1)重復片段多，重復長度不均衡；(2)工作量多的一個標準YAC文庫的插入片段的總和相當于58個基因組的大小，需要約500個96個孔和相應量的雜交瘤。 因此，一般使用Locus- specfic PCR進行篩選。按“池”(pool )單位(相當于4張96節(jié)流孔)或“超級成套”(相當于96節(jié)流孔20張)依次進行篩選，逐漸縮小篩選范圍。 47，7 .基因定位克隆、基因定位克隆(map-based cloning )是分離未知結構的目的基因。 理論上，鑒定的突變基因可以用這種方法分離。 條件是(1)包含該基因的YAC文庫成立；(2)需要與目的基因密切相連的標記(已知基因或分子標記)。 48、(一).染色體體步進法(chromosome walking) (1)方法：人和其他動物定位克隆以染色體步進法：相鄰標記為探針，在基因組文庫中篩選重復克隆。