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1、免疫凝集反應(yīng)及臨床應(yīng)用,劉 靜 2014.11.26,.,細(xì)菌、螺旋體、紅細(xì)胞或細(xì)胞性抗原等顆粒性抗原,或可溶性抗原(或抗體)與載體顆粒結(jié)合成致敏顆粒后,它們與相應(yīng)抗體(或抗原)發(fā)生特異性反應(yīng),在一定條件下,形成肉眼可見的凝集現(xiàn)象。,凝集反應(yīng)定義,.,反應(yīng)階段: 抗原抗體的特異性結(jié)合階段 出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象,凝集反應(yīng),反應(yīng)特點: IgM的作用比IgG大數(shù)百倍 IgG與抗原結(jié)合后,常不出現(xiàn)凝集反應(yīng),稱不完全抗體,.,可見反應(yīng)形成,.,電解質(zhì):稀釋液或緩沖液(8.5g/L NaCl) pH:pH6pH9( pH3為細(xì)菌抗原的等電點) 溫度:1540,37最適( 4特例 ) 反應(yīng)時間:不同反應(yīng)時
2、間不同 外力:震蕩或攪拌,環(huán)境因素,.,分類:直接與間接凝集反應(yīng),.,顆粒性抗原直接與抗體結(jié)合,在電解質(zhì)的作用下,出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象。 包括: 玻片凝集試驗 試管凝集試驗,直接凝集反應(yīng) direct agglutination,.,玻片凝集試驗: 定性 已知抗體檢測抗原 簡便、快速 菌種的診斷或分型 ABO血型的鑒定,.,試管凝集試驗: 半定量 已知抗原檢測抗體 易引起抗原的非特異性凝集 肥達(dá)試驗,.,0.5,0.5,0.5,0.5,0.5,棄掉0.5,試管凝集試驗原理,結(jié)果,1 2 3 4 5 6 7,菌液,.,+,很小的凝集顆粒,混濁,-,無凝集現(xiàn)象,與對照相同,+,小、部分凝集塊,中
3、等混濁,+,大多凝集管底,輕度混濁,+,大的凝集塊,清亮,凝集程度,沉淀,上清,試管凝集試驗結(jié)果判斷,.,管底沉淀,凝集程度,最高稀釋比例,待測血清的滴度,試管凝集試驗 結(jié)果判斷,.,將可溶性抗原或抗體吸附于顆粒性載體表面,然后與相應(yīng)的抗體或抗原反應(yīng),在電解質(zhì)的作用下,出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象,間接凝集反應(yīng) indirect agglutination,.,RBC、白陶土、活性炭、某些細(xì)菌、聚苯乙烯膠乳顆粒 良好載體有如下幾點基本要求:在生理鹽水或緩沖液無自凝傾向;大小均勻;比重與介質(zhì)相似,短時間內(nèi)不能沉淀;無化學(xué)或血清學(xué)活性;吸附抗原(或抗體)后,不影響其活性。 目前應(yīng)用最廣的是人的O型紅細(xì)胞
4、和綿羊紅細(xì)胞。而后者應(yīng)用更廣,因為其來源方便。另外綿羊紅細(xì)胞的表面有大量的(約1 000個以上)糖蛋白受體,極易吸附某些抗原物質(zhì),吸附性能好。,載體種類,.,正向間接凝集試驗 反向間接凝集試驗 間接凝集抑制試驗 協(xié)同凝集試驗,間接凝集反應(yīng),.,用抗原致敏載體-檢測抗體,正向間接凝集反應(yīng),.,反向間接凝集反應(yīng),用抗體致敏載體-檢測抗原,.,間接凝集抑制反應(yīng),用抗原致敏載體-檢測抗原,有凝集顆粒為陰性,.,反向間接凝集試驗,載體為金黃色葡萄球菌 金黃色葡萄球菌的細(xì)胞壁成分A蛋白,和IgG的Fc段結(jié)合,使Fab段暴露在菌體表面, Fab段仍然保持正常的抗體活性。 利用這種特性可以將特異性IgG結(jié)合在
5、菌體上,形成致敏顆粒,檢測特異性抗原。,協(xié)同凝集反應(yīng),.,原理圖,IgG,SPA,SPA- IgG,待測抗原,SPA- IgG-待測抗原凝集顆粒,混合,加入,.,間接血凝試驗 膠乳凝集試驗 明膠凝集試驗,按載體分類間接凝集試驗,.,以紅細(xì)胞為載體的間接凝集試驗。 將已知抗原(或抗體)致敏紅細(xì)胞,與相應(yīng)抗體(或抗原)特異結(jié)合,出現(xiàn)紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象。,間接血凝試驗,.,紅細(xì)胞,抗原,致敏,致敏紅細(xì)胞,紅細(xì)胞凝集,間接血凝試驗,待測抗體,間接血凝試驗原理,.,-:紅細(xì)胞沉積于孔底 +:紅細(xì)胞沉積于孔底,周圍有散在少量凝集 +:紅細(xì)胞形成凝集,面積較小,邊緣較松散 +:紅細(xì)胞形成片層凝集,面積略多于+
6、+:紅細(xì)胞形成片層凝集,均勻布滿孔底,或邊緣皺縮如花邊狀,血凝試驗強(qiáng)度,.,與一般間接血凝試驗不同之處為反應(yīng)中的紅細(xì)胞是未經(jīng)致敏的受檢者新鮮紅細(xì)胞 主要試劑材料為抗紅細(xì)胞單克隆抗體,能與紅細(xì)胞結(jié)合,但不引起凝集反應(yīng) 這種抗體與另一特異性抗體連接成的雙功能抗體可用于檢測標(biāo)本中的抗原 如與特異性抗原連接,則可用于檢測標(biāo)本中的抗體 反應(yīng)中的標(biāo)本為受檢者的全血 HIV抗體、HBV抗原檢測,自身紅細(xì)胞凝集試驗,.,膠乳凝集試驗,以聚苯乙烯膠乳為載體顆粒的間接凝集反應(yīng) 膠乳為人工合成的載體,性能比紅細(xì)胞穩(wěn)定,均一性好 但與蛋白質(zhì)結(jié)合能力以及聚集性能不如紅細(xì)胞 因此作為間接凝集反應(yīng),膠乳凝集的敏感度不及血凝
7、試驗,.,明膠凝集試驗,以明膠為載體顆粒的間接凝集反應(yīng) 用粉紅色明膠顆粒吸附病毒抗原或重組抗原 當(dāng)致敏明膠顆粒與樣品血清作用時,若血清含有抗病毒抗體則可形成肉眼可見的粉紅色凝集 常用于抗HIV-1抗體和抗精子抗體的檢測 梅毒螺旋體明膠顆粒凝集試驗(TPPA),.,抗球蛋白參與的血凝試驗,.,抗球蛋白參與的血凝試驗,又稱Coombs試驗,利用抗球蛋白抗體作為第二抗體,連接與紅細(xì)胞表面抗原結(jié)合的特異性抗體,使紅細(xì)胞凝集 用于檢測抗紅細(xì)胞不完全抗體 不完全抗體:能與顆??乖喂探Y(jié)合,但一般不出現(xiàn)可見反應(yīng),多為7S的IgG 診斷免疫性溶血性貧血的主要方法,.,抗球蛋白參與的血凝試驗,分為兩種方法: 直接Coombs試驗 間接Coombs試驗,.,直接Coombs試驗,檢測紅細(xì)胞上的不完
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