【精品】建立HPLC同時(shí)測(cè)定杭菊葉中5種綠原酸類成分及木犀草苷的方法

1、建立HPLC同時(shí)測(cè)定杭菊葉中5種綠原酸類成分及木犀草苷的方法建立HPLC同時(shí)測(cè)定杭菊葉中5種綠原酸類成分及木犀草苷的方法 本文關(guān)鍵詞：測(cè)定，成分，建立，方法，木犀 建立HPLC同時(shí)測(cè)定杭菊葉中5種綠原酸類成分及木犀草苷的方法 本文簡(jiǎn)介：摘要：目的：建立HPLC同時(shí)測(cè)定杭菊葉中5種綠原酸類成分及木犀草苷的方法，并分析不同生長(zhǎng)過程杭菊葉中綠原酸類和黃酮類成分的動(dòng)態(tài)變化，比較同期采收的杭菊葉與杭菊花中成分的差異，為杭菊葉的質(zhì)量控制、合理利用提供參考。方法：采摘不同生長(zhǎng)時(shí)期的杭菊葉樣品及盛花期的杭菊花樣品，采用HPLC方法對(duì)杭菊葉及杭菊花 建立HPLC同時(shí)測(cè)定杭菊葉中5種綠原酸類成分及木犀草苷的方法

2、本文內(nèi)容： 摘要：目的：建立HPLC同時(shí)測(cè)定杭菊葉中5種綠原酸類成分及木犀草苷的方法，并分析不同生長(zhǎng)過程杭菊葉中綠原酸類和黃酮類成分的動(dòng)態(tài)變化，比較同期采收的杭菊葉與杭菊花中成分的差異，為杭菊葉的質(zhì)量控制、合理利用提供參考。方法：采摘不同生長(zhǎng)時(shí)期的杭菊葉樣品及盛花期的杭菊花樣品，采用HPLC方法對(duì)杭菊葉及杭菊花中綠原酸類及黃酮類成分進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果：不同生長(zhǎng)時(shí)期杭菊葉中綠原酸類及木犀草苷成分呈不同的規(guī)律。新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B隨著生長(zhǎng)時(shí)間而逐漸累積，到9月含量達(dá)到峰值后逐步下降；綠原酸、異綠原酸A則隨著成分累積，在9月達(dá)到峰值，下降后又在11月出現(xiàn)次峰值。木犀草苷則隨著生長(zhǎng)過程逐步增加，

3、到11月達(dá)到含量峰值。同期采收的杭菊葉中綠原酸類及黃酮類成分高于杭菊花。結(jié)論：該研究結(jié)果為確定杭菊葉的采收時(shí)間及質(zhì)量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)提供了參考和依據(jù)，為揭示杭菊葉生長(zhǎng)過程中資源性化學(xué)成分的變化以及藥材品質(zhì)的控制奠定了一定基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：杭菊葉； 綠原酸； 黃酮； 生長(zhǎng)過程； 動(dòng)態(tài)變化；杭白菊又稱杭菊，是菊科植物Chrysanthemum morifoliumRamat.的干燥頭狀花序，具有散風(fēng)清熱，平肝明目、清熱解毒功效1,是著名的浙江道地藥材浙八味之一。杭菊在采收的同時(shí)，會(huì)產(chǎn)生大量的莖、葉，并且產(chǎn)量比菊花大的多，這些莖、葉往往被視作副產(chǎn)品丟棄，而菊葉具有清肝明目、解毒消腫等功效，可用于頭風(fēng)、目眩、疔瘡

4、、癰腫等證2,具有一定的藥用價(jià)值。杭菊葉中尚含有大量有機(jī)酸、黃酮等成分，其中綠原酸類成分含量較高，包括單咖啡?；鼘幩幔壕G原酸（3-O-咖啡?；鼘幩幔?、新綠原酸（5-O-咖啡?；鼘幩幔?、隱綠原酸（4-O-咖啡?；鼘幩幔?，二咖啡?；鼘幩幔寒惥G原酸A（3,5-O-二咖啡?；鼘幩幔惥G原酸B（3,4-O-二咖啡?；鼘幩幔惥G原酸C（4,5-O-二咖啡?；鼘幩幔?，具有抗誘變、抗菌、抗病毒、清除自由基、抗氧化、降血壓血脂等多種生物活性3,4.杭菊為浙江道地藥材，主產(chǎn)于桐鄉(xiāng)等地，杭菊葉資源豐富，為了合理開發(fā)和綜合利用杭菊葉，本文建立了HPLC同時(shí)測(cè)定菊葉中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠

5、原酸A、異綠原酸B、木犀草苷的方法；分析了杭菊葉不同生長(zhǎng)過程中綠原酸類成分與木犀草苷的變化趨勢(shì)；并比較了同期采收的杭菊葉與杭菊花中綠原酸類成分與木犀草苷的含量差異，以期為確定杭菊葉的采收時(shí)間、質(zhì)量控制、資源綜合利用提供科學(xué)依據(jù)。1 材料1.1 儀器Thermo U3000型高效液相色譜儀，1/10萬電子天平（Sartorius R200D）；B3200S-T超聲機(jī)（必能信超聲有限公司）；Simplicity 純水儀（ 美國(guó)密理博公司） .1.2 試藥新綠原酸（15012821）、綠原酸（14111207）、隱綠原酸（15020603）、異綠原酸A（13041309）、異綠原酸B（1504221

6、0）、木犀草苷（13100904）購(gòu)自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司，其純度均≥98%.甲醇（色譜純140405）購(gòu)于天津四友，水為超純水（自制），甲醇、磷酸均為分析純。杭菊葉及杭菊花樣品采自金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院百草園，經(jīng)金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院羅國(guó)海副教授鑒定為菊科植物Chrysanthemum morifoliumRamat.的干燥頭狀花序和葉。采收后的杭菊葉采用自然干燥方法干燥，杭菊花采用蒸曬方式進(jìn)行干燥。2方法與結(jié)果2.1 色譜條件色譜柱為Thermo Syncronis C18柱（4.6 mm×250 mm,5 μm）；流動(dòng)相： A相為甲醇，B相為體積分?jǐn)?shù)0. 1%磷酸

7、水，梯度洗脫程序詳見表1.流速為1 ml·min-1;波長(zhǎng)為325 nm;柱溫為30 ；進(jìn)樣量為5 μL.2.2 溶液制備2.2.1 對(duì)照品溶液的配制分別取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、木犀草苷對(duì)照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加70%甲醇制成每1 mL含新綠原酸0.102 mg、綠原酸0.166 mg、隱綠原酸0.010 mg、異綠原酸A 0.063 mg、異綠原酸B 0.0405 mg、木犀草苷0.0632 mg的溶液，即得。2.2.2 供試品溶液的制備取杭菊葉及杭菊花（于2013年11月21號(hào)采摘，下同）干燥粉末（過40目篩）各0.20 g,精

8、密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇20 mL,稱定重量，超聲處理30 min（300 W,45 Hz），放冷，再稱定重量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，即得。對(duì)照品和供試品的色譜圖見圖1,2和圖3.2.3 方法學(xué)考察2.3.1 線性關(guān)系考察精密吸取各對(duì)照品溶液 1,3,5,7,10 μL注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定峰面積，以各對(duì)照品進(jìn)樣質(zhì)量為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍，結(jié)果見表2.2.3.2 精密度試驗(yàn)精密吸取杭菊葉樣品（20131121）供試品溶液5 μL,按上述色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣5次

9、，分別測(cè)定新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、木犀草苷的峰面積，結(jié)果6種成分峰面積的RSD分別為0.37%、0.40%、0.28%、0.74%、0.32%和0.54%,表明精密度良好。2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn)取同一批次的杭菊葉樣品（20131121）5份，按2.2.2項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，分別精密吸取5 μL,注入色譜儀，按2.1項(xiàng)下色譜條件記錄色譜圖，測(cè)定6種成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。結(jié)果新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、木犀草苷平均含量分別為0.70%、1.57%、0.15%、0.28%、3.10% 和0.50%,RSD分別為1.04%、0.8

10、3%、1.48%、1.66%、1.27% 和1.53%,表明試驗(yàn)方法重復(fù)性良好。2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)分別在0,2,4,8,12,24 h精密吸取同一供試品（20131121）溶液5 μL,注入液相色譜儀，按2.1項(xiàng)下色譜條件，測(cè)定峰面積，結(jié)果新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、木犀草苷峰面積的RSD分別為0.75%、0.86%、0.43%、0.98%、0.77% 和0.41%,表明6種成分在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。2.3.5 加樣回收率取已知6種成分含量的樣品粉末五份，分別精密加入一定量的對(duì)照品溶液，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定6種成分的含量，計(jì)算回收率，結(jié)果

11、新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、木犀草苷的回收率分別為，100.7%、99.1%、99.7%、101.2%、100.8%和99.8%,RSD分別為2.4%、1.6%、2.8%、2.0%、1.6%和1.8%.2.4 杭菊葉生長(zhǎng)過程中5種綠原酸成分及總綠原酸動(dòng)態(tài)變化按2.2.2項(xiàng)下供試品溶液的制備方法和色譜條件對(duì)所收集的不同生長(zhǎng)時(shí)期的杭菊葉樣品中的綠原酸類成分進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果見表4、圖4、圖5.對(duì)4月至11月杭菊葉整個(gè)生長(zhǎng)過程中采收的杭菊葉樣品中5種綠原酸類成分進(jìn)行了測(cè)定，新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B和異綠原酸A含量范圍分別為0.41%1.13%、1.33%2

12、.84%、0.04%0.20%、0.12%0.40%和2.75%3.89%,平均含量為0.70%、1.80%、0.12%、0.24%和3.29%.5種綠原酸類成分含量由高到低依次為異綠原酸A、綠原酸、新綠原酸、異綠原酸B、隱綠原酸。杭菊葉中的新綠原酸、隱綠原酸和異綠原酸B均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，且均以9月份采收為最高；而綠原酸和異綠原酸A則以4月份植物初長(zhǎng)葉時(shí)含量最高，其后5月份劇烈下降，再平穩(wěn)、緩慢上升，至11月份達(dá)到次高值。而綠原酸類總成分含量亦呈現(xiàn)初始較高、降低后升高、再降低的趨勢(shì)，以4月份采收的杭菊葉中綠原酸類成分總含量最高，達(dá)7.48%;9月份次之，達(dá)6.65%.2.5 杭菊葉生長(zhǎng)

13、過程中木犀草苷動(dòng)態(tài)變化按2.2.2項(xiàng)下供試品溶液的制備方法和色譜條件對(duì)所收集的不同生長(zhǎng)時(shí)期的杭菊葉樣品中的木犀草苷含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見圖6.木犀草苷以4月份植物初長(zhǎng)葉時(shí)含量較高，5月后含量下降，然后慢慢增加，至11月份含量最高。2.6 同期采收的杭菊葉與花綠原酸類成分及木犀草苷的比較按2.2.2項(xiàng)下供試品溶液的制備方法和色譜條件對(duì)11月同期采收的杭菊葉和杭菊花樣品進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果見表5、圖7.結(jié)果顯示，在同期采收的杭菊葉與杭菊花綠原酸類成分中，隱綠原酸與異綠原酸B相近，而新綠原酸、綠原酸、異綠原酸A含量杭菊葉則比杭菊花高出約36倍。黃酮類成分中，杭菊葉的木犀草苷含量也較杭菊花高出3倍左

14、右。3 討論本實(shí)驗(yàn)對(duì)杭菊葉中5種綠原酸類成分及木犀草苷的測(cè)定方法進(jìn)行了研究，實(shí)驗(yàn)所確定的方法可以一次性同時(shí)測(cè)定6種成分，且簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，有效地揭示了不同生長(zhǎng)時(shí)期杭菊葉中綠原酸類成分及黃酮類成分的動(dòng)態(tài)變化，可用于杭菊葉的質(zhì)量控制。綠原酸類成分是咖啡酸與奎寧酸形成的脂類，其分子結(jié)構(gòu)中含有酯鍵、不飽和雙鍵、多元酚等不穩(wěn)定部分，在提取過程中，易通過水解和分子內(nèi)酯基的遷移而發(fā)生異構(gòu)化5-7,因此在提取時(shí)避免采用加熱回流的方法8,而采取了超聲提取的方法，減少溫度對(duì)其成分的影響。通過對(duì)不同溶劑的比較（甲醇、70%甲醇、50%甲醇、30%甲醇）、超聲時(shí)間、溶劑體積等進(jìn)行比較，確定供試品制備方法為0.20g樣品加

15、70%甲醇超聲提取30min即可，操作簡(jiǎn)便。綠原酸是植物體在有氧呼吸過程中經(jīng)莽草酸途徑產(chǎn)生的一種苯丙素類化合物，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，綠原酸類成分的抗氧化活性隨著咖啡?；脑黾佣黾? ,而當(dāng)咖啡?；娜〈鷶?shù)減少時(shí)，其抗脂質(zhì)過氧化和清除自由基的活性隨之減少10.本研究結(jié)果顯示，杭菊葉中綠原酸類成分總含量除新葉生長(zhǎng)期4月份外，以9月份采收最高，達(dá)6.65%,這可能與9月上、中旬是菊花現(xiàn)蕾期，菊花在這時(shí)進(jìn)入生長(zhǎng)盛期及生殖生長(zhǎng)期，有氧呼吸增強(qiáng)有關(guān)。杭菊花含有多種成分11-12 ,其中黃酮、揮發(fā)油被認(rèn)為是杭菊花的有效成分，杭菊花中的酚性成分被認(rèn)為與其心血管作用密切相關(guān)13.2015年版中國(guó)藥典以綠原酸和木犀草苷

16、作為菊花質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中含量測(cè)定的指標(biāo)成分1.杭菊花的采收旺季是每年的11月份，采收過后大量的杭菊葉將作為廢棄品除去，而本文研究結(jié)果顯示，同期采收的杭菊葉中綠原酸類總成分含量及木犀草苷含量高于杭菊花，這與陳偉等14的測(cè)定結(jié)果一致。且此時(shí)也是杭菊葉生長(zhǎng)過程中木犀草苷含量最高的時(shí)節(jié)，綠原酸和異綠原酸A含量也較高，因此，每年11月份杭菊花采收完畢后，原本作為副產(chǎn)品被棄去莖、葉類資源完全可以作為提取木犀草苷及綠原酸類成分的原材料，使資源得以綜合利用。參考文獻(xiàn)1 Ch.P（中國(guó)藥典）Part 1 S.2015:310.2 Editorial board of the second edition of Nan

17、jing University Of Chinese Medicine. Great Dictionary of traditional Chinese Medicine（中藥大辭典）M Second edition（2）。 Shanghai: Shanghai Scientific & Technical Publishers. 2006:2901.3 Gao JM,Zhang AL,Zhang KJ,et al. Advances in the Researches of Distribution, Extractionand Bioactivities of Chlorogeni

18、c Acids J . J Northwest Forestry Univ（西北林學(xué)院學(xué)報(bào)）， 1999, 14 （ 2） : 73-82.4 HANG An-ling, MA Qiong, GAO Jin-ming ,et al. Studies on bioactivities of chlorogenic acid and its analogues J . Chin Tradit Herb Drugs（中草藥），2001,32（2）：173-176.5 Ma YH,Wang XQ,Hou FF,et al.Rapid resolution liquid chromatography （RRLC） analysis and studies on the stability of Shuang-Huang-Lian preparationsJ.J Pharm Biomed Anal,2011,54（ 2） : 265-272.6 Makiko T,Kazuko N,Seiichiro I,et al. Changes in ca