實驗二：ERIC-PCR指紋圖譜技術(shù).ppt

1、A,1,實驗二 ERIC-PCR指紋圖譜技術(shù) 在分子生態(tài)學中的應(yīng)用,A,2,實 驗 目 的,明確ERIC-PCR技術(shù)用于分析微生物群落結(jié)構(gòu)的原理。 掌握ERIC-PCR的操作方法。,A,3,ERIC (Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus)-PCR,A,4,ERIC-PCR是一種長引物隨機PCR技術(shù),圖譜穩(wěn)定、重復性高，對底物的序列差異敏感性高，產(chǎn)生的圖譜多態(tài)性豐富,A,5,PCR反應(yīng)的一般原理,PCR: 聚合酶鏈式反應(yīng)，即通過引物延伸核酸的某個區(qū)域而進行的重復雙向DNA合成。 基本要素： DNA模板 一對寡聚DNA引物（啟動DNA擴增

2、） Taq DNA聚合酶（催化DNA合成） 緩沖液（提供DNA合成所需pH、離子強度等環(huán)境） dNTP（DNA合成的原料）,PCR原理,A,6,ERIC-PCR程序,95, 7min 94, 1min (變性) 52, 1min (退火) 30 cycles 68, 8min (延伸) 65, 16min,A,7,實 驗 材 料,1. 試劑,無菌水 25 mmol/L MgCl2溶液 10擴增緩沖液: 含500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl (PH9.0), 1% TritionX-100 2.5 mmol/L dNTP混合液 20pmol/l 引物E1 20pmol/l 引

3、物E2 5 U/l Taq DNA聚合酶 DNA模板（40-80ng環(huán)境樣品總DNA）,A,8,2. 儀器設(shè)備,A,9,實 驗 步 驟,制備PCR mixture (25l system) 無菌水 13 l 10 buffer 2.5l 25 mmol/l MgCl2溶液 2.0l 2.5 mmol/L dNTP混合液 2.0l 20pmol/L 引物E1 0.5l 20pmol/L 引物E2 0.5l 加入模板DNA（40ng） 4.0l,NC 樣品 PC,A,10,放入PCR擴增儀，95變性7min 取出PCR小管，迅速加入0.5l Taq DNA聚合酶，混勻，簡短離心。（后加酶可保證模板變性完全且不損壞Taq DNA聚合酶的活性）,5. 放入PCR擴增儀 ，按以下程序進行擴增： 94 1 min，52 1 min, 65 8 min，共30個循環(huán)； 65延伸16min，1個循環(huán)。,A,11,程序結(jié)束（約6.5h),取出PCR小管 吸取2l擴增產(chǎn)物用濃度儀測定濃度,8. 400ng PCR產(chǎn)物電泳 9. 凝膠成像，保存圖譜,A,12,Mr NC S PC,結(jié)果：,A,13,注 意 事 項,避免污染 PCR體系中所有試劑必須保證無其它雜菌DNA的污染。 制備PCR混合物的操作應(yīng)在超凈臺上進行。 打開PCR