第一章---基因工程概述

1、基因工程,只 有 想 不 到 的,沒 有 辦 不 到 的,基因工程不是發(fā)現(xiàn)，而是創(chuàng)造。,第一節(jié) 基因工程概述,基因工程又稱為重組DNA技術(shù)，指在體外通過人工“剪切”和“拼接”等方法，對生物的基因進行改造和重新組合，然后導(dǎo)入受體細胞并使重組基因在受體細胞中表達，產(chǎn)生人類需要的基因產(chǎn)物的技術(shù)。,基因工程是指按照人們的愿望，進行嚴格的設(shè)計，并通過體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特性，從而創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。,DNA重組技術(shù),生物體外,基因,DNA分子（基因）水平,人類需要的基因產(chǎn)物,剪切,拼接,導(dǎo)入,表達,基因重組,基因工程的誕生和發(fā)展,證明DNA是遺傳物質(zhì),

2、發(fā)現(xiàn)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu),破譯遺傳密碼,限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn),DNA連接酶的發(fā)現(xiàn),逆轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn),質(zhì)粒等載體的發(fā)現(xiàn),基因工程 的誕生,1944，艾弗里,1953，沃森和克里克,1963，尼倫貝格,1970，阿爾伯、內(nèi)森斯、史密斯,基因工程的誕生,1973年，美國科學家科恩（S.N.Cohen）等將兩種不同來源的DNA分子進行體外重組,并首次實現(xiàn)了在大腸桿菌中的表達,創(chuàng)立了定向改造生物的新技術(shù)基因工程。,1973年，科恩和博耶將兩個不同的質(zhì)粒（一個是抗四環(huán)素質(zhì)粒，另一個是抗鏈霉素質(zhì)粒）拼接在一起，組成嵌合質(zhì)粒，并將其導(dǎo)入大腸桿菌，當該重組質(zhì)粒進入大腸桿菌體內(nèi)后，這些大腸桿菌能抵抗兩種藥物，而且這種

3、大腸桿菌的后代都具有雙重抗藥性。,培養(yǎng)平皿,大腸桿菌,基因工程大事記,1973年，體外重組的基因首次實現(xiàn)在大腸桿菌中的表達 1977年，生長激素抑制素在大腸桿菌中成功表達 1978年，人胰島素在大腸桿菌中成功合成 1979年，人生長激素在大腸桿菌中得以表達 1980年，人干擾素在大腸桿菌中成功表達 1982年，巨型小鼠培育成功,巨型小鼠和熒光小鼠分別植入了“大鼠生長激素基因”和“水母熒光基因”。,基因工程的實施至少要有四個必要條件,供體基因,受體細胞,載體,工具酶,基因工程的工具酶與載體,分子手術(shù)刀限制性核酸內(nèi)切酶。 分子針線（分子縫合針） DNA連接酶。 基因的運輸工具（分子運輸車）載體。,

4、限制性核酸內(nèi)切酶,限制性內(nèi)切酶是在生物體(主要是微生物)內(nèi)的一種酶，能將外來的DNA切斷，由于這種切割作用是在DNA分子內(nèi)部進行的，故名限制性核酸內(nèi)切酶。,即每種限制性內(nèi)切酶只能識別特定的核苷酸序列，并在特定的位點上切割DNA分子。,特點：,特異性。,舉例：EcoR1限制酶、Sma1限制酶,限制性內(nèi)切酶作用示意圖,磷酸二酯鍵,平(口)末端,回文序列,要想獲得某個特定性狀的基因必須要用限制酶切幾個切口？可產(chǎn)生幾個黏性末端？,要切兩個切口，產(chǎn)生四個黏性末端。,如果把兩種來源不同的DNA用同一種限制酶來切割，會怎樣呢？,會產(chǎn)生相同的黏性末端，然后讓兩者的黏性末端黏合起來，就似乎可以合成重組的DNA分

5、子了。,A A T G A A T T C G A T G A T T C C G T A A T G A A T T C G A,T T A C T T A A G C T A C T A A G G C A T T A C T T A A G G C,DNA連接酶（DNA ligase）,連接的部位：,用DNA連接酶連接兩個相同的黏性未端要連接幾個磷酸二酯鍵？,磷酸二酯鍵，不是氫鍵。,磷酸二酯鍵,連接酶的種類,E.coli DNA 連接酶 T4 DNA 連接酶,30,外源基因(如大鼠生長激素基因)怎樣才能導(dǎo)入受體細胞(如小鼠受精卵)？,導(dǎo)入過程需要運輸工具載體。,載體的作用有哪些？,作用一

6、：作為運載工具，將外源基因轉(zhuǎn)移到受體細胞中去。 作用二：利用載體在受體細胞內(nèi)，對外源基因進行大量復(fù)制。,作為載體必須具備哪些條件？,1）能夠在宿主細胞中復(fù)制并穩(wěn)定地保存。 2）具多個限制酶切點，以便與外源基因連接。 3）具有某些標記基因，便于進行篩選。 如抗菌素的抗性基因、產(chǎn)物具有顏色反應(yīng)的基因等。,載體,常用的載體主要有兩類： 1）細菌細胞質(zhì)的質(zhì)粒 2）噬菌體或某些動植物病毒,質(zhì)粒的特點,細胞染色體外能自主復(fù)制的小型環(huán)狀DNA分子； 質(zhì)粒是基因工程中最早應(yīng)用也是最常用的載體； 存在于許多細菌及酵母菌等生物中； 質(zhì)粒的存在對宿主細胞的生存無影響； 質(zhì)粒的復(fù)制只能在宿主細胞內(nèi)完成。,最常用的質(zhì)粒

7、是大腸桿菌的質(zhì)粒，其中常含有抗藥基因，如四環(huán)素等標記基因。,最簡單的質(zhì)粒載體必需包括3部分： 復(fù)制區(qū)（含復(fù)制原點） 目的基因插入點 遺傳標記基因,1.下列有關(guān)基因工程中限制性核酸內(nèi)切酶的描述， 錯誤的是 （ ） A.一種限制性核酸內(nèi)切酶只能識別一種特定的脫 氧核苷酸序列 B.限制性核酸內(nèi)切酶的活性受溫度的影響 C.限制性核酸內(nèi)切酶能識別和切割RNA D.限制性核酸內(nèi)切酶可從原核生物中提取,C,反饋練習,2.下列關(guān)于DNA連接酶作用的敘述，正確的是（ ） A.將單個核苷酸加到某DNA片段末端，形成磷酸二酯鍵 B.將斷開的兩個DNA片段的骨架連接起來，重新形成磷酸二酯鍵 C.連接兩條DNA鏈上堿基

8、之間的氫鍵 D.只能將雙鏈DNA片段互補的黏性末端之間連接起來，而不能將雙鏈DNA片段平末端之間進行連接,B,3.下表關(guān)于基因工程中有關(guān)基因操作的名詞及對應(yīng) 的內(nèi)容，正確的組合是 （ ）,C,4,5,42,基因工程的一般步驟,獲得目的基因（目的基因的獲取） 制備重組DNA分子（基因表達載體的構(gòu)建） 轉(zhuǎn)化受體細胞 (將目的基因?qū)胧荏w細胞) 外源基因陽性克隆的鑒定和篩選 （篩選出獲得目的基因的受體細胞、培養(yǎng)重組細胞） 5. 目的基因的表達（目的基因的檢測和鑒定）,第一步：獲取目的基因,方法：,將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導(dǎo)入受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱

9、為基因文庫（gene library）,基因組文庫 cDNA文庫,1.從基因文庫中獲取目的基因。,基因文庫的構(gòu)建模式圖,通過對 受體菌的 培養(yǎng)而 儲存基因,2.利用PCR技術(shù)擴增目的基因,PCR（polymerase chain reaction）:聚合酶鏈式反應(yīng).是以DNA變性、復(fù)制的某些特性為原理設(shè)計的.1988，K.Mulllis莫里斯發(fā)明。 前提條件是必須對目的基因有一定的了解，需要設(shè)計引物。,3.通過化學方法直接人工合成,高溫變性,低溫退火(復(fù)性),中溫延伸,第二步： 制備重組DNA分子 （基因表達載體的構(gòu)建）,核心,限制性核酸內(nèi)切酶,需要哪兩種工具？,DNA連接酶,總結(jié)：表達載體需

10、由哪幾部分組成,復(fù)制原點 啟動子 目的基因 終止子 標記基因,第三步：轉(zhuǎn)化受體細胞 （將目的基因?qū)胧荏w細胞）,將目的基因?qū)胫参锛毎?將目的基因?qū)雱游锛毎?將目的基因?qū)胛⑸锛毎?目的基因進入受體細胞，并且在受體細胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達的過程，稱為轉(zhuǎn)化（ruansformation）,將目的基因?qū)胫参锛毎姆椒?農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法,基因槍法,花粉管通道法,土壤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法示意圖,普通番茄為什么不耐貯藏？ 說出抗軟化番茄的培育過程。,將目的基因?qū)雱游锛毎姆椒?顯微注射法,1982年，美國，帕米特（R.Palmiter）超級小鼠,將目的基因?qū)胛⑸锛毎椒?宿主細胞（大腸桿菌）,感受態(tài)細胞（大

11、腸桿菌）,Ca2+,基因工程中常用的宿主細胞有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、酵母菌、霉菌、植物細胞、昆蟲細胞及哺乳動物細胞等。,將目的基因?qū)胧荏w細胞,擴增,第四步：目的基因的檢測與鑒定,首先： 其次： 最后： 還要：,要檢測轉(zhuǎn)基因生物的DNA上是否插入目的基因,DNA分子雜交技術(shù) 分子探針,檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA,檢測目的基因是否翻譯出蛋白質(zhì),個體生物學水平的鑒定,DNA分子雜交技術(shù),基因探針：核酸分子探針是指特定的已知核酸片段，能與互補核酸序列退火雜交，用于對待測核酸樣品中特定基因順序的探測。 滿足：（1）必須是單鏈，（2）帶有容易被檢測出來的標記物。,基因探針的標記和工作程序

12、作為探針的核酸樣品必須進行標記才能被檢測。常用放射性同位素有32P、5S、125I及3H等標記。 標記好的探針即可用于和待測樣品DNA進行雜交反應(yīng)，然后通過放射自顯影來檢測。,第五步：目的基因的表達,使導(dǎo)入寄主細胞的目的基因表達出我們所需要的基因產(chǎn)物。,1.下列有關(guān)基因工程技術(shù)的敘述，正確的是（ ） A.重組DNA技術(shù)所用的工具酶是限制性核酸內(nèi)切 酶、連接酶和載體 B.所有的限制性核酸內(nèi)切酶都只能識別同一種特 定的核苷酸序列 C.選用細菌作為重組質(zhì)粒的受體細胞是因為細菌 繁殖快 D.只要目的基因進入受體細胞就能實現(xiàn)表達,反饋練習,2,3（2010江蘇高考，27題，8分）下表中列出了幾種限制酶識

13、別序列及其切割位點，圖l、圖2中箭頭表示相關(guān)限制酶的酶切位點。請回答下列問題：,（1）一個圖1所示的質(zhì)粒分子經(jīng)Sma 切割前后，分別含有 個游離的磷酸基團。,0、2,（2）若對圖中質(zhì)粒進行改造，插入的Sma酶切位點越多，質(zhì)粒的熱穩(wěn)定性越 。 （3）用圖中的質(zhì)粒和外源DNA構(gòu)建重組質(zhì)粒，不能使用Sma切割，原因是 。 （4）與只使用EcoR I相比較，使用BamH 和Hind 兩種限制酶同時處理質(zhì)粒、外源DNA的優(yōu)點在于可以防止 。 （5）為了獲取重組質(zhì)粒，將切割后的質(zhì)粒與目的基因片段混合，并加入 酶。 （6）重組質(zhì)粒中抗生素抗性基因的作用是為了 。 （7）為了從cDNA文庫中分離獲取蔗糖轉(zhuǎn)運蛋

14、白基因，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入喪失吸收蔗糖能力的大腸桿菌突變體，然后在 的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以完成目的基因表達的初步檢測。,高,Sma破壞質(zhì)粒上的抗性基因和外源DNA中的目的基因,質(zhì)粒和含目的基因的外源DNA片段自身環(huán)化,DNA連接,鑒別和篩選含有目的基因的細胞,蔗糖為唯一含碳營養(yǎng)物質(zhì),基因工程的應(yīng)用 基因工程技術(shù)已經(jīng)在醫(yī)學、工業(yè)、農(nóng)業(yè)等各個領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。,（1）在醫(yī)學上的應(yīng)用 基因工程被用于大量生產(chǎn)過去難以得到或幾乎不可能得到的蛋白質(zhì)肽類藥物。,基因工程疫苗 乙型肝炎是危害我國人民健康的嚴重疾病，我國乙肝病毒攜帶者1億 1千萬人，其中40左右的慢性肝炎可能發(fā)展成為肝硬化和原發(fā)肝癌。以往乙肝疫苗是

15、從人血清中提取，基因工程乙肝疫苗的研制成功，不僅有巨大的經(jīng)濟效益，而且有巨大的社會效益。基因工程乙肝疫苗是我國正式批準投放市場的第一種高技術(shù)疫苗，在20多項指標上達到國際先進水平，獲國家科技進步一等獎。繼乙肝疫苗之后，我國又研制成功了痢疾、霍亂等數(shù)種基因工程疫苗，并經(jīng)國家批準進入臨床試驗。,基因工程藥物 干擾素是一種廣譜的抗病毒和抗腫瘤高技術(shù)藥物，對防治病毒性肝炎和惡性腫瘤有重要的作用?，F(xiàn)已有了3個品種的基因工程干擾素獲得國家新藥證書，開始大批量生產(chǎn)。除此之外，我 國還研制成功了肝癌導(dǎo)向藥物（生物炸彈）、系列惡性腫瘤輔助治療藥物等十余種基因工程藥物，有些已獲試生產(chǎn)文號或進入中試開發(fā)階段。,胰島

16、素,1000 磅牛胰 10 克胰島素,200 升發(fā)酵液 10 克胰島素,干擾素,1200 升人血 1 升發(fā)酵液,23 萬美元 / 病人 200300 美元 / 病人,用于提高奶酪產(chǎn)量 生產(chǎn)奶酪的凝乳酶傳統(tǒng)上來自哺乳小牛的胃。現(xiàn)在可以通過基因工程辦法，用酵母生產(chǎn)凝乳酶，大量用于奶酪制造。,哺乳小牛 凝乳酶基因,胃 轉(zhuǎn)入啤酒酵母,凝乳酶 凝乳酶,制造奶酪,（2）轉(zhuǎn)基因動物和植物 轉(zhuǎn)基因動物首先在小鼠獲得成功?，F(xiàn)在轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)已用于牛、羊，使得從 牛/羊 奶中可以生產(chǎn)蛋白質(zhì)藥物。稱為“乳腺反應(yīng)器”工程。 轉(zhuǎn)基因植物亦已在大田中廣為播,把大鼠生長因子轉(zhuǎn)入小鼠,得到巨大型的轉(zhuǎn)基因小鼠。,核移植，就是利

17、用一個動物體細胞的細胞核（供體核）來取代受精或未受精卵中的細胞核，形成一個重建的“合子”。 克隆原意是無性繁殖。克隆動物就是不經(jīng)過生殖細胞的受精過程而直接由體細胞獲得新的動物個體，這個新個體是原核供體動物的拷貝。 多莉(Dolly)：1996.7.52003.2.14,277次乳腺細胞核移植實驗；獲得29個發(fā)育為8細胞的“胚”；13頭代孕母親； 1996年7月5日，羊羔6LL3，被命名為“多莉”。,幾點說明,任何一個高等動物的細胞或個體都有兩套獨立的遺傳系統(tǒng)：細胞核遺傳系統(tǒng)和細胞質(zhì)遺傳系統(tǒng)（線粒體和葉綠體DNA）。 細胞質(zhì)遺傳系統(tǒng)與細胞核遺傳系統(tǒng)有著密切的關(guān)系，但線粒體和葉綠體DNA上的基因是

18、細胞核的染色體上所沒有的，因此，細胞質(zhì)遺傳系統(tǒng)的功能不能由細胞核遺傳系統(tǒng)來代行。 由于動物的精子不為后代提供細胞質(zhì)，所以高等動物的線粒體是通過母系的細胞質(zhì)來遺傳的，即其后代的所有線粒體都來自于母親，與父親無關(guān)。,（1）多莉并不是與母體完全一樣的克隆,多莉的細胞核來自芬蘭白面母羊，但線粒體DNA分析確認其線粒體來自蘇格蘭黑面母羊，由于線粒體在細胞生命活動中具有極其重要的功能，與許多生理活動密切相關(guān)，因此多莉在生理上與其母體也會有明顯的差異。 多莉的誕生顯示了用生物技術(shù)復(fù)制與母體完全一樣個體的可能性：如果受體細胞的去核卵與體細胞是來自于同一個體，則所得復(fù)制體的細胞質(zhì)與細胞核里的基因都與母體是完全一

19、樣的，這樣的克隆才是母體真實的復(fù)制品。 女性有可能用自身的體細胞和去核卵細胞克隆出與自己遺傳組成和生理特征完全一樣的個體；而克隆技術(shù)不可能用男性的體細胞復(fù)制出與原來個體在遺傳上完全相同的克隆。,動物克隆和轉(zhuǎn)基因研究 在“神舟”五號成功著陸的同一天，包括兩頭轉(zhuǎn)基因體細胞克隆牛在內(nèi)的10頭體細胞克隆?，F(xiàn)身山東梁山縣。我國轉(zhuǎn)基因體細胞克隆技術(shù)及體細胞克隆技術(shù)的研究與應(yīng)用達到國際前沿水平。 體細胞克隆牛“樂娃”，由于成功地轉(zhuǎn)入了綠色熒光蛋白基因，成為我國首例轉(zhuǎn)基因體細胞克隆牛，標志著我國在轉(zhuǎn)基因體細胞克隆技術(shù)方面的新突破。,轉(zhuǎn)基因植物獲得新的性狀,轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物產(chǎn)品市場銷售額：（世界市場） 1995年

20、0.75億美元 1998年 15億美元（4年增長20倍） 2000年 30億美元 2010年 將達到200億美元,中國已經(jīng)批準進入大田的轉(zhuǎn)基因植物,馬鈴薯：抗病毒、抗逆、高營養(yǎng)品質(zhì) 水稻：抗病毒、抗蟲、抗除草劑 棉花：抗蟲 玉米：抗蟲 大豆：抗除草劑 小麥：抗除草劑、高營養(yǎng)品質(zhì) 番茄：抗病、耐儲存 甜椒：抗病,辣椒：抗病毒 煙草：抗病毒、抗蟲 番木瓜：抗病毒 矮牽牛：改變花色 楊樹：抗蟲 微生物：提高固氮效率,我國基因工程部分研究進展,轉(zhuǎn)基因抗病蟲植物 我國科學家將抗蟲基因?qū)朊藁?，獲得了抗蟲植株，對棉蛉蟲的抗蟲效果十分顯著?？裹S矮病、赤霉病、白粉病轉(zhuǎn)基因小麥和抗青枯病馬鈴薯也已研究成功，開始田間加代繁殖。,生產(chǎn)部件,（3）工程菌在環(huán)境工程中應(yīng)用 美國 GE 公司構(gòu)造成功具有巨大烴類分解能力的工程菌，并獲專利，用于清除石油污染。,噴灑工程菌清除石油污染,無冰晶細菌幫助草莓抗霜凍,（4）工業(yè)領(lǐng)域,環(huán)保工業(yè) 能降解工業(yè)廢品、農(nóng)藥殘留等基因工程菌的構(gòu)建 酶制劑工業(yè) 耐熱、耐壓、耐鹽、耐溶劑的酶基因轉(zhuǎn)化構(gòu)建的工程菌 食品工業(yè) 改善食品品質(zhì)的轉(zhuǎn)基因作物 化學與能源工業(yè) 生產(chǎn)乙醇、甘油、丙酮等的轉(zhuǎn)基因生物,