細菌耐藥機制(huishi)ppt課件

1、.,細菌耐藥機制研究進展,浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 俞云松,.,.,.,一、外膜孔蛋白減少或丟失,細胞內(nèi)抗生素濃度降低 膜孔蛋白(OprD):,.,細胞外膜上的某些特殊蛋白是一種非特異性的、跨越細胞膜的水溶性物質(zhì)擴散通道。,膜 孔 蛋 白,.,革 蘭 陰 性 細 菌 細 胞 膜,.,某些細菌本身存在的膜孔蛋白較少或蛋白通道較小，使一些抗菌藥物不能進入菌體內(nèi)部，稱為“內(nèi)在性耐藥”或“固有性耐藥”（intrinsically resistant），即這種耐藥并非是由于任何染色體的突變或是耐藥質(zhì)粒的獲得所致。 如銅綠假單胞菌的細胞外膜上沒有大多數(shù)革蘭陰性細菌所具有的典型的高滲透性孔蛋白，它的孔蛋白

2、通道對小分子物質(zhì)的滲透速度僅為典型孔蛋白通道的1%。,“先天不足”,.,一些具有高滲透性外膜且對抗菌藥物敏感的細菌可以通過降低外膜的滲透性而發(fā)展成為耐藥菌，即原有的孔蛋白通道由于細菌發(fā)生突變而使該孔蛋白通道關(guān)閉或消失，則細菌就會對該抗菌藥物產(chǎn)生很高的耐藥性。 亞胺培南是一種非典型的-內(nèi)酰胺類抗菌藥物，主要是通過一個特殊的孔蛋白通道OprD2的擴散進入細菌的，一旦這一孔蛋白通道消失，則產(chǎn)生耐藥性。,“后天獲得”,.,產(chǎn)氣腸桿菌從亞胺培能敏感株變?yōu)槟退幹?.,亞胺培南敏感及耐藥的產(chǎn)氣腸桿菌PFGE圖,C1 C2:亞胺培南敏感 C3 C4:亞胺培南耐藥,.,亞胺培南敏感及耐藥的產(chǎn)氣腸桿菌SDS圖,C

3、1 C2:亞胺培南敏感 C3 C4:亞胺培南耐藥,.,PCR擴增Omp36全長及序列分析,IS903 98%,（約1000bp),.,插入序列引起OprD2缺失（銅綠）,.,細菌產(chǎn)生一種或多種水解酶或鈍化酶來水解或修飾進入細胞內(nèi)的抗菌藥物，使之到達靶位之前失去活性 細菌產(chǎn)生的滅活酶主要有： -內(nèi)酰胺酶 氨基糖苷類鈍化酶 氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶 MLS鈍化酶,二、 產(chǎn)生滅活酶,.,-內(nèi)酰胺酶,臨床上最重要的-內(nèi)酰胺酶,.,是質(zhì)粒介導(dǎo)的能夠水解頭孢他啶、頭孢噻肟等亞氨基-內(nèi)酰胺類及氨曲南等單環(huán)酰胺類抗生素，并可被克拉維酸等-內(nèi)酰胺酶抑制劑所抑制的一類-內(nèi)酰胺酶。 ESBLs在分子生物學(xué)分類中屬于A類酶，

4、在Bush分類中屬于2be類酶。,超廣譜-內(nèi)酰胺酶 （extended-spectrum -lactamases，ESBLs）,.,ESBLs的分類,根據(jù)基因同源性不同分為： TEM型 80 SHV型 46 CTX-M型 37 OXA型 18 其它型 20,/studies/webt.htm.,CTX-M-1組 CTX-M-2組 CTX-M-8組 CTX-M-9組,.,中國400株大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌的基因型分布,.,32家醫(yī)院 1994-2003年大腸桿菌及肺炎克雷伯菌產(chǎn)ESBLs百分率,.,頭孢菌素酶,大部分腸桿菌科細菌如腸桿菌屬菌種、弗勞地枸櫞酸

5、桿菌、摩根摩根菌、普魯菲登菌屬菌種粘質(zhì)沙雷菌等都能產(chǎn)生染色體介導(dǎo)的AmpC酶。,.,陰溝腸桿菌,.,ACT-1,DHA-1,CMY (Peking),DHA-1,CIT,ACT-1 (Shanghai),DHA-1 (Zhejiang),DHA-1,ACT-1 (GuangZhou),DHA-1 is The Predominant Type in China,Map of China,.,克隆片段,PCR產(chǎn)物1100bp,共6432bp,ORF1,ORF2,ORF3,ORF4,ORF5,ORF6,IS26,orf-1,DHA-1 ampR qacE1 sul1,5232 bp,.,指所有能明

6、顯水解亞胺培南或美羅培南等碳青霉烯類抗生素的一類內(nèi)酰胺酶 分別屬于Ambler分子分類中的A類、B類、D類酶 。,碳青霉烯酶,.,天然來源碳青霉烯酶 嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌的L1酶 獲得性碳青霉烯酶（Ambler分子分類） B類酶（金屬酶）：IMP、VIM類及SPM-1 A類酶：NMC-A、KPC-1、GES-2等 D類酶：OXA-23至OXA-27、40、48、54,碳青霉烯酶按其來源可分為,.,金屬酶,染色體編碼的金屬酶：BC ，L1,TUS-1,MUS-1,Sfh-1,Mbl1b，大多來源于環(huán)境寄生菌。 獲得性金屬酶：IMP VIM SPM GIM-1 SIM-1，位于可轉(zhuǎn)移的基因元件上，造成

7、區(qū)域性傳播。,.,IMP型金屬酶,IMP型金屬酶GenBank上已公布21種，比較它們相互之間的序列表明：IMP型金屬酶大致可以分為兩組： 1）IMP-1、IMP3-7、IMP911、IMP-16 2）IMP-2和IMP-8、12、13、19、20,.,中國,IMP-4 2001年香港 鮑曼 2001年廣州 楊格枸櫞酸桿菌 、銅綠 IMP-1 2004年12月 江蘇無錫 銅綠 IMP-8 2001 臺灣 銅綠,.,VIM型金屬酶,VIM型金屬酶 與IMP類金屬酶同源性40，但兩類金屬酶的動力學(xué)性質(zhì)相似，編碼基因都位于整合子上。 目前VIM型金屬酶GenBank上已公布12種，比較它們相互之間的

8、序列可將VIM金屬酶大致分為三組： 1）VIM-1、4、5、11a 2）VIM-2、3、6、8、9、10、11b 3）VIM-7,.,VIM型金屬酶分布,VIM-1 1999年 意大利 銅綠 氧化木糖產(chǎn)堿桿菌 惡臭假單胞 20032004希臘 大腸 肺克 法國 肺克 VIM-2 2000 法國 銅綠 意大利 希臘 日本 韓國 葡萄牙 西班牙 波蘭 克羅地亞 智利 阿根廷 美國 中國 VIM-3 2001年 臺灣地區(qū) 銅綠 VIM-4 2002年 希臘 銅綠 2003 瑞典 銅綠 2004 意大利 肺克 陰溝 2004 波蘭 銅綠,.,VIM-5 2004 土耳其 肺克 銅綠 VIM-6 200

9、4 新加坡 惡臭假單胞 VIM-7 2004 美國 銅綠 VIM-8 哥倫比亞 銅綠 VIM-9，10 英國 VIM-11 阿根廷 意大利,VIM型金屬酶分布,.,亞胺培南耐藥銅綠假單胞菌金屬酶檢測結(jié)果,.,VIM-2基因整合子結(jié)構(gòu)圖,A： B2， B3， B28， H19， H26， H54， G4 結(jié)構(gòu)同In72 B： S5， S9， S10， S11， S12 （S15、H22除外）,A B,.,H22H26 g4 s5 s9 s10 s11 s12 s15 b2 b3 b28 w19w54Marker,50kb,A,B,H22H26 g4 s5 s9 s10 s11 s12 s15 b

10、2 b3 b28 w19w54Marker,PFGE譜分析結(jié)果：共有七種類型，來自上海的六株為同一類型，來自北京的三株分兩個類型，來自杭州的四株同樣也分兩個類型。各地區(qū)之間的類型各不相同。 反復(fù)嘗試通過接合試驗及質(zhì)粒抽提物電轉(zhuǎn)化傳遞金屬酶基因均未獲成功。經(jīng)XbaI內(nèi)切酶消化的染色體PFGE與VIM-2探針雜交顯示其中10株銅綠假單胞菌50-kb大小的酶切片段雜交陽性，而其余3株（H22、H26、B2）沒有陽性片段。,.,類酶 包括陰溝腸桿菌、粘質(zhì)沙雷菌中由染色體介導(dǎo)的NMC-A、Sme-1Sme-3、IMI-1酶，以及肺炎克雷伯菌中質(zhì)粒介導(dǎo)的KPC-1-4酶、銅綠假單胞菌中質(zhì)粒介導(dǎo)的GES-2

11、酶。,碳青霉烯類抗生素水解酶,.,二株產(chǎn)IMI-1陰溝腸桿菌PFGE結(jié)果,.,E cloacae 8, E C600, E.coli C600E8，E.coli pT103 和E.coli DH5對抗菌藥物的體外抗菌活性,.,陰溝腸桿菌、接合菌質(zhì)粒電泳圖譜,M1A B M2,54kb,15kb,.,Schematic representation of the cloned E.coRfragment,IS903,IMI-2,Imi-2R,IS903,IS2,903bp 921bp 882bp 876bp 921bp,10629bp,(GenBank accession number : AY

12、780889 ),Imi-R與ImiR同源性為97%。IMI-2與IMI-1同源性99%，僅在37位由天冬氨酸天冬酰胺，106位由組氨酸酪氨酸,.,多重耐藥肺炎克雷伯菌,.,轉(zhuǎn)化試驗,抽提亞胺培南耐藥的肺炎克雷伯菌質(zhì)粒 轉(zhuǎn)化DH5，在含1g/ml的亞胺培南的MH平板上篩選 成功篩選到亞胺培南耐藥的轉(zhuǎn)化菌（轉(zhuǎn)化質(zhì)粒約60kb）,染色體帶,61kb,.,PCR,PCR篩選內(nèi)酰胺酶耐藥基因包括TEM-1、SHV、CTX-M-1、CTX-M-9、OXA-48、VIM 、 OXA-10和KPC-1 以肺炎克雷伯菌質(zhì)粒DNA為模板PCR陽性為TEM、SHV和KPC 轉(zhuǎn)化菌和克隆菌只有KPC陽性 PCR產(chǎn)物

13、測序分別為TEM-1、SHV-12和KPC-2,.,轉(zhuǎn)化菌質(zhì)粒（亞胺培南耐藥基因克?。?EcoR, Hind，Nhe等,酶切,Nhe,pTeasy Vector,pTeasy Vector,1.5kb,在含亞胺培南1g/ml MH平板篩選,.,克隆片段測序,對重組質(zhì)粒的插入片段進行步移測序，獲得1554bp核苷酸 DNAssist軟件分析，1個開放讀碼框(ORF) 經(jīng)GenBank Blast程序分析，該ORF與KPC-2 (GenBank注冊號:AY210886) 的核苷酸序列同源性為100%,.,D類酶 （OXA酶） 在Bush分群中屬于2d類，對苯唑西林的水解活性很強。OXA型碳青霉烯酶

14、對亞胺培南的水解活性較低，對頭孢他啶、頭孢噻肟、氨曲南水解活性也很弱。 除OXA-23外，其它酶能被三唑巴坦、克拉維酸抑制。 OXA型碳青霉烯酶編碼基因可位于質(zhì)粒或染色體上，或定位在I型整合子基因盒中，具備向其他菌種轉(zhuǎn)移的能力,碳青霉烯類抗生素水解酶,.,blaOXA-23-like,blaOXA-51-like是我國鮑曼不動桿菌最主要的碳青霉烯酶，ISAba1與OXA基因的表達和轉(zhuǎn)移密切相關(guān),342株亞胺培南耐藥鮑曼不動桿菌中339株檢測到至少一種OXA基因，303株檢測到OXA-23-like和OXA-51-like基因，22株只檢測到OXA-23-like基因，17株只檢測到OXA-51

15、-like基因；其中在313株菌株的OXA-23-like基因上游34bp處檢測到ISAba1，在13株菌株的OXA-51-like基因上游7bp處檢測到ISAba1。,.,氨基糖苷類鈍化酶分為： 磷酸轉(zhuǎn)移酶（APH） 乙酰轉(zhuǎn)移酶（AAC） 核苷轉(zhuǎn)移酶（ANT） 氨基糖苷類鈍化酶作用機制： 三者分別使抗生素的羥基磷酸化、氨基乙?；土u基核苷化，使之不能再與細菌核糖體結(jié)合。,氨基糖苷類耐藥,.,慶大霉素高水平耐藥（HLGR ） 主要的耐藥機制 氨基糖苷類修飾酶 耐藥基因 百分率 AAC(6)-Ie-APH(2)-Ia aac(6)-Ie-aph(2)-Ia 90% APH(2)-Ic aph(2

16、)-Ic APH(2)-Id aph(2)-Id APH(2)-Ib aph(2)-Ib,10%,氨基糖苷類耐藥,.,8,724bp,ORF1,ORF2,ORF4,ORF3,5,3,ISEcp1 (tnpA),aph-Ie,repD,str部分序列,一種新的質(zhì)粒介導(dǎo)的腸球菌氨基糖苷類耐藥基因aph(2”)-Ie,.,三、靶位改變,.,主要抗菌藥物作用靶位,-內(nèi)酰胺類 青霉素結(jié)合蛋白（PBP） 氨基糖苷類 核糖體30S亞基 大環(huán)內(nèi)酯類 核糖體50S亞基 氟喹諾酮類 DNA旋轉(zhuǎn)酶（拓撲異構(gòu)酶 ）、拓撲異構(gòu)酶 糖肽類 D-丙氨酰D-丙氨酸 四環(huán)素類 核糖體50S亞基,.,PBP2a的作用,PBP2a

17、與-內(nèi)酰胺抗生素親和力低，替代正常PBP功能 87KdaPBP1 80 PBP2 78 PBP2a 75 PBP3 70 PBP3 41 PBP4,.,DR,IR,IR,DR,SCCmec,SCCmec,.,.,IV型,.,VS,HA-MRSA,CA-MRSA,高 耐藥性 較低 陰性 PVL 陽性 I、II、III SCCmec IV、V,.,金葡菌耐藥性的發(fā)展歷程,S. aureus,Penicillin-resistant S. aureus,Methicillin-resistant S. aureus (MRSA),Penicillin,Methicillin,Vancomycin-r

18、esistant enterococcus (VRE),Vancomycin (glycopeptide)- Intermediate-Resistant S. Aureus （VISA、GISA）,Vancomycin- Resistant S. Aureus （VRSA）,Vancomycin,1940,1960s,1990s,1996,Superbugs,2002,.,氟喹喏酮的耐藥機理,拓撲異構(gòu)酶 IV (parC, parE),拓撲異構(gòu)酶 II (gyrA, gyrB),氟喹喏酮,.,糖肽類抗生素包括萬古霉素、替考拉寧等，是高分子量的疏水性化合物。 主要耐藥機制： VRE的細胞壁肽糖

19、前體末端的D-丙氨酰-D-丙氨酸發(fā)生了改變，萬古霉素不能與之相結(jié)合，因此不能抑制VRE的細胞壁合成。,耐萬古霉素的腸球菌（VRE）,.,transposase,resolvase,vanR,vanS,vanH,vanA,vanX,6590bp (ZY02, HS3 ),表示PCR擴增,vanY,vanZ,10Kb （ZY01）,轉(zhuǎn)座功能（轉(zhuǎn)座酶transposase基因和解離酶revolsase基因，分別編碼產(chǎn)生轉(zhuǎn)座酶和解離酶在轉(zhuǎn)座過程中發(fā)揮作用） 調(diào)控耐藥基因（VanR和VanS） 產(chǎn)生耐糖肽類的縮肽（VanH脫氫酶、VanA連接酶和VanX二肽酶） 輔助蛋白（VanY和VanZ）,含Van

20、A基因簇的轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座入各種質(zhì)粒，或通過接合轉(zhuǎn)座導(dǎo)致VRE耐藥性的傳播,.,大環(huán)內(nèi)酯類的耐藥機制,核糖體靶位點的改變: erm 編碼，高耐; 法國、西班牙、中國 主動外排泵: mef 編碼，低耐 ，加拿大、美國、 修飾酶,.,16S rRNA甲基化酶,氨基糖苷類抗生素作用位點：細菌16S rRNA 以往認為最重要的氨基糖苷類抗生素耐藥機制：修飾酶，作用位點在藥物，引起一種或幾種藥物耐藥 2002最新發(fā)現(xiàn)一類新的氨基糖苷類抗生素耐藥機制： 16S rRNA甲基化酶，引起藥物作用位點的甲基化，導(dǎo)致細菌對所有氨基糖苷類抗生素高水平耐藥，目前發(fā)現(xiàn)4種：armA、rmtA、rmtB、rmtC 多重耐藥鮑曼

21、不動桿菌在我國各省市廣泛流行，該菌對氨基糖苷類抗生素耐藥率和耐藥水平高 16S rRNA甲基化酶是否在介導(dǎo)該菌對氨基糖苷類抗生素耐藥中發(fā)揮作用需要系統(tǒng)研究,.,700株鮑曼不動桿菌對5種氨基糖苷類抗生素體外抗菌活性,5種氨基糖苷類抗生素耐藥率均大于60； 377株（53.9）菌株對5種氨基糖苷類抗生素均耐藥； 334株（47.7）菌株armA陽性； armA陽性菌株對上述所有氨基糖苷類抗生素均高水平耐藥,MIC256mg/L,反復(fù)進行接合實驗、質(zhì)粒抽提、電轉(zhuǎn)化均未成功 Southern-blot雜交證實armA基因位于克隆A、B、C約220kb、300kb、220kb大小的染色體ApaI酶切條

22、帶上,armA基因定位于鮑曼不動桿菌染色體,.,四、主動外運,有些抗菌藥物（常見的如四環(huán)素類及喹諾酮類）能誘導(dǎo)細菌的主動外運，抗菌藥物難以在細菌內(nèi)積累到有效濃度，造成對抗菌藥物耐藥程度的普遍提高。,.,外排泵的結(jié)構(gòu),外排系統(tǒng)由3個部分組成： 位于內(nèi)膜的腫瘤耐藥分化家族(resistantnodulationdivision family，RND)的質(zhì)膜轉(zhuǎn)運體 內(nèi)外膜之間的膜周連接蛋白或膜融合蛋白(MFP) 位于外膜的孔道形成蛋白(0EP),.,組間外排泵表達量均值比較,.,是指細菌粘附于固體或有機腔道表面，形成微菌落，并分泌細胞外多糖蛋白復(fù)合物將自身包裹其中而形成的膜狀物。其生化組成為藻酸鹽多

23、糖和蛋白復(fù)合物。菌膜可阻止巨噬細胞、抗體、藥物作用于菌體,五、細菌生物被膜（Biofilm）,.,生 物 被 膜,.,細菌形成生物被膜后，往往對抗菌藥物產(chǎn)生高度耐藥性，原因有 細菌生物被膜可減少抗菌藥物滲透 吸附抗菌藥物鈍化酶，促進抗菌藥物水解 細菌生物被膜下細菌代謝低下，對抗菌藥物不敏感 生物被膜的存在阻止了機體對細菌的免疫力，產(chǎn)生免疫逃逸現(xiàn)象，減弱機體免疫力與抗菌藥物的協(xié)同殺菌作用,.,其他耐藥機制,缺乏自溶酶 替代途徑 酶的過量產(chǎn)生等 靶位保護機制,.,質(zhì)粒介導(dǎo)的喹喏酮耐藥,1998年George.A.Jacoby等從一株肺炎克雷伯菌（UAB1）中發(fā)現(xiàn)能介導(dǎo)多種抗生素耐藥的質(zhì)粒pMG252，經(jīng)接合傳遞后其接合子對環(huán)丙沙星的耐藥性增加近30倍(MIC 0.0080.25g /mL)。 在該質(zhì)粒內(nèi)發(fā)現(xiàn)了喹諾酮耐藥（quinolone resistance）基因，命名為qnr (Lancet1998; 351: 79799),.,作用機制,保護DNA旋轉(zhuǎn)酶 Qnr通過與旋轉(zhuǎn)酶特異地