大鼠大腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞原代培養(yǎng)#嚴(yán)選優(yōu)質(zhì)

1、大鼠大腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞原代培養(yǎng)南京軍區(qū)總院神經(jīng)內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室 許麗麗 2012年10月一、試劑1) Poly-L-lysine（Sigma,P2636）2) DMEM（Invitrogen,11995-065）3) FBS（Invitroge,10099-141）精制參照#4) Neurobasal（Invitrogen, 21103-049）5) B27（Invitrogen ,17504-044）6) GlutaMAX （Invitrogen ,35050-061）7) HBSS, no Calcium, no Magnesium（Invitrogen, 14170-112）8) 0.25%

2、Trypsin-EDTA （Invitrogen, 25200-056）9) DPBS（HyClone，SH30028.01B）10) dd H2O11) 10水合氯醛12) 75酒精二、器械1) 手術(shù)器械：組織剪x2、組織鑷x1、直彎鑷各x1、眼科剪x2、眼科鑷直、彎各x2、顯微鑷x2（金鐘，WA3050）、顯微剪x12) 200 ml小燒杯（盛放胎鼠）3) 200目不銹鋼篩4) 細(xì)胞計(jì)數(shù)器（求精）5) 50ml離心管（Corning，430828）、15ml離心管（Corning，430790）6) 6孔板（Corning，3516）或24孔板（Corning，3524）96孔板（cosr

3、er,3599）7) 直徑為60mm的培養(yǎng)皿（LabServ,310109010）8) 3ml移液管（Biologix, 30-0138A1）9) 過(guò)濾器（Millex-GP, SLGP033RB）10) 注射器：50ml、5ml各 111) Pipette and pipette tips12) 冰袋、手套、棉球、棉簽Day 11、消毒1.1 將解剖器械、槍頭高溫高壓消毒15分鐘，消毒結(jié)束后放入烘箱中烘干待第二天使用。1.2 打開操作臺(tái)紫外線燈消毒30分鐘。2、包被培養(yǎng)板2.1 戴手套，用酒精棉球擦拭操作臺(tái)、移液槍，點(diǎn)燃酒精燈。2.2 取PLL，用DPBS將其稀釋至100g/ml。2.3 以

4、PLL包被培養(yǎng)板，量以覆蓋培養(yǎng)板底面為宜。6孔板：1 ml per well；24孔板：0.5 ml per well；96孔板：0.1 ml per well。過(guò)夜。3、配置培養(yǎng)基、消化酶3.1 DMEM with 10% FBSFBS：DMEM=1：10取FBS 4ml、DMEM 40ml加入50ml離心管中混合。3.2 Neurobasal-B27-Glutamine MediumNeurobasal：B27=50:1Neurobasal：GlutaMAX =100:1取Neurobasal 50ml、B27 1ml、GlutaMAX 0.5ml，加入50ml離心管中混合。3.3 0.1

5、25胰酶取0.25Trypsin-EDTA 5ml,用HBSS稀釋至10ml。將配置好的培養(yǎng)基、消化酶放入4C冰箱中，待第二天使用。4、消毒操作臺(tái)使用完畢后清理垃圾，用酒精棉球擦拭操作臺(tái)、移液槍，關(guān)閉酒精燈，打開紫外線燈消毒30分鐘。Day 21、消毒打開操作臺(tái)紫外線燈消毒30分鐘。2、洗板用ddH2O洗滌3 x 5 min，放入培養(yǎng)箱中晾干。3、解剖孕鼠3.1 將已消過(guò)毒的解剖工具和已乘HBSS的小燒杯端入動(dòng)物房。3.2 麻醉：取10水合氯醛5ml,腹腔注射麻醉孕鼠。3.3 75酒精消毒切口部位。3.4 開腹（盡量開口大一些，便于后面操作）使用1把組織鑷、1把組織剪。3.5 分離胎囊。換用另

6、一幅直/彎鑷、組織剪。3.6 將分離出的胎囊放入HBSS中。4、解剖胎鼠（所有操作在冰袋上進(jìn)行）4.1 將盛放胎囊的燒杯放進(jìn)操作臺(tái)。4.2戴手套，用酒精棉球擦拭操作臺(tái)、移液槍，點(diǎn)燃酒精燈。4.3 取3個(gè)培養(yǎng)皿，內(nèi)乘HBSS，放置在冰袋上。將胎鼠從胎囊中取出，剪去頭，將胎頭放入一個(gè)培養(yǎng)皿中。4.5 用兩支顯微鑷撕開腦膜，取出腦組織，將腦組織放入另一乘HBSS的培養(yǎng)皿中（將所有的胎鼠都同樣處理）。4.6 用兩支顯微鑷分離腦膜，盡可能的去掉所有的血管和血管膜，將分離好的腦組織放入另一新的內(nèi)乘HBSS的培養(yǎng)皿中。4.7 將分離好的腦膜用虹膜剪剪碎腦組織，約1mm3。5、接種細(xì)胞5.1 用移液管將剪碎的

7、腦組織移入兩個(gè)15 ml離心管中。5.2 每支離心管加入3 ml 0.125胰酶，搖勻，37消化15分鐘（為增加接觸面積消化更充分可將離心管平放，也可以用60 mm培養(yǎng)皿消化。）5.3 消化期間整理操作臺(tái)。5.4 消化15分鐘后，用移液管移去胰酶，每支離心管加入2 ml 10 FBS/DMEM終止消化。5.5 吹打：用1 ml槍頭，吹打40次，靜止2分鐘，將上面液體移入一新的15ml離心管中。下面沉淀的細(xì)胞團(tuán)塊不要丟棄，加入1-1.5ml10 FBS/DMEM吹打20次，重復(fù)上面的步驟。一共這樣分次吹打3次。3次之后如果還有團(tuán)塊在下面，果斷丟棄。（吹打時(shí)候要注意，切忌過(guò)快，要緩慢吹打。吸入時(shí)候

8、要很緩慢，吹出的時(shí)候可以略快，但是也要緩慢。）5.6 過(guò)篩網(wǎng)至60 mm培養(yǎng)皿中。5.7 將培養(yǎng)皿中液體移入2支15 ml離心管中。5.8 離心：800轉(zhuǎn)5分鐘。5.9 棄上清，沉淀的細(xì)胞加10FBS/DMEM 3ml重懸，輕柔吹打100次（具體吹打次數(shù)據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)看到的情況而定，若看到大量細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)加大吹打次數(shù)）。5.10 用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)：細(xì)胞濃度 = (4個(gè)大格細(xì)胞總數(shù)/4) 104 /ml5.11 調(diào)濃度，接種。接種后搖晃培養(yǎng)板搖勻細(xì)胞（注意不要圈圈搖晃，圈圈搖晃會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元都集中到培養(yǎng)板的孔中間，導(dǎo)致濃度不均，生長(zhǎng)不均勻。要左右平行翻轉(zhuǎn)角度，然后前后平行翻轉(zhuǎn)角度）。具體細(xì)胞接種數(shù)值：培養(yǎng)液體積（ml/well）細(xì)胞密度（個(gè)/ml）總細(xì)胞數(shù)（個(gè)/ well）6孔板1.5ml1x1061x10696孔板0.1ml1x1061x1055.12 兩小時(shí)后全量換液，換用NB27（應(yīng)提前放入37細(xì)胞培養(yǎng)箱中預(yù)熱半小時(shí)）。換液前輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)板（細(xì)胞碎片貼壁很慢而且不牢固，這時(shí)候的