rt-qPCR實(shí)驗(yàn)操作課件

1、Rt-qPCR實(shí)驗(yàn)操作、熒光實(shí)時(shí)定量PCR-qPCR、rt-qPCR實(shí)驗(yàn)操作、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(rt-qPCR)定義：向PCR反應(yīng)系統(tǒng)添加熒光組，利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)監(jiān)控PCR過程，對初始模板進(jìn)行定量分析。rt-qPCR實(shí)驗(yàn)操作，rt-qPCR應(yīng)用，mRNA表達(dá)研究小殘留病變的腫瘤耐藥基因表達(dá)檢測病毒感染的定量監(jiān)測，Rt-qPCR實(shí)驗(yàn)操作，PCR的基本原理，試管中DNA復(fù)制反應(yīng)，1 .根據(jù)DNA半保存復(fù)制的機(jī)制2 .體外DNA分子通過人工控制不同溫度下的可變性和復(fù)性的性質(zhì)，達(dá)到1 .雙股DNA，單股2。單鏈DNA和合成底漆退火3。DNA聚合酶沿著單鏈模板將引物延伸到雙鏈DNA。rt-qPC

2、R實(shí)驗(yàn)運(yùn)行，基本階段變質(zhì)：通過加熱將雙鏈DNA轉(zhuǎn)換為單鏈(94，30s)退火：通過冷卻使引物和互補(bǔ)模板在本地形成混合鏈(55，30s):耐熱DNA聚合酶在53方向以引物為起點(diǎn)，rt-qPCR實(shí)驗(yàn)操作，SYBR Green，SYBR Green可以與雙鏈DNA的小溝部分結(jié)合，只有與雙鏈DNA結(jié)合才能釋放熒光，分離DNA雙鏈后不會(huì)釋放熒光，隨著PCR循環(huán)數(shù)的增加，產(chǎn)品量增加，產(chǎn)生的熒光信號(hào)逐漸增加，熒光信號(hào)和產(chǎn)品的，rt-qPCR實(shí)驗(yàn)操作，理論上，PCR反應(yīng)過程中生成的DNA產(chǎn)物呈指數(shù)增長。也就是說，每增加一次循環(huán)，PCR產(chǎn)物就會(huì)翻倍。但是隨著反應(yīng)周期數(shù)的增加，產(chǎn)物積累和原料消耗，PCR反應(yīng)最終不

3、能保持指數(shù)方式的擴(kuò)大，進(jìn)入線性期間和平臺(tái)。在整個(gè)PCR反應(yīng)過程中，PCR產(chǎn)品的數(shù)量與僅在指數(shù)期間添加的初始模板數(shù)量有明顯的數(shù)學(xué)關(guān)系(PCR產(chǎn)品的數(shù)量=初始模板的數(shù)量2N，N=循環(huán)數(shù)量)，因此可以使用公式準(zhǔn)確估計(jì)產(chǎn)品數(shù)量中的初始模板數(shù)量。在線和平臺(tái)持續(xù)時(shí)間、PCR產(chǎn)品數(shù)量和初始模板數(shù)量之間沒有精確的數(shù)學(xué)關(guān)系，初始模板的數(shù)量由兩個(gè)持續(xù)時(shí)間的產(chǎn)品數(shù)量計(jì)算得不準(zhǔn)確。rt-qPCR實(shí)驗(yàn)，在相同條件下進(jìn)行復(fù)制放大，通過檢測每個(gè)孔的目標(biāo)基因片段數(shù)量的熒光檢查，記錄每個(gè)反應(yīng)管的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)(樣本的域值循環(huán)數(shù)Ct)，就可以知道，原始樣本中目標(biāo)基因越少，即初始模板的數(shù)量越少。rt-qPC

4、R實(shí)驗(yàn)操作，logX=n (1 E) logX0，rt-qPCR實(shí)驗(yàn)操作，實(shí)驗(yàn)階段，1，確定要使用RNA作為cDNA運(yùn)行的基因和要使用的內(nèi)部參數(shù)序列，以及板塊排列順序。2，DNA樣品制備，水，sybr，前后引物，融化，離心力。3、樣品混合物(每個(gè)孔為sybr10ul，cDNA30ug，水為8.4ul-cDNA)，計(jì)算前后底漆數(shù)量(每個(gè)孔和前后底漆各為0.8ul)，并進(jìn)一步計(jì)算1至2個(gè)孔。比例混合樣本，sybr，水。按比例混合前后底漆。4、按樣品混合物的銷售順序，每孔18.4微升，加后適當(dāng)?shù)那昂蟮灼峄旌衔?，每?.6微升。5、薄膜、離心、機(jī)械、實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增后輸出對照組和試驗(yàn)對象基因及內(nèi)部參考基因CT值。實(shí)驗(yàn)組的基因表達(dá)是與對照組相比向上或向下調(diào)整的倍數(shù)的rt-qPCR實(shí)驗(yàn)。，rt-qPCR實(shí)驗(yàn)操作，熒光定量PCR如何減少錯(cuò)誤，1，校準(zhǔn)生物學(xué)錯(cuò)誤：內(nèi)部人參(管家基因)2，隨機(jī)錯(cuò)誤減少，rt-qPCR實(shí)驗(yàn)操作，1，校準(zhǔn)生物學(xué)錯(cuò)誤內(nèi)部參數(shù)(管家基因)，1以基因組(或單個(gè)細(xì)胞)為單位校準(zhǔn)數(shù)量結(jié)果，在不同樣本之間比較的校