蛋白質(zhì)檢測方法

1、蛋白質(zhì)的檢測（參考GB/T6432-94）一、原理凱氏定氮法測定試樣中的含氮量，即在催化劑作用下，用濃硫酸破壞有機(jī)物，使含氮物轉(zhuǎn)化為硫酸銨。加入強(qiáng)堿進(jìn)行蒸餾使氮溢出，再用酸滴定，測出氮含量，將結(jié)果乘以換算系數(shù)6.25，計(jì)算出粗蛋白含量。二、試劑（1） 硫酸 化學(xué)純，含量為98%，無氮；（2） 混合催化劑 0.4g硫酸銅，含5個(gè)結(jié)晶水，6g硫酸鉀或硫酸鈉，均為化學(xué)純，磨碎混勻；（3） 氫氧化鈉 化學(xué)純，40%水溶液（m/V）；（4） 硼酸 化學(xué)純，2%水溶液（m/V）；（5） 混合指示劑 甲基紅0.1%乙醇溶液，溴甲酚綠0.5%乙醇溶液，兩溶液等體積混合，在陰涼處保存期為3個(gè)月；（6） 鹽酸標(biāo)準(zhǔn)

2、溶液 基準(zhǔn)無水碳酸鈉法標(biāo)定；a) 0.1mol/l鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：8.3mL鹽酸注入1000mL蒸餾水中。b) 0.02mol/l鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：1.67mL鹽酸注入1000mL蒸餾水中。（7） 蔗糖 分析純；（8） 硫酸銨 分析純，干燥；（9） 硼酸吸收液 1%硼酸水溶液1000mL，加入0.1%溴甲酚綠乙醇溶液10mL，0.1%甲基紅乙醇溶液7mL，4%氫氧化鈉水溶液，混合，置陰涼處保存期為1個(gè)月（全自動(dòng)程序用）。三、儀器設(shè)備（1） 實(shí)驗(yàn)室用樣品粉碎機(jī)或研缽；（2） 分樣篩 孔徑0.45mm（40目）；（3） 分析天平 感重0.0001g；（4） 消煮爐或電爐；（5） 滴定管 酸式，10、25

3、mL；（6） 凱氏燒瓶 250mL；（7） 凱氏蒸餾裝置 常量直接蒸餾式或半微量水蒸氣蒸餾式；（8） 錐形瓶 150、250mL；（9） 容量瓶 100mL；（10） 消煮管 250mL；（11） 定氮儀 以凱氏原理制造的各類型半自動(dòng)、全自動(dòng)蛋白質(zhì)測定儀。四、分析步驟（一） 仲裁法1. 試樣的消煮 稱取試樣0.5-1g（含氮量5-80mg）（精確至0.0002g），放入凱式燒瓶中，加入6.4g混合催化劑，與試樣混合均勻，再加入12mL硫酸和2粒玻璃珠，將凱式燒瓶置于電爐上加熱，開始小火，待樣品焦化、泡沫消失后，再加強(qiáng)活力（360-410）直至呈透明的藍(lán)綠色，然后再繼續(xù)加熱，消化全過程至少2h。

4、2. 氨的蒸餾（1） 常量蒸餾法 將試樣消煮液冷卻，加入60-100mL蒸餾水，搖勻，冷卻。將蒸餾裝置的冷凝管末端浸入裝有25mL硼酸吸收液和2滴混合指示劑的錐形瓶內(nèi)。然后小心地向凱式燒瓶中加入50mL氫氧化鈉溶液，輕輕搖動(dòng)凱式燒瓶，使溶液混勻后再加熱蒸餾，直至流出液體體積為100mL。降下錐形瓶，使冷凝管末端離開液面，繼續(xù)蒸餾1-2min，并用蒸餾水沖洗冷凝管末端，洗液均流入錐形瓶內(nèi)，然后停止蒸餾。（2） 半微量蒸餾法 將試樣消煮液冷卻，加入20mL蒸餾水，轉(zhuǎn)入100mL容量瓶中，冷卻后用水稀釋至刻度，搖勻，作為試樣分解液。將半微量蒸餾裝置的冷凝管末端浸入裝有20mL硼酸吸收液和2滴混合指示

5、劑的錐形瓶內(nèi)。蒸汽發(fā)生器的水中應(yīng)加入甲基紅指示劑數(shù)滴，在蒸餾過程中保持此液為橙紅色，否則需補(bǔ)充硫酸。準(zhǔn)確移取試樣分解液10-20mL注入蒸餾裝置的反應(yīng)室中，用少量蒸餾水沖洗進(jìn)樣入口，塞好入口玻璃塞，再加10mL氫氧化鈉溶液，小心提起玻璃塞使之流入反應(yīng)室，將玻璃塞塞好，且在入口處加水密封，防止漏氣。蒸餾4min降下錐形瓶使冷凝管末端離開吸收液面，再蒸餾1min，用蒸餾水沖洗冷凝管末端，洗液均流入錐形瓶內(nèi)，然后停止蒸餾。注：兩種蒸餾法測定結(jié)果相近，可任選一種。（3） 蒸餾步驟的檢驗(yàn) 精確稱取0.2g硫酸銨，代替試樣，選仲裁法或推薦法“氨的蒸餾”中的步驟進(jìn)行操作，測得硫酸銨含量為21.19%0.2%

6、，否則應(yīng)檢查加堿、蒸餾和滴定各步驟是否正確。（二） 推薦法1. 試樣的消煮 稱取0.5-1g試樣（含氮量5-80mg）（精確至0.0002g），加入消化管中，加2片消化片（儀器自備）或6.4g混合催化劑，與420下在消煮爐上消化1h。取出冷卻后加入30mL蒸餾水。2. 氨的蒸餾 采用全自動(dòng)定氮儀時(shí)，按儀器本身常量程序進(jìn)行測定。采用半自動(dòng)定氮儀時(shí)，將帶消化液的管子插在蒸餾裝置上，以25mL硼酸為吸收液，加入2滴混合指示劑，蒸餾裝置的冷凝管末端要浸入裝有吸收液的錐形瓶內(nèi)，然后向消煮管中加入50mL氫氧化鈉溶液進(jìn)行蒸餾。蒸餾時(shí)間以吸收液體積達(dá)到100mL為宜。降下錐形瓶，用蒸餾水沖洗冷凝管末端，洗液

7、均流入錐形瓶內(nèi)。3. 滴定 用0.1mol/L的鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定吸收液，溶液由藍(lán)色變成紅色為終點(diǎn)。五、空白測定稱取蔗糖0.5g，代替試樣，進(jìn)行空白測定，消耗0.1mol/L鹽酸溶液的體積不得超過0.2mL。消耗0.02mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液體積不得超過0.3mL。六、分析結(jié)果的計(jì)算和表述計(jì)算見下式：粗蛋白質(zhì)=V2-V1c0.01406.25mVV100%式中：V2滴定試樣時(shí)所需標(biāo)準(zhǔn)酸溶液體積，mL； V1滴定空白時(shí)所需標(biāo)準(zhǔn)酸溶液體積，mL； c鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，mol/L； m試樣質(zhì)量，g V試樣分解液總體積，mL V試樣分解液蒸餾用體積，mL；0.0140與1.00mL鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液【c（HCL）=1.000mol/L】相當(dāng)?shù)?、以克表示的氮的質(zhì)量。 6.25氮換算成蛋白質(zhì)的平均系數(shù)。七、 重復(fù)性 當(dāng)粗蛋白質(zhì)含量在25%以上時(shí)，允許相對偏差為1%。當(dāng)粗蛋白質(zhì)含量在10%-25%以上時(shí)，允許相對偏差為2%。當(dāng)粗蛋白質(zhì)含量在10%以下時(shí)，允許相對偏差為3%。浙江紫香糖業(yè)使用的定氮儀是上海新嘉型號(hào)：KDN-AZ智能型定氮儀蒸餾器 KDN-AZ智能型定氮儀是我公司根據(jù)用戶對儀器自動(dòng)化的需求進(jìn)行改進(jìn)的一款半自動(dòng)凱氏測定裝置，在A型的基礎(chǔ)上安裝了自動(dòng)蒸餾控制元件，使原本繁瑣的蒸餾控制更為簡便，提升了工作效率，保證了樣品測定的精準(zhǔn)性，并且加裝了自動(dòng)排水系統(tǒng)，用戶不用擔(dān)心因蒸發(fā)爐水未排盡而