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文檔簡介
1、蛋白質(zhì)的檢測(參考GB/T6432-94)一、原理凱氏定氮法測定試樣中的含氮量,即在催化劑作用下,用濃硫酸破壞有機(jī)物,使含氮物轉(zhuǎn)化為硫酸銨。加入強(qiáng)堿進(jìn)行蒸餾使氮溢出,再用酸滴定,測出氮含量,將結(jié)果乘以換算系數(shù)6.25,計(jì)算出粗蛋白含量。二、試劑(1) 硫酸 化學(xué)純,含量為98%,無氮;(2) 混合催化劑 0.4g硫酸銅,含5個結(jié)晶水,6g硫酸鉀或硫酸鈉,均為化學(xué)純,磨碎混勻;(3) 氫氧化鈉 化學(xué)純,40%水溶液(m/V);(4) 硼酸 化學(xué)純,2%水溶液(m/V);(5) 混合指示劑 甲基紅0.1%乙醇溶液,溴甲酚綠0.5%乙醇溶液,兩溶液等體積混合,在陰涼處保存期為3個月;(6) 鹽酸標(biāo)準(zhǔn)
2、溶液 基準(zhǔn)無水碳酸鈉法標(biāo)定;a) 0.1mol/l鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液:8.3mL鹽酸注入1000mL蒸餾水中。b) 0.02mol/l鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液:1.67mL鹽酸注入1000mL蒸餾水中。(7) 蔗糖 分析純;(8) 硫酸銨 分析純,干燥;(9) 硼酸吸收液 1%硼酸水溶液1000mL,加入0.1%溴甲酚綠乙醇溶液10mL,0.1%甲基紅乙醇溶液7mL,4%氫氧化鈉水溶液,混合,置陰涼處保存期為1個月(全自動程序用)。三、儀器設(shè)備(1) 實(shí)驗(yàn)室用樣品粉碎機(jī)或研缽;(2) 分樣篩 孔徑0.45mm(40目);(3) 分析天平 感重0.0001g;(4) 消煮爐或電爐;(5) 滴定管 酸式,10、25
3、mL;(6) 凱氏燒瓶 250mL;(7) 凱氏蒸餾裝置 常量直接蒸餾式或半微量水蒸氣蒸餾式;(8) 錐形瓶 150、250mL;(9) 容量瓶 100mL;(10) 消煮管 250mL;(11) 定氮儀 以凱氏原理制造的各類型半自動、全自動蛋白質(zhì)測定儀。四、分析步驟(一) 仲裁法1. 試樣的消煮 稱取試樣0.5-1g(含氮量5-80mg)(精確至0.0002g),放入凱式燒瓶中,加入6.4g混合催化劑,與試樣混合均勻,再加入12mL硫酸和2粒玻璃珠,將凱式燒瓶置于電爐上加熱,開始小火,待樣品焦化、泡沫消失后,再加強(qiáng)活力(360-410)直至呈透明的藍(lán)綠色,然后再繼續(xù)加熱,消化全過程至少2h。
4、2. 氨的蒸餾(1) 常量蒸餾法 將試樣消煮液冷卻,加入60-100mL蒸餾水,搖勻,冷卻。將蒸餾裝置的冷凝管末端浸入裝有25mL硼酸吸收液和2滴混合指示劑的錐形瓶內(nèi)。然后小心地向凱式燒瓶中加入50mL氫氧化鈉溶液,輕輕搖動凱式燒瓶,使溶液混勻后再加熱蒸餾,直至流出液體體積為100mL。降下錐形瓶,使冷凝管末端離開液面,繼續(xù)蒸餾1-2min,并用蒸餾水沖洗冷凝管末端,洗液均流入錐形瓶內(nèi),然后停止蒸餾。(2) 半微量蒸餾法 將試樣消煮液冷卻,加入20mL蒸餾水,轉(zhuǎn)入100mL容量瓶中,冷卻后用水稀釋至刻度,搖勻,作為試樣分解液。將半微量蒸餾裝置的冷凝管末端浸入裝有20mL硼酸吸收液和2滴混合指示
5、劑的錐形瓶內(nèi)。蒸汽發(fā)生器的水中應(yīng)加入甲基紅指示劑數(shù)滴,在蒸餾過程中保持此液為橙紅色,否則需補(bǔ)充硫酸。準(zhǔn)確移取試樣分解液10-20mL注入蒸餾裝置的反應(yīng)室中,用少量蒸餾水沖洗進(jìn)樣入口,塞好入口玻璃塞,再加10mL氫氧化鈉溶液,小心提起玻璃塞使之流入反應(yīng)室,將玻璃塞塞好,且在入口處加水密封,防止漏氣。蒸餾4min降下錐形瓶使冷凝管末端離開吸收液面,再蒸餾1min,用蒸餾水沖洗冷凝管末端,洗液均流入錐形瓶內(nèi),然后停止蒸餾。注:兩種蒸餾法測定結(jié)果相近,可任選一種。(3) 蒸餾步驟的檢驗(yàn) 精確稱取0.2g硫酸銨,代替試樣,選仲裁法或推薦法“氨的蒸餾”中的步驟進(jìn)行操作,測得硫酸銨含量為21.19%0.2%
6、,否則應(yīng)檢查加堿、蒸餾和滴定各步驟是否正確。(二) 推薦法1. 試樣的消煮 稱取0.5-1g試樣(含氮量5-80mg)(精確至0.0002g),加入消化管中,加2片消化片(儀器自備)或6.4g混合催化劑,與420下在消煮爐上消化1h。取出冷卻后加入30mL蒸餾水。2. 氨的蒸餾 采用全自動定氮儀時,按儀器本身常量程序進(jìn)行測定。采用半自動定氮儀時,將帶消化液的管子插在蒸餾裝置上,以25mL硼酸為吸收液,加入2滴混合指示劑,蒸餾裝置的冷凝管末端要浸入裝有吸收液的錐形瓶內(nèi),然后向消煮管中加入50mL氫氧化鈉溶液進(jìn)行蒸餾。蒸餾時間以吸收液體積達(dá)到100mL為宜。降下錐形瓶,用蒸餾水沖洗冷凝管末端,洗液
7、均流入錐形瓶內(nèi)。3. 滴定 用0.1mol/L的鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定吸收液,溶液由藍(lán)色變成紅色為終點(diǎn)。五、空白測定稱取蔗糖0.5g,代替試樣,進(jìn)行空白測定,消耗0.1mol/L鹽酸溶液的體積不得超過0.2mL。消耗0.02mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液體積不得超過0.3mL。六、分析結(jié)果的計(jì)算和表述計(jì)算見下式:粗蛋白質(zhì)=V2-V1c0.01406.25mVV100%式中:V2滴定試樣時所需標(biāo)準(zhǔn)酸溶液體積,mL; V1滴定空白時所需標(biāo)準(zhǔn)酸溶液體積,mL; c鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度,mol/L; m試樣質(zhì)量,g V試樣分解液總體積,mL V試樣分解液蒸餾用體積,mL;0.0140與1.00mL鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液【c(HCL)=1.000mol/L】相當(dāng)?shù)摹⒁钥吮硎镜牡馁|(zhì)量。 6.25氮換算成蛋白質(zhì)的平均系數(shù)。七、 重復(fù)性 當(dāng)粗蛋白質(zhì)含量在25%以上時,允許相對偏差為1%。當(dāng)粗蛋白質(zhì)含量在10%-25%以上時,允許相對偏差為2%。當(dāng)粗蛋白質(zhì)含量在10%以下時,允許相對偏差為3%。浙江紫香糖業(yè)使用的定氮儀是上海新嘉型號:KDN-AZ智能型定氮儀蒸餾器 KDN-AZ智能型定氮儀是我公司根據(jù)用戶對儀器自動化的需求進(jìn)行改進(jìn)的一款半自動凱氏測定裝置,在A型的基礎(chǔ)上安裝了自動蒸餾控制元件,使原本繁瑣的蒸餾控制更為簡便,提升了工作效率,保證了樣品測定的精準(zhǔn)性,并且加裝了自動排水系統(tǒng),用戶不用擔(dān)心因蒸發(fā)爐水未排盡而
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