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文檔簡介
1、PCR技術(shù)應(yīng)用和常見問題分析,南京凱吉生物技術(shù)開發(fā)有限公司,郭強分子平臺負(fù)責(zé)人,目錄,基因表達研究背景傳統(tǒng)PCR技術(shù)(鏈聚合酶反應(yīng))PCR反應(yīng)系統(tǒng)和反應(yīng)程序PCR常見問題分析實時定量實時定量PCR(實時定量PCR)實時定量PCR mRNA小細(xì)胞nuclearRNA、snRNA、kaiji生物技術(shù)開發(fā)有限、凈作用因素、基因表達研究策略、保姆基因:house-keeping gene是所有細(xì)胞中表達的基因種類微管蛋白基因等。高級基因:Luxury gene是在特殊細(xì)胞類型中大量(通常)表達并編碼特殊功能產(chǎn)物的基因,具有組織特異性。kaiji生物技術(shù)開發(fā)有限公司,3,基因表達研究戰(zhàn)略,kaiji生物
2、技術(shù)開發(fā)有限公司,基因表達研究戰(zhàn)略,cDNA:complementary DNA,RNA鏈的補充單鏈DNA,RNA在適當(dāng)?shù)囊锎嬖谙乱蕾嘡NA的DNA聚合,EST/mRNA,Genomic,擴展,變性,退火,keki生物技術(shù)開發(fā)有限公司,PCR技術(shù)(聚合酶鏈反應(yīng)),PCR反應(yīng)循環(huán),keki生物技術(shù)開發(fā)有限公司,PCR反應(yīng)系統(tǒng)/程序曲線,PCR brkeki生命技術(shù)開發(fā)有限公司,(4)dNTP dNTP濃度取決于擴增片段的長度,4種dNTP濃度必須相同濃度過高,才能容易產(chǎn)生錯誤堿基的混合,濃度過低,將反應(yīng)產(chǎn)量dNTP與Mg2結(jié)合,會降低游離Mg2濃度,影響DNA聚合酶的活性。kaiji生物技術(shù)開
3、發(fā)有限公司,(5) Mg2,Mg2是DNA聚合酶激活劑。適當(dāng)濃度為0.5-2.5mmol/L反應(yīng)體系。如果Mg2濃度過低,Taq酶活性喪失,PCR產(chǎn)量下降。Mg2過高會影響反應(yīng)特異性。Mg2可以與負(fù)離子結(jié)合,因此反應(yīng)系統(tǒng)的dNTP、EDTA等濃度影響反應(yīng)中自由的Mg2濃度。凱吉生物技術(shù)開發(fā)有限公司,2)由于循環(huán)參數(shù)變性,雙股DNA分解線由單股94,20-30秒(2)退火溫度由引物長度和GC含量決定。增加溫度會減少引物和模板的非特異性結(jié)合。降低溫度會增加反應(yīng)的敏感性。凱吉生物技術(shù)開發(fā)有限公司,(3)擴大70-75,一般延長72個時間由放大片段長度決定,(4)循環(huán)次數(shù)主要是模板DNA的濃度一般超過
4、25-35次:放大效率降低錯誤混合率增加,凱吉生物技術(shù)開發(fā)有限公司,PCR常見問題解答: 具有非特異性條帶、引物和模板的非特異性退火基因特異性引物設(shè)計不良RNA中具有基因組DNA的污染,在引物二聚體鎂離子濃度過高,提高反應(yīng)溫度和特異性的引物中,特異性擴增水平DNase處理RNA設(shè)計三端互補序列的引物中,優(yōu)化鎂離子濃度M 1 2,kaiji生物技術(shù)開發(fā)有限公司,引物設(shè)計:(1)序列高度保守(2)底漆長度15-40 BP為宜。(3)堿盡可能隨機分布,G C占40-60%。(4)引物內(nèi)部避免了二次結(jié)構(gòu)的形成。(5)兩個引物之間防止互補序列。(6)引物的3端是核心堿基。第5團沒有嚴(yán)格的限制。kaiji
5、生物技術(shù)開發(fā)有限公司,分散(SMEAR)條帶生成,第一鏈產(chǎn)品含量過高的PCR反應(yīng)中引物過量循環(huán)數(shù)過多的退火溫度過低,因核苷酸片段引起的非特異性放大,減少第一鏈產(chǎn)品量的現(xiàn)有PCR階段中引物量,PCR的循環(huán)將組織或細(xì)胞的總RNA提取RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA,目的基因引物設(shè)計為PCR,瓊脂糖電泳和數(shù)字照片分析電泳帶灰度值,判斷目標(biāo)基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的相對變化,RT-PCR反應(yīng)示例,RT-PCR引物的選擇:1。 隨機引物2。Oligo dT 3 .基因特異性引物,RT-PCR例:一,學(xué)習(xí)實驗?zāi)康腞NA提取方法;學(xué)習(xí)PCR分析的原理和技術(shù)。后代腎小管上皮細(xì)胞CTGF
6、基因表達分析藥物處理,凱吉生物技術(shù)開發(fā)有限公司,第二,實驗材料,工具和試劑1。材料:人腎小管上皮細(xì)胞等樣品組織2。工具:微吸管和吸頭、PCR儀器和PCR管瓊脂糖凝膠電泳設(shè)備、DEPC水等3。試劑:Trizol試劑(kaiji)RT-PCR套件(keki kit),kaiji生物技術(shù)開發(fā)有限公司,1。RNA萃取參考RNA萃取套件指示,3,操作步驟,2。RNA質(zhì)量測定,280,320,230,260納米以下的吸光度分別表示核酸、背景、鹽濃度、蛋白質(zhì)等有機物的值。OD260/OD280(Ratio,R) 2.2 RNA分解,凱基生命技術(shù)開發(fā)有限公司,3 .rt reaction,RNA 2-4ug
7、XUL oligo dt 10um 1.5 ul depc water to 10 ul,70水浴10分鐘,冰浴5分鐘,添加以下成分:RNA inhibitor 40u/ul 0.5 ul 10 x AMM,凱基生物技術(shù)開發(fā)有限公司4。PCR Reaction,10 X PCR反應(yīng)緩沖2.5 L 25 mmol/L MGC L 2.0 L 10 mmol/L dntp 1.0 l 10 mol/l引物1.0 L 10mol/L引物2.0 L DNA 1.0 L Taq 0.2 L(5U目前,實時定量PCR是一種非常有效的實驗方法,廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)研究的各個領(lǐng)域。kaiji生物技術(shù)開發(fā)有限公
8、司,real time PCR and conventional PCR,vs,1。實時在線監(jiān)控:監(jiān)控樣品放大的全過程,實時觀察產(chǎn)品增加,直觀地查看反應(yīng)的對數(shù)周期,2 .降低反應(yīng)的非特異性:使用引物和熒光探針,結(jié)合模板特異性,提高PCR反應(yīng)的特異性,3 .增加數(shù)量特異性:全面監(jiān)控,用精確算法量化;結(jié)果分析快速方便,無需執(zhí)行,凱基生命技術(shù)開發(fā)有限公司,熒光定量PCR與現(xiàn)有PCR技術(shù)的區(qū)別,現(xiàn)有PCR是通過電泳定性分析放大反應(yīng)的最終產(chǎn)物(定量不準(zhǔn)確);熒光定量PCR是在PCR反應(yīng)系統(tǒng)中添加熒光組,利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR過程,使每個周期“可視化”(or cDNA)的起始濃度通過Ct值和標(biāo)
9、準(zhǔn)曲線量化(精確定量)的方法。,kaiji生物技術(shù)開發(fā)有限公司Realtime PCR 25(4) :386-401.3。高性能模型of congenital tox oplasmis in guinea-pigs : use of quantitative and qualifitative PCR for the study of materno fet altransmisa quantitative real-time PCR method for detection of B- lymphocyte monoclonal ity by comparison of kappa and
10、lamb da immunoglobulin light chai N expressAnders sthlberg,clinical chemistry 49(1): 51-59,多實時熒光定量PCR,雙鏈DNA特異染料(SYBR)是一個反應(yīng)管中多用途產(chǎn)品熒光染料LUX這些熒光組的熒光發(fā)射波長不同,可以分辨引物介導(dǎo)的放大產(chǎn)物。發(fā)夾引物,單鏈引物,擴展引物dsDNA,keki生物技術(shù)開發(fā)有限公司,Dyes Used for Real-Time PCR,Dyeexitation maximum(nm)emission maximum第二,材料實時定量PCR試劑:1。ABI TaqMan PCR核
11、心套件2。ABI SYBR PCR核心套件,kaiji生物技術(shù)開發(fā)有限公司,第3階段,方法1。SYBR greenkit的實時PCR,2 .實時定量PCR儀器設(shè)置,凱吉生物技術(shù)開發(fā)有限公司,階段時間溫度注意事項UNG(可選)防止殘留2分鐘50ung啟動PCR產(chǎn)品中所有dUMP污染物PCR的初始激活階段15min 95激活HotStarTaq DNA聚合酶3(4)-階段循環(huán):變性15s 9435-40個循環(huán)取決于起始模板DNA量。kj生物技術(shù)開發(fā)有限公司,實時PCR問題分析,Q1:沒有Ct信號1。反應(yīng)循環(huán)參數(shù)不足,通常需要循環(huán)35個以上,但是如果太多,可以增加背景值。熒光信號檢測階段無效。SG方
12、法采用72擴展詩集獲取,這是退火結(jié)束或擴展結(jié)束時發(fā)生的TaqMan法則。引物或探針分解,頁面檢測完整性。引物或探針的設(shè)計,如果探針沒有足夠高到引物的溫度,探針就不會雜交,產(chǎn)品開始擴展。4.模板不足5。模板分解,凱基生命技術(shù)開發(fā)有限公司,Q2: CT值出現(xiàn)得太晚1。放大效率低,反應(yīng)條件不夠優(yōu)化,降低退火溫度,提高鎂離子濃度。2.反應(yīng)成分分解或樣品采集不足3。PCR產(chǎn)物太長,一般為80-150bp,凱基生命技術(shù)開發(fā)有限公司,Q3:標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系不良1。樣品佛像坡度2。標(biāo)準(zhǔn)物分解,防止反復(fù)董潔融化3。底漆或探針設(shè)計不良4。模板中有抑制劑或模板濃度太高,凱基生命技術(shù)開發(fā)有限公司,Q4:溶解曲線存在多個主峰1。底漆設(shè)計未充分優(yōu)化2。底漆
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