PCR技術以及常見問題解析

1、PCR技術應用和常見問題分析，南京凱吉生物技術開發(fā)有限公司，郭強分子平臺負責人，目錄，基因表達研究背景傳統(tǒng)PCR技術(鏈聚合酶反應)PCR反應系統(tǒng)和反應程序PCR常見問題分析實時定量實時定量PCR(實時定量PCR)實時定量PCR mRNA小細胞nuclearRNA、snRNA、kaiji生物技術開發(fā)有限、凈作用因素、基因表達研究策略、保姆基因：house-keeping gene是所有細胞中表達的基因種類微管蛋白基因等。高級基因：Luxury gene是在特殊細胞類型中大量(通常)表達并編碼特殊功能產(chǎn)物的基因，具有組織特異性。kaiji生物技術開發(fā)有限公司，3，基因表達研究戰(zhàn)略，kaiji生物

2、技術開發(fā)有限公司，基因表達研究戰(zhàn)略，cDNA:complementary DNA，RNA鏈的補充單鏈DNA，RNA在適當?shù)囊锎嬖谙乱蕾嘡NA的DNA聚合，EST/mRNA，Genomic，擴展，變性，退火，keki生物技術開發(fā)有限公司，PCR技術(聚合酶鏈反應)，PCR反應循環(huán)，keki生物技術開發(fā)有限公司，PCR反應系統(tǒng)/程序曲線，PCR brkeki生命技術開發(fā)有限公司，(4)dNTP dNTP濃度取決于擴增片段的長度，4種dNTP濃度必須相同濃度過高，才能容易產(chǎn)生錯誤堿基的混合，濃度過低，將反應產(chǎn)量dNTP與Mg2結(jié)合，會降低游離Mg2濃度，影響DNA聚合酶的活性。kaiji生物技術開

3、發(fā)有限公司，(5) Mg2，Mg2是DNA聚合酶激活劑。適當濃度為0.5-2.5mmol/L反應體系。如果Mg2濃度過低，Taq酶活性喪失，PCR產(chǎn)量下降。Mg2過高會影響反應特異性。Mg2可以與負離子結(jié)合，因此反應系統(tǒng)的dNTP、EDTA等濃度影響反應中自由的Mg2濃度。凱吉生物技術開發(fā)有限公司，2)由于循環(huán)參數(shù)變性，雙股DNA分解線由單股94，20-30秒(2)退火溫度由引物長度和GC含量決定。增加溫度會減少引物和模板的非特異性結(jié)合。降低溫度會增加反應的敏感性。凱吉生物技術開發(fā)有限公司，(3)擴大70-75，一般延長72個時間由放大片段長度決定，(4)循環(huán)次數(shù)主要是模板DNA的濃度一般超過

4、25-35次：放大效率降低錯誤混合率增加，凱吉生物技術開發(fā)有限公司，PCR常見問題解答： 具有非特異性條帶、引物和模板的非特異性退火基因特異性引物設計不良RNA中具有基因組DNA的污染，在引物二聚體鎂離子濃度過高，提高反應溫度和特異性的引物中，特異性擴增水平DNase處理RNA設計三端互補序列的引物中，優(yōu)化鎂離子濃度M 1 2，kaiji生物技術開發(fā)有限公司，引物設計：(1)序列高度保守(2)底漆長度15-40 BP為宜。(3)堿盡可能隨機分布，G C占40-60%。(4)引物內(nèi)部避免了二次結(jié)構的形成。(5)兩個引物之間防止互補序列。(6)引物的3端是核心堿基。第5團沒有嚴格的限制。kaiji

5、生物技術開發(fā)有限公司，分散(SMEAR)條帶生成，第一鏈產(chǎn)品含量過高的PCR反應中引物過量循環(huán)數(shù)過多的退火溫度過低，因核苷酸片段引起的非特異性放大，減少第一鏈產(chǎn)品量的現(xiàn)有PCR階段中引物量，PCR的循環(huán)將組織或細胞的總RNA提取RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA，目的基因引物設計為PCR，瓊脂糖電泳和數(shù)字照片分析電泳帶灰度值，判斷目標基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的相對變化，RT-PCR反應示例，RT-PCR引物的選擇：1。 隨機引物2。Oligo dT 3 .基因特異性引物，RT-PCR例：一，學習實驗目的RNA提取方法；學習PCR分析的原理和技術。后代腎小管上皮細胞CTGF

6、基因表達分析藥物處理，凱吉生物技術開發(fā)有限公司，第二，實驗材料，工具和試劑1。材料：人腎小管上皮細胞等樣品組織2。工具：微吸管和吸頭、PCR儀器和PCR管瓊脂糖凝膠電泳設備、DEPC水等3。試劑：Trizol試劑(kaiji)RT-PCR套件(keki kit)，kaiji生物技術開發(fā)有限公司，1。RNA萃取參考RNA萃取套件指示，3，操作步驟，2。RNA質(zhì)量測定，280，320，230，260納米以下的吸光度分別表示核酸、背景、鹽濃度、蛋白質(zhì)等有機物的值。OD260/OD280(Ratio，R) 2.2 RNA分解，凱基生命技術開發(fā)有限公司，3 .rt reaction，RNA 2-4ug

7、XUL oligo dt 10um 1.5 ul depc water to 10 ul，70水浴10分鐘，冰浴5分鐘，添加以下成分：RNA inhibitor 40u/ul 0.5 ul 10 x AMM，凱基生物技術開發(fā)有限公司4。PCR Reaction，10 X PCR反應緩沖2.5 L 25 mmol/L MGC L 2.0 L 10 mmol/L dntp 1.0 l 10 mol/l引物1.0 L 10mol/L引物2.0 L DNA 1.0 L Taq 0.2 L(5U目前，實時定量PCR是一種非常有效的實驗方法，廣泛應用于分子生物學研究的各個領域。kaiji生物技術開發(fā)有限公

8、司，real time PCR and conventional PCR，vs，1。實時在線監(jiān)控：監(jiān)控樣品放大的全過程，實時觀察產(chǎn)品增加，直觀地查看反應的對數(shù)周期，2 .降低反應的非特異性：使用引物和熒光探針，結(jié)合模板特異性，提高PCR反應的特異性，3 .增加數(shù)量特異性：全面監(jiān)控，用精確算法量化；結(jié)果分析快速方便，無需執(zhí)行，凱基生命技術開發(fā)有限公司，熒光定量PCR與現(xiàn)有PCR技術的區(qū)別，現(xiàn)有PCR是通過電泳定性分析放大反應的最終產(chǎn)物(定量不準確)；熒光定量PCR是在PCR反應系統(tǒng)中添加熒光組，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR過程，使每個周期“可視化”(or cDNA)的起始濃度通過Ct值和標

9、準曲線量化(精確定量)的方法。，kaiji生物技術開發(fā)有限公司Realtime PCR 25(4) :386-401.3。高性能模型of congenital tox oplasmis in guinea-pigs : use of quantitative and qualifitative PCR for the study of materno fet altransmisa quantitative real-time PCR method for detection of B- lymphocyte monoclonal ity by comparison of kappa and

10、lamb da immunoglobulin light chai N expressAnders sthlberg，clinical chemistry 49(1): 51-59，多實時熒光定量PCR，雙鏈DNA特異染料(SYBR)是一個反應管中多用途產(chǎn)品熒光染料LUX這些熒光組的熒光發(fā)射波長不同，可以分辨引物介導的放大產(chǎn)物。發(fā)夾引物，單鏈引物，擴展引物dsDNA，keki生物技術開發(fā)有限公司，Dyes Used for Real-Time PCR，Dyeexitation maximum(nm)emission maximum第二，材料實時定量PCR試劑：1。ABI TaqMan PCR核

11、心套件2。ABI SYBR PCR核心套件，kaiji生物技術開發(fā)有限公司，第3階段，方法1。SYBR greenkit的實時PCR，2 .實時定量PCR儀器設置，凱吉生物技術開發(fā)有限公司，階段時間溫度注意事項UNG(可選)防止殘留2分鐘50ung啟動PCR產(chǎn)品中所有dUMP污染物PCR的初始激活階段15min 95激活HotStarTaq DNA聚合酶3(4)-階段循環(huán)：變性15s 9435-40個循環(huán)取決于起始模板DNA量。kj生物技術開發(fā)有限公司，實時PCR問題分析，Q1:沒有Ct信號1。反應循環(huán)參數(shù)不足，通常需要循環(huán)35個以上，但是如果太多，可以增加背景值。熒光信號檢測階段無效。SG方

12、法采用72擴展詩集獲取，這是退火結(jié)束或擴展結(jié)束時發(fā)生的TaqMan法則。引物或探針分解，頁面檢測完整性。引物或探針的設計，如果探針沒有足夠高到引物的溫度，探針就不會雜交，產(chǎn)品開始擴展。4.模板不足5。模板分解，凱基生命技術開發(fā)有限公司，Q2: CT值出現(xiàn)得太晚1。放大效率低，反應條件不夠優(yōu)化，降低退火溫度，提高鎂離子濃度。2.反應成分分解或樣品采集不足3。PCR產(chǎn)物太長，一般為80-150bp，凱基生命技術開發(fā)有限公司，Q3:標準曲線線性關系不良1。樣品佛像坡度2。標準物分解，防止反復董潔融化3。底漆或探針設計不良4。模板中有抑制劑或模板濃度太高，凱基生命技術開發(fā)有限公司，Q4:溶解曲線存在多個主峰1。底漆設計未充分優(yōu)化2。底漆