耐甲氧西林金葡菌ppt課件

1、.,1,耐甲氧西林金黃色葡萄球菌,2,.,革蘭陽性球菌,金黃色葡萄球菌是臨床上常見的毒性較強(qiáng)的細(xì)菌，自從本世紀(jì)40年代青霉素問世后，金黃色葡萄球菌引起的感染性疾病受到較大的控制，但隨著青霉素的廣泛使用，有些金黃色葡萄球菌產(chǎn)生青霉素酶，能水解-內(nèi)酰胺環(huán)，表現(xiàn)為對(duì)青霉素的耐藥?？茖W(xué)家研究出一種新的能耐青霉素酶的半合成青霉素，即甲氧西林(methicillin)。1959年應(yīng)用于臨床后曾有效地控制了金黃色葡萄球菌產(chǎn)酶株的感染，可英國的Jevons就首次發(fā)現(xiàn)了耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA),MRSA從發(fā)現(xiàn)至今感染幾乎遍及全球，已成為院內(nèi)感染的重要病原菌之一。,3,.,4,.,耐甲氧西林金黃色葡萄

2、球菌（MRSA）的特性 耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的分型 耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的檢測,5,.,耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的特性,不均一耐藥性 廣譜耐藥性 生長特殊性 固有耐藥 獲得性耐藥,6,.,1不均一耐藥性,MRSA菌落內(nèi)細(xì)菌存在敏感和耐藥兩個(gè)亞群，即一株MRSA中只有一小部分細(xì)菌約104107，對(duì)甲氧西林高度耐藥，在50 g/ml甲氧西林條件下尚能生存，而菌落中大多數(shù)細(xì)菌對(duì)甲氧西林敏感，在使用抗生素后的幾小時(shí)內(nèi)大量敏感菌被殺死，但少數(shù)耐藥菌株卻緩慢生長，在數(shù)小時(shí)反又迅速增殖。,7,.,2廣譜耐藥性,MRSA除對(duì)甲氧西林耐藥外，對(duì)其它所有與甲氧西林相同結(jié)

3、構(gòu)的-內(nèi)酰胺類和頭孢類抗生素均耐藥，MRSA還可通過改變抗生素作用靶位，產(chǎn)生修飾酶，降低膜通透性產(chǎn)生大量PABA等不同機(jī)制3，對(duì)氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類、氟喹喏酮類、磺胺類、利福平均產(chǎn)生不同程度的耐藥，唯對(duì)萬古霉素敏感。,8,.,3生長特殊性,MRSA生長緩慢，在30C，培養(yǎng)基pH 7.0及高滲(40 g/L NaCl溶液)條件下生長較快4。在30C時(shí)，不均一耐藥株表現(xiàn)為均一耐藥和高度耐藥，在37C又恢復(fù)不均一耐藥。均一耐藥株在37C或pH5.2時(shí)，均一耐藥性可被抑制而表現(xiàn)為敏感。增加NaCl濃度，低溫孵育和延長時(shí)間，可使不均一耐藥株群體中敏感亞群中的耐藥性得到充分表達(dá)，即能耐受較高濃

4、度的甲氧西林，而對(duì)其中耐藥亞群無影響5。但最近也有報(bào)道，高滲下延長培養(yǎng)時(shí)間，會(huì)影響MRSA的檢出結(jié)果，因?yàn)樵诟啕}情況下，培養(yǎng)48 h，對(duì)甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌(methicillin sensitive Staphylococcus aureus;MSSA)易產(chǎn)生大量-內(nèi)酰胺酶，可緩慢水解甲氧西林，導(dǎo)致細(xì)菌生長，而誤認(rèn)為MSSA。所以一般MRSA在高鹽環(huán)境孵育24 h，而耐甲氧西林凝固酶陰性葡萄球菌(MRCNS)由于耐藥亞群菌數(shù)少于金葡菌，應(yīng)孵育48小時(shí)觀察結(jié)果。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的耐藥機(jī)理,9,.,1固有耐藥,是由染色體介導(dǎo)的耐藥，其耐藥性的產(chǎn)生與細(xì)菌產(chǎn)生一種青霉素結(jié)

5、合蛋白(PBP)有關(guān)。產(chǎn)生五種PBP(1，2，3，3和4)，它們具有合成細(xì)菌細(xì)胞壁的功能。它們與-內(nèi)酰胺類抗生素有很高的親和力，能共價(jià)結(jié)合于-內(nèi)酰胺類藥物的活動(dòng)位點(diǎn)上，失去其活性導(dǎo)致細(xì)菌死亡，而MRSA產(chǎn)生了一種獨(dú)特的PBP，這種分子量增加了781000道爾頓的PBP，因其電泳率介于PBP2與PBP3之間，故稱為PBP2a或PBP26。PBP2a對(duì)-內(nèi)酰胺類抗生素親和力很低，因而很少或不被-內(nèi)酰胺類藥結(jié)合。在-內(nèi)酰胺類抗生素存在的情況下，細(xì)菌仍能生長，表現(xiàn)出耐藥性。PBP2a的產(chǎn)生是受染色體甲氧西林耐藥基因(mec A)來調(diào)節(jié)的。MRSA與MSSA根本區(qū)別在于它們的PBP不同。,10,.,2獲

6、得性耐藥,是質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥。某些菌株通過耐藥因子產(chǎn)生大量-內(nèi)酰胺酶，使耐酶青霉素緩慢失活，表現(xiàn)出耐藥性7，多為臨界耐藥。,11,.,耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的分型,MRSA分型對(duì)追蹤傳染源，研究型別與感染種類，耐藥性的關(guān)系有重要作用。國外開展較早的噬菌體分型，將待測菌于肉湯中，35C孵育6 h，涂于分型瓊脂平板上，待干后將23種噬菌體注入瓊脂平板中的小方格內(nèi)，再置35C孵育6 h后移至室溫過夜觀察結(jié)果。用4組23種噬菌體，將MRSA分為4群，一般以群為最多8，也有報(bào)告以群為多。噬菌體分型結(jié)果常不滿意，日本小粟子證實(shí)有29.3%菌株不能分型，且重復(fù)性差，不宜用于流行病學(xué)調(diào)查。質(zhì)粒圖譜

7、分型較為可靠，可分為18個(gè)型，能準(zhǔn)確地分析菌株之間的相關(guān)性，將流行菌株與非流行菌株加以區(qū)別。國內(nèi)MRSA廣泛存在分子量為1.6 Md、1.8 Md及2.67 Md的質(zhì)粒，不同地區(qū)和不同醫(yī)院會(huì)有特殊質(zhì)粒帶。免疫印跡分型法將MRSA分為9個(gè)型，以B、C型為最常見，各型含有特征性的分子帶，該法比較穩(wěn)定。染色體限制性內(nèi)切酶分析可識(shí)別病原體DNA鏈上特異位點(diǎn)及核苷酸序列，能從基因水平顯示病原體特征，MRSA還可用血清學(xué)、凝固酶、耐藥譜等方法分型?，F(xiàn)在Southern印跡法也逐漸運(yùn)用于MRSA的分型。,12,.,耐甲氧西林金黃色葡萄球菌,耐甲氧西林金黃色葡萄球菌,13,.,耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRS

8、A）的檢測,由于MRSA的不均一耐藥性，給其檢測帶來一定的困難。MRSA的檢出率受孵育溫度、時(shí)間、培養(yǎng)基的pH和NaCl的濃度、菌液的數(shù)量等多種因素的影響。因此，目前還沒有一種最佳的檢測方法。 1紙片擴(kuò)散法(K-B法) 2肉湯稀釋(MIC)法 3瓊脂稀釋(MIC)法 4瓊脂篩選法 5濃度梯度(Etest)法 6自動(dòng)化藥敏檢測 7DNA探針雜交 8PCR技術(shù),14,.,1紙片擴(kuò)散法(K-B法),平皿中MH瓊脂厚度為4 mm，菌液調(diào)至0.5麥?zhǔn)蠞岫?，涂沫于上述平板，甲氧西林含? g/片，35C孵育24 h，抑菌圈11 mm為耐藥，17 mm為敏感，由于MRSA通常對(duì)其它耐酶半合成青霉素也耐藥，因

9、此美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(NCCLS)推薦用苯唑西林來代替檢測MRSA。苯唑西林在貯存過程中藥效不易降低，且對(duì)不均一耐藥性檢測效果更好，所以國內(nèi)多數(shù)實(shí)驗(yàn)室都采用苯唑西林，苯唑西林含量為1 g/片，抑菌圈10 mm為耐藥，13 mm為敏感，1112 mm為中介。質(zhì)控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC 29213(耐藥菌株)，金黃色葡萄球菌ATCC 25923(敏感菌株)。紙片擴(kuò)散法最大優(yōu)點(diǎn)是快速、簡便、價(jià)格便宜，易被檢驗(yàn)人員接受。在合適的抗生素及培養(yǎng)溫度、菌液的濃度、培養(yǎng)基厚度等條件下，檢測MRSA是可行的。但Leneastre等9對(duì)K-B法和特異性mec A基因DNA片段法鑒定MRSA的結(jié)果進(jìn)行

10、了比較，發(fā)現(xiàn)在49株用K-B法鑒定為MSSA的菌株，特異性mec A基因DNA片段法鑒定卻有11株含mec A基因；59株用紙片法鑒定為典型MRSA的菌株，有10株卻沒有特異性mec A基因，這兩種方法大約有18%20%的差異。Chipman10等研究也表明以mec A基因檢測法為參考方法時(shí)，紙片擴(kuò)散法的符合率為88.2%。這可能與紙片法中的瓊脂中沒有NaCl成份，一些菌株的耐藥性得不到完全表達(dá)有關(guān)。因此，為提高紙片擴(kuò)散法檢測MRSA的可靠性，最好在MH瓊脂中加入40 g/L NaCl。,15,.,2肉湯稀釋(MIC)法,美國疾病控制中心(CDC)推薦用MH肉湯培養(yǎng)基加NaCl至20 g/L濃

11、度，同時(shí)加入Ca,Mg離子，將苯唑西林進(jìn)行倍比稀釋，從0.12516 g/ml，菌濃度為104/ml，35C孵育24 h，MIC2 g/ml為敏感，4 g/ml為耐藥，該法檢出率可達(dá)95%，但操作較繁瑣。,16,.,3瓊脂稀釋(MIC)法,用含20 g/L NaCl的MH瓊脂將苯唑西林倍比稀釋為12個(gè)不同濃度并澆注平皿。苯唑西林量終濃度為0.125256 g/ml。再將菌液(0.5麥?zhǔn)蠞岫?點(diǎn)種于含藥平皿，35C孵育24 h。該法適用于大量菌株的MRSA檢測，結(jié)果容易判斷，重復(fù)性好，但耗時(shí)，費(fèi)力。,17,.,4瓊脂篩選法,這是1997年NCCLS推薦的MRSA的確證試驗(yàn)，即MH培養(yǎng)基加NaCl

12、(40 g/L)加苯唑西林(6 g/ml)，將菌液(0.5麥?zhǔn)蠞岫?點(diǎn)種或畫線35C孵育24 h，只要平皿有菌生長，即使一個(gè)菌落也是MRSA，該法敏感度為100%，常用作校正其它方法的標(biāo)準(zhǔn)，尤其適用于檢測抑菌圈直徑處于中介度的金黃色葡萄球菌。,18,.,5濃度梯度(Etest)法,是1988年AB Biodisk公司推出，在含20 g/L NaCl的MH瓊脂平板上，貼上苯唑西林的試條，菌液調(diào)至0.51麥?zhǔn)蠞岫龋?5C孵育24 h，直接讀取MIC值。MIC2 g/ml為敏感，4 g/ml為耐藥。Etest法結(jié)合了紙片擴(kuò)散法和肉湯稀釋法的優(yōu)點(diǎn)，長塑料條含有連續(xù)的呈指數(shù)梯度變化的苯唑西林(0.016

13、256 g/ml)，故在檢測低水平或中等程度耐藥的MRSA時(shí)結(jié)果更為準(zhǔn)確。Novak11等報(bào)道，用Alamar法和Etest法對(duì)127株MRSA的檢測比較，兩者結(jié)果相關(guān)較高，用Etest法檢測127株MRSA，其中93株MIC256 g/ml，28株在6256 g/ml，檢出率達(dá)96%，Etest法具有精確、可靠、穩(wěn)定性好的特點(diǎn)，但缺點(diǎn)是價(jià)格昂貴。,19,.,6自動(dòng)化藥敏檢測,目前有Vitek系統(tǒng)、ATB系統(tǒng)、MicroScan系統(tǒng)、Sensiter ARIS等。將菌液稀釋后注入藥敏板或孔內(nèi)，然后通過檢測菌液濁度，熒光指示劑的熒光強(qiáng)度或熒光底物的水解反應(yīng)來判讀結(jié)果。其優(yōu)點(diǎn)是快速，但有時(shí)對(duì)生長緩

14、慢或延遲表達(dá)耐藥性的MRSA，在34 h內(nèi)難以達(dá)到檢測水平，容易漏檢或誤報(bào)MRSA。,20,.,7DNA探針雜交,上述的方法都是檢測MRSA耐藥表型的方法。MRSA根據(jù)其耐藥頻率可分為1、2、3、4類，其耐藥頻率為107、104、103以及10112。上述常規(guī)的檢測方法對(duì)于3、4類MRSA一般不存在問題，但對(duì)于低頻率的1、2類則很容易造成漏檢。因此，對(duì)于低水平耐藥或臨界水平耐藥的MRSA，應(yīng)選擇特異性高的分子生物學(xué)方法來檢測。DNA探針雜交是用特異性的mec A DNA片段經(jīng)地高辛標(biāo)記，與可疑菌株進(jìn)行雜交，有學(xué)者報(bào)告13，DNA探針僅與MRSA DNA雜交，與MSSA DNA無雜交帶，其特異性

15、高于瓊脂稀釋法，敏感性高于肉湯稀釋法，而且可直接用于臨床標(biāo)本，無需先進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)，但探針較貴，保存期較短。,21,.,8PCR技術(shù),本世紀(jì)80年代末期，國外就有人用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)來檢測PBP2a的mec A基因。它是根據(jù)金黃色葡萄球菌TK 784的mec A基因DNA序列14設(shè)計(jì)一引物，再裂解提取被測菌的DNA，在一定條件下進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖電泳后在紫外燈下觀察有無與陽性對(duì)照菌株(金黃色葡萄球菌ATCC29213)相同的區(qū)帶。PCR具有較高的靈敏度，只要被測菌有微量的的基因，即出現(xiàn)陽性結(jié)果，因此常作為檢測MRSA的參考方法。陳秀樞實(shí)驗(yàn)表明14，金黃色葡萄球菌耐苯唑西林的耐藥水平與m

16、ec A基因有較好的相關(guān)性。MIC4 g/ml的22株菌均檢出mec A基因。由于PCR很靈敏，有時(shí)會(huì)因?qū)嶒?yàn)室的污染而出現(xiàn)假陽性，為使PCR具有更高的可靠性，必須對(duì)其擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行探針雜交或測序以提高特異性15。而有一些耐藥基因是沉默基因，不表達(dá)mec A基因產(chǎn)物，有時(shí)會(huì)得出假耐藥結(jié)論，所以分子生物學(xué)方法并非100%的敏感和特異，加上該法前期處理操作繁瑣，且需要一定的設(shè)備，僅在可疑或特殊情況下做此試驗(yàn)。,22,.,耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）感染的流行概況自從1961年英國發(fā)現(xiàn)MRSA后，在歐美及亞洲一些國家相繼報(bào)道了MRSA所致的院內(nèi)感染。從60年代后期到80年代，MRSA感染率大大增

17、加。美國NNIS報(bào)道1975年182所醫(yī)院MRSA占金黃色葡萄球菌感染總數(shù)的2.4%，1991年上升至24.8%，其中尤以500張床以上的教學(xué)醫(yī)院和中心醫(yī)院為多，因?yàn)檫@些醫(yī)院里MRSA感染的機(jī)會(huì)較多，耐藥菌株既可由感染病人帶入醫(yī)院，也可因?yàn)E用抗生素在醫(yī)院內(nèi)產(chǎn)生16。歐洲1993年1417家醫(yī)院ICU分離的MRSA達(dá)60%17。而日本Kansai醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院MRSA的分離率1993年達(dá)到41%。國內(nèi)在70年代發(fā)現(xiàn)有MRSA，近幾年MRSA的檢出率正在逐年上升，上海1978年在200株金黃色葡萄球菌中MRSA只占5%，1988年上升至24%，1996年激增至72%18。天津1988年調(diào)查MRS

18、A分離率為47%19，北京醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院1996年分離MRSA達(dá)58.3%20，山東淮坊市1996年在三家醫(yī)院的嬰兒室分離出金黃色葡萄球菌198株，其中MRSA為112株(56.5%)21。武漢同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)附院1992年分離MRSA就達(dá)79.6%22。,23,.,MRSA感染多發(fā)生于免疫缺陷者，大面積燒傷，大手術(shù)后患者，長期住院及老年患者，MRSA極易導(dǎo)致感染的流行和暴發(fā)。MRSA傳播主要通過醫(yī)護(hù)人員的手，在患者、醫(yī)護(hù)人員、患者間播散，另外，衣物、敷料等物品可攜帶MRSA，促進(jìn)MRSA在院內(nèi)的流行，病人一旦感染或攜帶MRSA，該菌可存在于患者身上達(dá)數(shù)月之久。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA

19、）的治療和預(yù)防,24,.,1MRSA的治療 MRSA感染的治療是臨床十分棘手的難題之一，關(guān)鍵是其對(duì)許多抗生素有多重耐藥。因其耐藥機(jī)制是PBPs（青霉素結(jié)合蛋白）性質(zhì)的改變，因此，MRSA幾乎對(duì)所有的-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥，且在同時(shí)，還可能對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素、氨基糖苷類抗生素等多種抗菌藥物表現(xiàn)出耐藥性。目前最常用，也是療效最肯定的抗生素為萬古霉素、去甲萬古霉素、替考拉寧等。其次，對(duì)于以上藥物有禁忌癥，或是不可耐受的患者，也可使用其他的抗菌藥物，如夫西地酸鈉。而在某些國家和地區(qū)，也可使用頭孢吡普、替加環(huán)素、利奈唑胺、達(dá)托霉素等，均有較好的療效。,25,.,2MRSA預(yù)防 首先是合理使用抗生素。目前臨床濫用抗生素的