免疫組化技術在婦科的臨床應用

1、免疫組化技術在婦科的臨床應用免疫組化的基本原理 免疫組化是免疫組織化學技術的簡稱。它是應用抗原、抗體特異性結合的原理，使用已知的抗體在病理切片上與相應的抗原結合，然后把結合產物應用組織化學的方法顯現出來，使之可以在顯微鏡下觀察得以確認。通常使用的顯色劑為聯苯胺，結合的抗體顯示為棕色顆粒，所以把免疫組化成為“棕色革命”。 組成人體細胞分為若干種，如：上皮細胞、神經細胞、肌肉細胞、血細胞等，每種細胞都有其特殊的結構物質，每種細胞都有其特異功能，每種功能又有其物質基礎。如：鱗狀上皮細胞通過角化物可以防止機體水份的蒸發(fā)和外界病原體的侵入，肌肉可以通過肌動蛋白使自己收縮。突觸素可以傳導神經興奮，某些器官

2、借以實現其功能的激素受體，載有遺傳物質的DNA全段基因等?，F在人們都可以把這些物質純凈的分離出來，并把它們作為抗原免疫大鼠和家兔，使之產生相應的抗體，人們再把每種抗體分離純化，就得到我們免疫組化應用的抗體。我們把這些抗體作用于病理切片，然后再通過染色，如果切片上有這種抗體對應的抗原，就會在切片上出現棕色顆粒，如果沒有棕色顆粒，就說明沒有這種抗體的抗原，在顯微鏡下就一目了然。免疫組化標記在婦科腫瘤的應用及其意義 免疫組化以它的特異性和敏感性，結合組織學上的定位性已成為多種腫瘤病理形態(tài)學診斷的新手段。這里需要說明的是雖然目前具有診斷價值的腫瘤標記物有數百種之多，但至今還沒有發(fā)現人體腫瘤的特異性抗原

3、，也就是說還沒有任何一種抗體能100地確診一種腫瘤。 盡管如此，人們正是得到了一些與腫瘤相關的抗原，存在于腫瘤細胞的胞核、胞漿和胞膜上，它的存在或量變可以提高腫瘤的性質，借以了解腫瘤的組織發(fā)生，細胞分化、細胞功能，以有助于腫瘤的診斷，鑒別診斷、分類，判斷預后和指導臨床治療。 目前具有診斷價值的腫瘤標記物雖已有數百種，但在臨床病理診斷常用的有50余種，其標記物有以下類型：一、腫瘤相關抗原 這種抗原只存在腫瘤組織中，正常組織內沒有或含量甚微?；蚱錇閹追N類型腫瘤所共有，故又稱為腫瘤群體抗原，對判斷腫瘤的良、惡性和起源均有一定幫助CA125 對卵巢上皮性腫瘤都有一定的表達，但主要對漿液性腫瘤陽性表達，

4、卵巢粘液性腺癌CA125 不表達?？梢杂糜谶@兩種腫瘤的鑒別診斷。 CA125 對子宮內膜樣腫瘤透明細胞癌，未分化癌上皮成份也是陽性表達。CEA癌胚抗原 廣泛存在于各種上皮性腫瘤，大多數卵巢漿液性腫瘤不表達，而卵巢粘液性腫瘤表達，在子宮內膜樣腺癌，透明細胞癌，勃勒納氏瘤CEA都有不同程度的表達，在胃腸道惡性腫瘤中CEA也為陽性表達，所以卵巢庫肯勃氏瘤CEA也是陽性表達。AFP甲胎蛋白 是胚胎卵黃囊細胞，胚胎肝細胞和胎兒腸道細胞合成的一種糖蛋白，主要用于肝癌的診斷，在卵巢內胚竇瘤、胚胎性癌，惡性畸胎瘤都為陽性表達。二、細胞結構抗原 這種抗原可存在于正常組織和腫瘤組織中，為某些組織細胞群所特有，對判

5、斷腫瘤起源有重要意義CK7: 主要標記腺上皮和移行上皮。卵巢、肺、乳腺上皮CK7陽性表達。而結腸，前列腺和胃腸道上皮CK7陰性表達?？捎糜诼殉舶┡c胃腸道癌的鑒別診斷。CK20: 主要標記胃腸道上皮、尿道上皮。卵巢粘液性囊腺癌CK20為陽性表達。子宮內膜腺癌、宮頸鱗癌、乳腺癌、肺癌和卵巢非粘液性腫瘤CK20均不表達。desmin 結蛋白 為中間絲蛋白之一，分布于正常平滑肌細胞、心肌細胞、骨骼肌細胞和 肌上皮細胞及其腫瘤中。結蛋白在良性肌源性腫瘤是強陽性表達，而在平滑肌肉瘤中表達率僅為50，另外在平滑肌瘤中結蛋白與波形蛋白Vimentin（是表達間葉組織來源的腫瘤，上皮來源腫瘤不含此蛋白，用于癌與

6、肉瘤的鑒別，惡黑與癌的鑒別等）的表達呈反向關系，分化越好結蛋白陽性反應越強，波形蛋白陽性反應弱或陰性；反之，分化越差，結蛋白反應弱或陰性，而波形蛋白反應越強。另外含有肌源成份的癌肉瘤，惡性中胚葉混合瘤，畸胎瘤中也存在結蛋白S-100 是一種可溶性酸性蛋白，主要存在于神經組織、垂體、唾液腺等組織，是神經性腫瘤的主要標記。在惡黑及脂肪肉瘤為陽性表達SMA 肌動蛋白 是一種標記平滑肌瘤的蛋白，主要用于診斷平滑肌瘤、血管平滑肌瘤，平滑肌肉瘤以及肌上皮細胞。在乳腺腫瘤中以此抗體檢測導管上皮肌上皮細胞陽性與否來判斷乳腺腫瘤的良、惡性。三、可用于某些生殖細胞來源的腫瘤和妊娠有關的腫瘤的診斷，常用的有：內分泌

7、激素及其受體抗原 包括肽類激素和類固醇激素兩種，以肽類激素抗原應用較多，常用有胰島素、高血糖素、胃泌素、生長抑素、降鈣素等。類固醇激素有雌激素、孕酮、睪酮等。但此類激素在組織切片中保留困難，且在組織內有多種結構類似的激素前體，不僅染色效果不好，且難以正確判斷。所以多檢測其激素受體。如：ER（雌激素受體）、PR（孕激素受體）四、腫瘤中病毒抗原HPV（人乳頭狀瘤病毒）特別是HPV16、18是宮頸癌主要致病病毒，亦可用于頭頸部癌、前列腺癌和食管癌的研究HIV（人類免疫缺陷病毒）即艾滋病病毒，表達于淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞、濾泡樹突狀細胞和HIV感染的神經膠質細胞，主要用于艾滋病的研究.另外還有H

8、SV（單純性皰疹病毒等）五、作為判斷預后的標記抗體C-erbB-2 是一種癌基因蛋白質，存在于細胞膜上，該蛋白可加速細胞的運動，參與細胞浸潤和轉移調節(jié)。在乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、子宮內膜癌、胃癌陽性表達提示預后差。特別是乳腺癌陽性表達具有獨特的預后價值，陽性表達者復發(fā)及轉移率高，無瘤生存期及總生存期短。宮頸腺癌C-erbB-2 陽性表達者盆腔淋巴轉移率和宮頸深肌層侵犯率高于陰性組。P53（腫瘤抑制基因） P53蛋白也是現代分子生物學中研究最多的蛋白質之一， P53蛋白除具有細胞生長阻滯作用外，同時還參與細胞DNA的損傷與修復、細胞生長與分化、誘導細胞調亡的過程，目前認為P53是生命科學領域中最

9、重要的蛋白質分子。P53是腫瘤抑制因子，但由于失活、突變使蛋白結構發(fā)生變化，這在許多惡性腫瘤中可以見到P53基因的突變，特別是結腸癌、直腸癌、肺癌、卵巢癌、宮頸癌、宮體癌、食道癌、胃癌、肝癌、乳腺癌及膀胱癌尤為常見。另外對骨肉瘤、軟組織肉瘤、淋巴瘤及白血病等惡性腫瘤細胞中也可見到。研究證明， P53突變與腫瘤大小正相關，與分化程度、病人的總生存期和無瘤生存期呈負相關。 P53突變腫瘤復發(fā)率和死亡率明顯高于陽性者。且P53突變與腫瘤血管侵襲呈明顯相關。 在多種惡性腫瘤中突變性P53蛋白表達水平升高，用免疫組化可以檢測到，所以我們仍以P53陽性表達來預測患者的預后、術后易復發(fā)等指標。 P53陽性表

10、達與癌前病變的關系也極為密切，在宮頸和食管非典型增生中均可檢測出P53蛋白。PCNA（增殖細胞核抗原） 是一種僅在增殖細胞中合成或表達的核內多肽。 PCNA陽性表達與細胞增殖活性有關，可做為細胞增殖狀態(tài)的一個重要指標。在惡性腫瘤中PCNA陽性表達提示有腫瘤浸潤、轉移和臨床預后不佳。Ki-67 是一種與細胞增殖有關的核抗原，位于胞核中。Ki-67增殖指數高低即陽性表達與許多腫瘤的分化程度、浸潤、轉移及預后密切相關，因此被廣泛做為各種惡性腫瘤必檢項目之一。ER、PR 是乳腺癌、子宮內膜腺癌、宮頸癌、卵巢癌等必檢項目之一。 ER、PR陽性與否與病人術后化療方案的選擇和內分泌治療以至于腫瘤的復發(fā)、轉移

11、、預后都密切相關。 ER、PR陽性者，內分泌、化療治療效果好，復發(fā)、轉移率少，緩解期長，生存率高。六、腫瘤多耐藥基因 在臨床腫瘤治療中，經常有這樣的情況：同一種腫瘤，使用同一個治療方案，或同一個病人，化療之初和化療后期，其效果迥異。這種情況決定性原因是腫瘤細胞內是否存在或產生了多耐藥性。多耐藥性基因編碼蛋白可以把化療藥從細胞內泵到細胞外，從而避免了化療藥對細胞的破壞。 研究表明，癌細胞有六種耐藥途徑，通俗點說：化療藥物要制服、殺滅癌細胞，而癌細胞有強大對抗辦法，使化療藥物奈何不了它，這樣，癌細胞仍可肆無忌彈地增生，最后達到危及健康與生命的目的。所以每一位化療病人在治療前都應該檢查腫瘤的耐藥性，

12、如果陽性，可以使用逆轉劑，提高腫瘤細胞對化療物的敏感性Pg糖蛋白 它是多耐藥基因產物，作用“藥泵”功能，引起癌細胞產生耐藥。容易產生耐藥抗藥藥物主要有長春新堿、長春花堿、阿霉素、柔紅霉素、表阿霉素、米托蒽醌、紫杉醇、 VP16等。陽性表達（+）以上有意義，對腫瘤病人選擇化療方案和愈后判斷具有重要的臨床意義。MRP3 多耐藥相關蛋白，主要用于非Pg糖蛋白腫瘤細胞系的腫瘤耐藥性的研究。容易產生耐藥的抗藥藥物主要有阿霉素、柔紅霉素、表阿霉素、長春新堿、長春花堿、 VP16。常見婦科腫瘤免疫組化檢測應用舉例 日常工作中根據每位病人，不同腫瘤類型從診斷、鑒別診斷、探討組織來源、內分泌治療及化療前腫瘤多耐

13、藥基因及病人的愈后等多方面選擇一組免疫組化抗體以達到輔助診斷的目的。子宮內膜腺癌 ER、 PR、 Ki-67 、 P53（漿液性乳頭狀腺癌過表達）、PCNA 、PTEN、MRP3、Pg糖蛋白 PTEN是一種腫瘤抑制基因，在維持細胞增殖、分化和調亡平衡起著重要作用，該基因在許多腫瘤表現突變和丟失。子宮內膜腺癌的發(fā)生一部分是與持續(xù)與過多雌激素有關，病人有不排卵、不孕及子宮內膜增生過長的病史。PTEN常為陽性表達，提示預后較好。有些內膜癌患者無雌激素增高，有正常排卵，卵巢功能正常。很多絕經多年的老年婦女，癌周內膜多顯萎縮，說明無雌激素影響，這種內膜腺癌發(fā)生機制尚不清楚，PTEN的陰性表達提示腫瘤惡性

14、程度高，預后差。子宮平滑肌肉瘤 SMA 、 P53、 結蛋白、 波形蛋白、PCNA、 CD10、 Ki-67、 MRP3、 Pg糖蛋白。子宮內膜間質肉瘤 ER、PR、CD10、波形蛋白、desmin 、SMA、P53、Ki-67、 MRP3、 Pg糖蛋白宮頸浸潤性鱗癌 廣譜CK、 P16、 HPV16、 P53、 Ki-67、 MRP3 Pg糖蛋白。 P16是一種重要的抑癌基因，當P16基因突變和丟失時細胞增殖失控使細胞無限制增殖而發(fā)生腫瘤。在宮頸上皮內瘤變及癌的發(fā)生是以P16陽性表達為特征，這與宮頸上皮內瘤變與宮頸癌是由HPV感染所造成細胞不死性有關。宮頸鱗形細胞原位癌及早期浸潤 除以上幾項

15、外再加IV型膠原蛋白、 層粘蛋白卵巢漿液性腺癌 CA125、 EMA 、CEA、P53、 Ki67、 MRP3、 Pg糖蛋白卵巢粘液性腺癌 CK7、CK20、CEA、EMA、CA125 、S-100、P53、Ki-67、MRP3、Pg糖蛋白卵巢卵泡膜細胞瘤 Vimentin(+)( 但無法與纖維瘤區(qū)別) 因瘤細胞漿內含類脂質，用脂肪染色可證實乳腺浸潤性癌 ER、PR、SMA、P63、E-ca、P53、Ki-67、C-erbB-2、 MRP3、Pg-糖蛋白惡黑 S-100，HMB-45，NSE 免疫組化染色是通過一系列環(huán)節(jié)及過程。包括組織的固定，脫水，包埋，切片，各種抗體合理的稀釋度，孵育時間及

16、溫度，各種有關溶液的濃度和PH值等等，使抗體抗原更好保存并有效地結合，再通過顯色液顯現出來，最后用蘇木素襯染，每一步驟和環(huán)節(jié)都必須認真處理，一步差錯全部失敗。 常用的方法有S-P法、PAP法，ABC法。目前常用的是S-P法，即鏈酶菌抗生物素蛋白-過氧化物法。此法可產生低背景，高放大效果，更加簡便敏感和特異。在完成免疫酶標記全過程后，對于如何判斷標記的結果作出正確的診斷是非常重要的。 首先需要對本病例的石蠟切片，HE染色的切片有一個診斷意見，再次須掌握切片的主要病變區(qū)和細胞形態(tài)的特點，因為它是免疫組化標記的“靶細胞”，應根據“靶細胞”標記結果判斷其性質。在染色過程中，某些組織和細胞，如：紅細胞，嗜酸性粒細胞，肥大細胞，中性粒細胞和退化變性壞死組織也可以出現非特異反應，影響對標記結果的判斷。在鏡下必須會識別，防止誤認為陽性細胞。 抗原抗體結合后顯色，陽性時呈棕色顆粒狀。細胞陽性著色可以在細胞漿、細胞膜和細胞核。上皮性，肌源性，神經內分泌，黑色素，內皮細胞和外周神經細胞皆為細胞漿表達。即在細胞漿內出現棕色顆粒。淋巴細胞陽性表達是在細胞膜上，圍繞細胞膜出現棕色線狀結構。ER，PR陽性表達是棕色顆粒在細胞核內。 免疫組化檢測對所有腫瘤的病理診斷和科研方面帶來了很大的進步，解決了過去無法解決的問題。但是任何診斷方法都不是