熒光定量PCR儀器簡介liuyiPPT課件.ppt

1、.,1,熒光定量PCR儀器簡介,湖南圣湘生物科技有限公司 劉昳,.,2,主要內(nèi)容,.,3,.,4,945772,水浴鍋PCR,熒光定量PCR,金屬浴鍋PCR,1、PCR儀的發(fā)展歷史,.,5,2、熒光定量PCR儀的發(fā)展歷史,Perkin-Elmer Cetus儀器公司推出第一臺(tái)熱循環(huán)儀,ABI Prism 7700第一個(gè)高通量的實(shí)時(shí)熒光PCR儀,Bio-Rad iCycler,2000年后更多質(zhì)優(yōu)價(jià)廉的儀器進(jìn)入市場(chǎng)，通量更高,1985.11,1996年,1998年,1999年,2000年,ABI推出7900HT熒光定量PCR儀,Roche 推出第一臺(tái)全自動(dòng)熒光定量PCR儀Lightcycler

2、1.0,.,6,3、熒光定量PCR儀的組成,一臺(tái)PCR儀主要由控溫系統(tǒng)和光源系統(tǒng)兩大組件構(gòu)成。,.,7,4、熒光定量PCR儀的原理,Taqman 探針,.,8,4、熒光定量PCR儀的原理,.,9,5、熒光定量PCR儀的應(yīng)用,基礎(chǔ)科學(xué)研究 疾病檢測(cè)與治療檢測(cè)、預(yù)后 優(yōu)生優(yōu)育及遺傳篩查 基因表達(dá)分析 臨床醫(yī)學(xué)應(yīng)用 腫瘤分型/耐藥性評(píng)估 食品衛(wèi)生檢疫及安全評(píng)估,醫(yī)院檢驗(yàn)科、感染病科等 疾控中心 血站、血液中心 研究所等機(jī)構(gòu) 食品監(jiān)督管理局 海關(guān)進(jìn)出口檢疫,.,10,高端市場(chǎng),低端市場(chǎng),5、熒光定量PCR儀的市場(chǎng)情況,.,11,高通量,高速度,自動(dòng)化,靈活化,4,3,2,1,互聯(lián)網(wǎng)化,5,6、熒光定量

3、PCR儀的發(fā)展趨勢(shì),.,12,.,13,1、硬件組成,光學(xué)系統(tǒng)： 激發(fā)光源和 檢測(cè)系統(tǒng)； 熱循環(huán)系統(tǒng)： 加熱和制冷系統(tǒng)； 信號(hào)處理系統(tǒng)；,.,14,2、激發(fā)光源比較,.,15,Laser: 高強(qiáng)度, 波長范圍窄 Tungsten lamp: 中等光強(qiáng), 波長范圍寬 Light emitting diode: 低的光強(qiáng)，波長范圍窄,2. 激發(fā)光源比較,.,16,2. 激發(fā)光源比較,.,17,3、檢測(cè)裝置比較,.,18,3、檢測(cè)裝置靈敏度比較,PMT 可以檢測(cè)到很寬的波長范圍，并對(duì)信號(hào)有放大作用 CCD 檢測(cè)范圍寬, 易受背景信號(hào)噪音影響, 整體檢測(cè)時(shí)間較長 光電二極管可以檢測(cè)到很寬的波長范圍,

4、檢測(cè)靈敏度低,冷CCD裝置與普通CCD相比： 冷CCD能降低圖像噪音，提高圖像質(zhì)量和靈敏度。,.,19,3、檢測(cè)裝置PMT和CCD檢測(cè)原理比較：,光信號(hào)得以擴(kuò)增. 獲得更大的檢測(cè)信號(hào)和更高的靈敏度 無邊緣效應(yīng),光子釋放出電子，使檢測(cè)器留下一個(gè)帶正電荷 正電荷記數(shù)作為檢測(cè)信號(hào) 信號(hào)沒有得以放大 有邊緣效應(yīng),.,20,4、加熱系統(tǒng)：空氣加熱,速度快；管間溫度均一性好；無需金屬的精密加工；成本低； 對(duì)環(huán)境溫度要求高：不能低于室溫（15 - 35）; 靈活性差：不能做溫度梯度； 樣本數(shù)量少（羅氏毛細(xì)管32個(gè)）。,.,21,金屬熱塊的加熱和降溫分別通過電阻絲和半導(dǎo)體來控制。 特點(diǎn)： 溫控范圍大（ 4 t

5、o 99） ，均一性（0.5 ）； 靈活性好：可以做溫度梯度； 樣本數(shù)量多（96孔和384孔)； 但其加熱速度比空氣加熱稍慢。,4、加熱系統(tǒng)：半導(dǎo)體加熱系統(tǒng),.,22,風(fēng)扇制冷 壓縮機(jī)制冷 半導(dǎo)體制冷,5、制冷系統(tǒng),.,23,6、熒光定量PCR儀的性能目標(biāo),.,24,.,25,PCR儀的家族成員,進(jìn)口 美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司（ABI ） 美國伯樂（Bio-rad） 瑞士羅氏（Roche） 美國安捷倫（Agilent） 德國凱杰（Qiagen） 德國艾本德（Eppendorf） 韓國柏業(yè)（Bioneer）,國產(chǎn) 杭州博日（Bioer ） 上海宏石（Slan） 西安天?。═ianlong） 上海楓嶺

6、（Funglyn） 廈門安普利（Amplly） 廣州達(dá)安（DA） 上?？迫A（Fluocycler）,.,26,.,27,2007年：ABI Step one/Plus,2010年：ABI ViiA 7,.,28,ABI 儀器光學(xué)路徑,.,29,Rox：(5-carboxy-x-rhodamine) 5-羧基-X-羅丹明,樣本1,樣本2,Rox的功能： 1）校正單次反應(yīng)運(yùn)行中由于泡沫或蒸發(fā)/冷凝而導(dǎo)致的信號(hào)改變； 2）為故障分析提供一項(xiàng)強(qiáng)有力的診斷工具：每次循環(huán)采集參比染料信號(hào)，不受PCR反應(yīng)影響； 3）均一化校正由于移液誤差或蒸發(fā)所導(dǎo)致的批內(nèi)體積差異； 4）均一化校正批間體積差異，提供更連續(xù)一

7、致的批間重復(fù)Ct值。,ABI 儀器：校正染料ROX,.,30,ABI 儀器：校正染料ROX的效果,.,31,各款A(yù)BI主流熒光定量PCR的特點(diǎn),.,32,羅氏定量PCR儀大家族,Light cycler 1.5,Light cycler 2.0,Light cycler 480,Light cycler nano,Light cycler 1536,羅氏Cobas Ampliprep,.,33,空氣后通過加熱元件加熱，熱空氣經(jīng)過風(fēng)扇的作用進(jìn)入循環(huán)腔內(nèi)；通過風(fēng)扇的調(diào)節(jié)來保證空氣循環(huán)和溫度的均一性；加熱時(shí)，風(fēng)扇低速運(yùn)轉(zhuǎn)從而使得腔內(nèi)的溫度均勻；冷卻時(shí)，風(fēng)扇高速運(yùn)轉(zhuǎn)使加熱槍和毛細(xì)管降溫。,Roche

8、LC1.5/2.0熒光定量儀特點(diǎn),.,34,Roche LC 1.5/LC2.0性能參數(shù),.,35,Roche LC480 熱循環(huán)系統(tǒng)組成和特點(diǎn)： Thermal Block Cycler包括了樣本底座（96孔或384孔），Peltier元件，配合Therma-BaseTM 熱均衡器，銀質(zhì)散熱塊和電子元件。 Block cycler cover (熱蓋） Multiwell plate loader, Multiwell plate detector, Multiwell plate bar-code scanner (條形碼掃描裝置）， Block Cycler door with fans

9、.,熱蓋,微孔板模塊 Peltier 半導(dǎo)體加熱單位 冷卻裝置 Therma-BaseTM,Roche LC 480,.,36,Roche LC 480特有的溫控元件Therma-Base,Therma-Base是一種熱均衡器。 封閉的真空夾層，內(nèi)壁為燈芯式結(jié)構(gòu)，存貯工作液； 通過一系列的蒸發(fā)和凝結(jié)過程來調(diào)節(jié)控制溫度,提升導(dǎo)熱效率，提高孔間溫度均一性，孔間溫度的精確度0.1C 快速冷卻和加熱速度 Heating: (4.8) C/s Cooling: (2.5)C/s 整個(gè)板的精確 PCR 結(jié)果 96孔模式 1 hour 384孔模式 40 min,多孔板座,Peltier元件,冷卻裝置：銀質(zhì)

10、散熱鰭,Therma-Base層,.,37,光源：Xenon-lamp,Roche LC 480光學(xué)系統(tǒng)組成及特點(diǎn) 激發(fā)和發(fā)射濾鏡輪： 5個(gè)激發(fā)波長和6個(gè)檢測(cè)波長；半峰帶分別為25-40nm和20nm；,氙燈：激發(fā)波長從330nm到630nm；需預(yù)熱兩分鐘；平均壽命至少500個(gè)小時(shí)；易更換。,冷CCD(1204x1344), 溫度被控制在10左右，降低了熱噪作用。,Roche LC480 光學(xué)系統(tǒng)特點(diǎn),.,38,光路特點(diǎn)： 如何解決邊緣效應(yīng)？,光源太近： 光強(qiáng)度夠了，但邊緣光信號(hào)根本無法收集；,光源太遠(yuǎn)： 整體光強(qiáng)度不夠，且邊緣信號(hào)弱。,.,39,Roche LC 480 獨(dú)有的compact

11、 instrument:,兩個(gè)解決辦法： Field lens :具有很好的光透性和光收集能力；使得激發(fā)和檢測(cè)光的保持良好均一性；光線以近乎直角的角度經(jīng)過熱蓋孔射到每個(gè)孔中； 2. 特殊的光路設(shè)計(jì)使樣本與CCD達(dá)到最佳光程位置，光經(jīng)過多次折射后到達(dá)檢測(cè)系統(tǒng)。, 孔間無陰影效應(yīng) 很好地收集孔邊緣光，不會(huì)造成邊緣光的失真或變化,保證了整板的均一性和靈敏度,.,40,MyIQ單色PCR,Bio-rad IQ5,Bio-rad I Cycler,MJ Opticon2,Bio-rad CFX-96,伯樂定量PCR儀大家族,.,41,Bio-Rad Real Time PCR 儀性能特點(diǎn),.,42,安捷

12、倫定量PCR儀大家族,Strategene Mx3000P,Strategene Mx3005P,2001年，Strategene Mx3000P,2007年，安捷倫收購Strategene。,.,43,Mx3000p熒光定量PCR儀硬件,.,44,熱循環(huán)系統(tǒng)特點(diǎn)： 半導(dǎo)體控溫制冷（Peltier 控溫） 熱蓋加熱 升降溫速度2.5/s 溫度均一性和準(zhǔn)確性：0.25,.,45,光學(xué)系統(tǒng)特點(diǎn)：, 1 使用PMT光電倍增管 （提高靈敏度且無邊緣效應(yīng)） 2 光纖維掃描激發(fā)和檢測(cè) 3 光源：鹵鎢燈,.,46,掃描式檢測(cè)模式：,恒定的強(qiáng)度，沒有位置的相關(guān)性；,1. 所有96孔都用相同強(qiáng)度的光掃描，因此沒

13、有激發(fā)的差別 2. 所有96孔的發(fā)射光都經(jīng)過相同的距離傳輸給PMT，因此沒有檢測(cè)距離的差別,避免了個(gè)樣品間的光程差，無需內(nèi)參校正。,整板讀取 3.5 秒；4通道的掃描16秒；5通道的掃描要20秒 選擇不同的染料后，分別掃描 濾鏡輪轉(zhuǎn)動(dòng) 16 bit PMT 檢測(cè)熒光,.,47,ROTOR Gene 3000,ROTOR Gene 6000,ROTOR Gene Q,凱杰定量PCR儀大家族,2008年，Qiagene收購Cobbert。,.,48,LED激發(fā),PMT檢測(cè),反應(yīng)倉-空氣流動(dòng)使溫度上升下降,.,49,主要特點(diǎn)： 空氣加熱，升溫（15/s) 和降溫(20 /s)速度快； 每通道獨(dú)立LE

14、D燈光源，和濾光片，多達(dá)6個(gè)通道（365-680nm激發(fā)，460-750nm檢測(cè)）； PMT檢測(cè)，增益可調(diào)； 提供Rotor0DiscTM OTV進(jìn)行光學(xué)溫度校驗(yàn)； 36-well Rotor,72-well Rotor,0.2ml普通PCR管，0.1ml四聯(lián)管；,Rotor-Gene Q實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀-Qiagen,.,50,其他進(jìn)口PCR儀,艾本德Mastercycler,柏業(yè)Exicycler TM96,.,51,LINE-GENEFQD-33A,LINE-GENEFQD-66A,LINE-GENEFQD-K,LINE-GENEFQD-96A,博日定量PCR儀大家族,.,52,博日

15、PCR儀器加熱模塊,.,53,激發(fā)光LED,Long life maintenance-free ultra-bright,熒光檢測(cè)PMT,Low Temperature Drift ultra-sensitive High-stable,博日PCR儀器光源系統(tǒng),.,54,底部掃描方式，全板掃描時(shí)間少于5秒,博日PCR儀器熒光采集,.,55,SLAN-48,SLAN-96P,SLAN-96R,宏石定量PCR儀大家族,.,56,宏石slan熒光定量PCR儀,光源：LED燈 檢測(cè)裝置：PMT(光電倍增管） 溫控系統(tǒng)：半導(dǎo)體加熱/制冷 檢測(cè)動(dòng)力學(xué)范圍：100-1010 反應(yīng)體積：10ul-100ul

16、 可選擇的熒光染料：FAM,SYBER;VIC,HEX,JOE,TET;ROX,TEXRAD,CY5 樣本容量：48個(gè)（20ul-100ul) SFDA, CETUVISO13485認(rèn)證（2003）,軟件系統(tǒng)根據(jù)每管熒光值大小，自動(dòng)選擇增益值，無需手動(dòng)設(shè)置； 檢測(cè)靈敏度高，熒光背景值低，無需光學(xué)及背景校正。,.,57,Slan 的獨(dú)特檢測(cè)模式： 獨(dú)立光纖傳導(dǎo)掃描 側(cè)面檢測(cè),提高了熒光采集效率，減小孔間熒光干擾 側(cè)面檢測(cè)，相對(duì)頂部透光，降低了對(duì)管蓋透光性的要求,.,58,.,59,Genelight2400,Genelight9800,安普利定量PCR儀大家族,.,60,達(dá)安DA7600,達(dá)安PCR儀,光源：LED燈 檢測(cè)裝置：PMT(光電倍增管） 溫控系統(tǒng)：半導(dǎo)體加熱/制冷 檢測(cè)動(dòng)力學(xué)范圍：100-1010 反應(yīng)體積：10ul-100ul 激發(fā)波長：470nm 檢測(cè)波長：530nm 、640nm 、710nm 溫度范圍：30-99 可選擇的熒光染料：FAM,SYBER; LC640 NHS ESTER;CY5.5,TYE705 樣本容量：48個(gè)（20u