飼料用酶ppt課件

1、中國農業(yè)科學院飼料研究所楊培龍 姚斌,2009年10月18日,飼料用酶的研究進展,1,飼料用酶制劑,一種新型的飼料添加劑，可提高動物的生產(chǎn)性能、降低飼料成本、減輕環(huán)境污染及開發(fā)新型的飼料資源。 植酸酶、淀粉酶、木聚糖酶、b-甘露聚糖酶、 b-葡聚糖酶、 a-半乳糖苷酶、脂肪酶、角蛋白酶、葡萄糖氧化酶、霉菌毒素降解酶、溶菌酶等,2,飼料用酶種類,對動物內源酶進行補充的飼料用酶, 如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等 消除飼料中的抗營養(yǎng)因子的飼料用酶, 如b-葡聚糖酶、植酸酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、b-半乳糖苷酶等 使某些營養(yǎng)物質得到更有效的吸收利用、提高低劣質飼料成份的營養(yǎng)價值的飼料用酶, 如纖維素酶、木

2、質素酶、植酸酶、果膠酶、角蛋白酶等 毒素、有害微生物去除的飼料用酶， 如霉菌毒素降解酶、有機磷農藥降解酶、溶菌酶等,3,飼料用酶的意義,1.緩解飼料資源短缺 2015年, 缺口將達0.5億噸 提高飼料利用率,節(jié)約并開發(fā)新的資源 2.減輕環(huán)境污染 排放量(萬噸/年) P: 250 N 500 N、P排放量降低40%以上 3.提供更為安全的動物產(chǎn)品 具有控制、預防動物疾病 減少抗生素、化學添加劑的使用 4.提高養(yǎng)殖業(yè)綜合經(jīng)濟效益 降低飼料成本; 降低料肉比;提高增重,4,飼 料 用 酶 現(xiàn) 狀,九十年代才開始規(guī)模應用, 2008年市場值達到3億美元, 酶制劑中年增長最快的。 以飼料用酶為主體的生物

3、工程產(chǎn)品在飼料中占飼料價值的20%,卻決定了80%的飼料質量 目前b-葡聚糖酶、植酸酶、木聚糖酶等多個酶種已得到了一定程度的應用 但與別的飼料添加劑相比, 飼料酶的應用還處于嬰兒期, 全球只有不足30%飼料在應用,5,原 因,一、酶的性質不能滿足要求 飼料用酶需同時具備以下優(yōu)良性質: 熱穩(wěn)定性好而同時在常溫下又具有高活性 最適pH在酸性同時在整個酸性和中性的pH范圍內又能維持較高活性 對動物胃、胰蛋白酶和別的蛋白酶具有較好的抗性等綜合性質,6,原 因,二、飼料用酶的生產(chǎn)成本 飼料用酶僅是眾多飼料添加劑中的一類,決定了其添加成本必須十分低廉。,7,國內外差距,研究與應用起步較晚，差距較大。除少數(shù)

4、產(chǎn)品外, 普遍存在生產(chǎn)技術水平低、品種少、應用技術不完善等問題。國外已有十余種酶制劑實現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化, 并在包括中國的市場上銷售和應用。 生產(chǎn)成本高。國外80%以上的飼料酶制劑是利用基因工程菌株高效生產(chǎn), 而我國僅有植酸酶等少數(shù)幾種是利用基因工程菌株高效生產(chǎn), 而大部分酶制劑是采用天然和誘變菌株發(fā)酵生產(chǎn), 成本高。,8,國內外差距,酶的有效性差，應用效果不穩(wěn)定。酶的性質不夠理想；非單酶生產(chǎn)，各種酶的相對比例難以控制, 質量標準難以控制, 造成使用時效果不穩(wěn)定、重復性差。 酶的配套應用技術體系不完善。缺乏針對我國飼料日糧和動物特征的應用技術。,9,研發(fā)趨勢,注重資源挖掘, 尤其是微生物資源。利用現(xiàn)代

5、分子生物學和生物技術手段, 高通量篩選飼料用酶微生物及相關基因資源, 近來特殊環(huán)境微生物成為重點目標。 利用基因工程、代謝工程技術, 構建高效生物反應器技術平臺, 使飼料酶的單位產(chǎn)量成百上千倍的提高, 以期規(guī)模化廉價生產(chǎn), 以解決飼料添加劑添加成本空間有限的問題。,10,研發(fā)趨勢,發(fā)酵技術和產(chǎn)品加工平臺技術。重點針對幾種主要的飼料微生物反應器, 如酵母、曲霉、芽孢桿菌等, 建立高效的高密度發(fā)酵方法, 并開發(fā)高效穩(wěn)定的產(chǎn)品加工技術, 提高飼料生物制劑的穩(wěn)定性、實用性和應用的高效性。 飼料生物制劑的應用效果快速評估系統(tǒng)和配套應用技術體系研究。,11,我們的研發(fā)和產(chǎn)業(yè)化進展,12,中國農業(yè)科學院飼料

6、研究所微生物工程研究室簡介,成立于1994年 國內飼料科學研究中第一個分子生物學和基因工程實驗室。 研究內容: 飼料和工業(yè)用酶及其它生物活性物質的研發(fā) 動物胃腸道微生物及基因的分子生態(tài) 魚的分子免疫與基因工程疫苗,13,飼料用酶的研究平臺,技術平臺的建立 新酶及基因的高通量篩選平臺技術 有效的分子改良平臺技術 高效表達平臺技術 發(fā)酵技術和規(guī)?；a(chǎn)技術,14,基因資源,新酶、新基因的高通量篩選,15,特殊環(huán)境,冰川土樣 雪蓮根部土樣 地方羊品種瘤胃 草魚胃腸道 天牛胃腸道 深海魚胃腸道 棉槳廢水 金屬礦廢水 熱泉 火焰山土樣,16,17,主要結果,基本建立了從特殊環(huán)境中快速篩選新酶編碼基因的有

7、效方法體系 構建了一種無需建庫和分離微生物而直接從環(huán)境基因組中克隆全長基因的方法 研究了10余種特殊環(huán)境的微生物多樣性 分離到300株以上的產(chǎn)目標酶酶微生物，其中有5個新種，10余個潛在的新種 研究了8種目標酶在多個特殊環(huán)境中的基因多樣性 克隆到了超過2000個的目標酶基因片段 克隆到了300個以上的全長新基因,18,主要結果,篩選到了大量的性質各異、具有重要應用價值的酶及基因 可加深我們對酶關鍵性質與結構功能的了解, 指導進一步的分子改良 綜合性質極為優(yōu)良的植酸酶、木聚糖酶、b-甘露聚糖酶等 具有特殊性質的酶: 如低溫酶、高溫酶、高比活性酶、強酸性酶、強堿性酶、抗蛋白酶降解的酶等,19,雪蓮

8、根部土壤低溫脂肪酶基因片段進化樹圖譜,進化樹顯示為五個獨立分開的進化簇，說明冰川土壤中的脂肪酶基因序列呈現(xiàn)出多樣性的特點, HSL家族脂肪酶作為參考序列,20,Diversity of BPP gene fragments from grass carp digestive tracts,21,冰川土樣中第10族木聚糖酶多樣性分析,F134,F211,F207,F234,F179,F77,F121,F20,F100,F119,F10,F96,F45,F109,F219,F58,F83,F210,F89,F128,F140,F31,F239,F8,F67,F50,F19,F197,F153,F5

9、6,F81,F99,F78,F28,F84,F136,F36,F47,F223,F133,F156,F216,F17,F160,F204,F144,F188,F26,F22,F122,F88,F87,F27,F241,F6,F206,F37,F60,F95,F24,F68,F21,F117,0.02,22,結構具有特點的植酸酶基因,類似于操縱子的Erwinia herbicola E3植酸酶基因結構,IMP基因和HAP基因，這兩個基因共用一個啟動子，IMP基因的終止密碼子TAA后，緊接著是HAP基因的起始密碼子ATG， 在E. herbicola E5也存在類似的結構 活性研究表明：IMP和H

10、AP都能水解植酸，最適pH都為4.5左右。并且兩個酶一起作用時，比兩個酶各自單獨作用的效果之和更好,23,結構具有特點的植酸酶基因,來源于Pseudomonas fluorescens 206串聯(lián)的植酸酶結構,phytase1全長1284 bp，編碼了427個氨基酸，phytase2全長1287 bp，編碼了428個氨基酸 序列之間具有較低的一致性（蛋白序列 52.1%） 兩個基因在大腸桿菌中都得到活性表達，最適合pH分別為 5.0 和4.5,24,結構具有特點的植酸酶基因,多個磷代謝相關結構域的N. punctiforme 植酸酶基因,磷酸酶結構域，植酸酶結構域，堿性磷酸酶結構域，和鈣離子結

11、合域 完整的蛋白和單獨的植酸酶結構域都能有效的水解植酸 完整蛋白的比活性高于單個植酸酶結構域。作用機制還需要進一步的研究。,25,綜合性質優(yōu)良的植酸酶 Y4,26,在低pH值和強胃蛋白酶下高效水解植酸的Y. rohdei 植酸酶(豬專用植酸酶),具備三個必要條件 在強酸性條件下有高活性 強酸穩(wěn)定性 高濃度胃蛋白酶抗性 該酶同樣具有高比活，高的表達量 是豬用植酸酶最好的候選者,27,最適pH比較,28,pH穩(wěn)定性比較,29,胃蛋白酶抗性比較(標準方法),30,具有低溫活性的E. carotovora植酸酶,具有低溫酶典型特性 低溫時高的活性 差的熱穩(wěn)定性 在零度時具有5%的活性 最適活性溫度，與

12、動物體溫相近 首次報道的低溫植酸酶 是研究植酸酶結構的優(yōu)良材料,31,來源于藻類的中性植酸酶,最適鈣離子濃度1.5 mM 最適pH 6.5 最適溫度50C 具有典型BPP植酸酶的特性 鈣離子對該植酸酶的熱穩(wěn)定性和酶活性是必須的,32,瘤胃中性植酸酶CP53,首次從宏基因組中通過改進的TAIL的方法克隆到一致性低的新基因 與報道的CP基因有不同的pH特性（6.5 VS 4.5）, 增加了對的CP植酸酶認識 在中性條件下具有高活性為CP植酸酶的應用研究提供更多的拓展空間,33,Pedobacter nyackensis 中性植酸酶,在pH7.0、20 時，r-PhyMJ11水解豆粕的能力是A.ni

13、ger和E.coli植酸酶水解能力的10倍以上以上,34,綜合性質優(yōu)良的木聚糖酶,35,抗多種蛋白酶的木聚糖酶,36,高溫強酸性木聚糖酶,Optimum temperature at 93C and high stability at 90C,Optimum pH 4.0 with high activity at acidic condition,37,多個pH峰的木聚糖酶和葡聚糖酶,Glucanase,Xylanase,38,對多種底物有高活性的-glucanase Bg1,39,抗多種蛋白酶的Lipase lipS221,40,低溫磷脂酶LIPA,41,pH5.0的高溫淀粉酶,42,嗜酸

14、性淀粉酶 AMY2,43,具有高角蛋白降解活性的蛋白酶,44,對多種底物有高活性的 a -galactosidase AGL1,45,抗多種蛋白酶的a-galactosidase AGL5,46,高效a半乳糖苷酶(豆粕降解),I-1: 加a-半乳糖苷酶 I-2: 同時加a-半乳糖苷酶和胰蛋白酶,47,-Galactosidase with high efficiency to release galactose from soybean W/O trypsin,48,高比活b-mannanase,49,具有強嗜酸性的甘露聚糖酶,50,抗金屬離子的甘露聚糖酶MAN5A,51,在SGF下有高活性的

15、乳糖酶,與來源于A.oryzae的乳糖酶比較,52,對飼料有害真菌有抗菌活性的b-1,3-葡聚糖酶,53,酶的分子改良,分子改良技術 DNA改組 定點突變 基因雜合 全新設計 突變酶篩選技術,54,主要結果,已取得了一些進展，但還未建立完整高效的技術體系 在突變酶表達篩選系統(tǒng)上有所突破 有成功的例子 多種具有特點的酶蛋白在進行晶體結構解析,55,突變酶表達篩選系統(tǒng)-木聚糖酶-突變酶胞外表達系統(tǒng),前期研究發(fā)現(xiàn), 在大腸桿菌中 木聚糖酶高表達, 大量分泌至胞外 C端可自動斷裂 解決的問題: 不/低表達的酶-活性表達/高表達 細胞周質-胞外 融合酶會自動斷裂成單酶,56,植酸酶Y3的pH改良,57,

16、植酸酶Y5的突變體,58,木聚糖酶的熱穩(wěn)定性改良,After treated at 70 for 20 min, XS and TS showed better thermastability than XYNB, TS showed 12.4 times of enzyme activity than XYNB.,59,木聚糖酶的比活性改良,60,達到領先水平的表達技術,進行了大量的有關畢赤酵母重組生物反應器的研究,建立了有效的高效表達方法體系,61,高效表達技術,綜合以下手段 目標基因的優(yōu)化：密碼子、二級結構、自由能等 啟動子改良、多啟動子組合 信號肽改良 分子伴侶 解決溶氧的血紅蛋白 能

17、穩(wěn)定遺傳和表達的多拷貝技術 整合位點的控制,62,高效表達：高效生物反應器,構建了特有的穩(wěn)定、高效的畢赤酵母表達系統(tǒng)，其特點和優(yōu)勢在于： 單位表達量更高。尤其對以往在原始畢赤酵母中表達量較低的外源基因可大副度提高其表達量 多種蛋白表達量達到了5mg/mL以上, 最高的達到12mg/mL 表達的穩(wěn)定性更好，并在8年來的實際生產(chǎn)上得到證明,63,多種植酸酶、木聚糖酶、蛋白酶、淀粉酶表達量均達到5mg/mL以上,64,木聚糖酶發(fā)酵水平不斷提高 1500 5000 15000 40000 100000 170000 IU/mL 植酸酶發(fā)酵水平不斷提高800 5000 1000020000 30000

18、45000IU/mL,甘露聚糖酶: 8000IU/mL乳糖酶: 12000IU/mL葡聚糖酶: 35000IU/mL葡萄糖氧化酶: 500IU/mL,65,別的表達系統(tǒng)已初步建立,芽孢桿菌表達系統(tǒng) 乳酸菌表達系統(tǒng) 曲霉表達系統(tǒng) 木霉表達系統(tǒng) 轉基因植物,66,高比活木聚糖酶在煙草中的表達,xynB基因整合入轉基因煙草的基因組中。,轉基因煙草中xynB基因正確轉錄,木聚糖酶蛋白在轉基因煙草中高效表達,67,轉基因煙草重組酶的穩(wěn)定性分析,25,37,55 ,60 ,轉基因煙草中表達的木聚糖酶在室溫和37 保持穩(wěn)定性,轉基因煙草表達木聚糖酶具有一定程度的熱穩(wěn)定性,轉基因煙草T1代植株具有木聚糖酶的活性，具有遺傳穩(wěn)定性,68,高比活性木聚糖酶XYNB在轉基因馬鈴薯中的表達,xynB基因整合入轉基因馬鈴薯的基因組中,轉基因馬鈴薯中的xynB基因可以正確轉錄,木聚糖酶在轉基因馬鈴薯中高效組成型表達,繁殖3-4代，轉基因馬鈴薯的酶活性不變，具有遺傳穩(wěn)定性,轉基因馬鈴薯中表達的木聚糖酶具有熱