第二章 基因工程工具酶(簡(jiǎn)化版).ppt

1、佐原健二基因工程中的工具酶，1，限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)，第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶，限制性核酸內(nèi)切酶(restriction)修飾(modification)限制性核酸內(nèi)切酶的生物學(xué)功能：自我保護(hù)功能(僅切斷外來(lái)DNA，自身DNA 5) 酶切點(diǎn)計(jì)算：4核苷酸識(shí)別序列：44=256核苷酸識(shí)別序列：44=256 B GC含量50%，例如用Bgl(A/GATC/T)酶DNA 49 kb 3360理論切點(diǎn)：3，限制性核酸內(nèi)切酶的命名，1973年H.Smith和D.Nathans建議，每種酶產(chǎn)生并純化該酶的細(xì)菌物種名稱中的三個(gè)字母相加。第一個(gè)字母用大寫字母表示細(xì)菌中名字的第一個(gè)字母。第二和第三個(gè)字母用小寫字

2、母使用細(xì)菌物種名稱的前兩個(gè)字母。大腸桿菌等Eco表示從大腸桿菌中分離出的限制性內(nèi)切酶。第四個(gè)字母表示菌株類型(大小寫均為)。例如，EcoR中的R表示大腸桿菌R株。如果菌株有幾種限制性內(nèi)切酶，在表示菌株的字母后用羅馬數(shù)字表示。事故測(cè)試問題：流感(Haemophilus influenzae)d菌株有三種限制性酶，每種酶如何出現(xiàn)？Hind I，HindII，Hindi ii，baci uus Amy lolique faciens h Streptomyces albus I，1，天然DNA的制備，1，天然DNA的源染色體DNA病毒和噬菌體DNA質(zhì)粒分離并提取DNA。2，DNA的純化，瓊脂糖凝膠電

3、泳洗滌法應(yīng)用于少量DNA的純化和酶DNA片段的回收。3，DNA濃度，乙醇沉淀法在含有一價(jià)陽(yáng)離子的DNA溶液中加入2體積的無(wú)水乙醇，將DNA沉淀(-20，30min以上)通過離心收集沉淀的DNA溶解成適量的TE緩沖液或無(wú)菌水，4，限制性的核酸內(nèi)切酶反應(yīng)。完全酶切后，產(chǎn)生鑒定序列數(shù)(N)等DNA片段數(shù)，DNA片段兩端相等。如果DNA樣本原來(lái)是線性DNA片段，則完全酶的結(jié)果產(chǎn)生n 1個(gè)DNA片段的數(shù)量，其中2個(gè)片段的一端仍保持原來(lái)的一端，3，雙酶法首先需要低鹽。如果兩種限制性核酸內(nèi)切酶的最佳反應(yīng)溫度不同，首先要用最佳反應(yīng)溫度較低的酶切，加熱，然后放入第二種酶切。如果兩個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶的反應(yīng)系統(tǒng)差異

4、很大，對(duì)雙酶切割結(jié)果有很大影響，可以在第一次酶切割后通過凝膠電泳回收所需的DNA片段，然后選擇適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)系統(tǒng)進(jìn)行第二次限制性核酸內(nèi)切酶切割。(David aser，Northern Exposure，Northern Exposure，健康)，4，一些酶切割，一些限制性核酸內(nèi)切酶切割的DNA分子有多個(gè)識(shí)別序列，其中一個(gè)識(shí)別序列需要切割后再利用如果完全切酶，就要切掉這個(gè)待定的DNA片段。(阿爾伯特愛因斯坦，Northern Exposure)在這種情況下，對(duì)DNA樣本進(jìn)行部分酶，經(jīng)過凝膠電泳，根據(jù)要使用的DNA片段大小，可回收的DNA片段，5，DNA分子的限制度，5，影響核酸內(nèi)切酶活性的因素，(

5、1)DNA純度，(2)DNA第一，DNA大多數(shù)情況下，要開始合成互補(bǔ)的新鏈，需要引物。間歇(discontinuity): DNA中一條鏈上一個(gè)位置的兩個(gè)相鄰核苷酸之間的磷酸酯鍵斷了。nick:在一個(gè)位置丟失了一個(gè)或多個(gè)核苷酸。(1)以DNA聚合酶I為代表的“合成型”(2)以klenow聚合酶為代表，聚合酶活性和部分外體酶的活性(3)只有逆轉(zhuǎn)錄酶類，RNA為聚合模板，根據(jù)模板和作用方式分為三類。2，大腸1，性質(zhì)： 53 DNA聚合酶活性35外核酸酶活性53外核酸酶活性，3，大腸桿菌DNA聚合酶I對(duì)角(Klenow片段)，1，性質(zhì)具有53聚合活性和35外體酶活性，失去53的核酸外體酶活性。其35

6、外體酶活性對(duì)單鏈DNA的作用比雙鏈DNA更強(qiáng)。它的外切核酸酶活性比kenow片段強(qiáng)200倍。2，用途1)限制內(nèi)切酶對(duì)消化DNA后產(chǎn)生的3凹端進(jìn)行補(bǔ)充或標(biāo)記。2)在具有3個(gè)擠出端的DNA分子上做終止標(biāo)記。5，T7噬菌體DNA聚合酶，1，性質(zhì)持續(xù)合成能力最強(qiáng)的35外核酸酶活性是klenow片段的1000倍，沒有53外體酶活性。2、主要用途1)用于克隆長(zhǎng)段模板的引物擴(kuò)展反應(yīng)。2)通過平準(zhǔn)化或交換(位移)反應(yīng)進(jìn)行快速結(jié)束標(biāo)記。6，Taq DNA聚合酶，53外核酸酶活性。最佳作用溫度為75-80。3 5由于沒有外源核酸酶活性，糾錯(cuò)功能下降。用途1)可以將特定序列放大106倍。2)用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PC

7、R)，體外擴(kuò)增DNA片段。7，逆轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcriptase)依賴RNA的cDNA聚合酶，商品化逆轉(zhuǎn)錄酶：禽源逆轉(zhuǎn)錄酶(AMV)，鼠源逆轉(zhuǎn)錄酶(MoMLV)，逆轉(zhuǎn)錄酶的基本特性：RNA PCR具有特異性強(qiáng)，靈敏度高，簡(jiǎn)單快速，對(duì)標(biāo)本純度要求低的特點(diǎn)。變性94C，擴(kuò)展72C，退火Tm-5C，E.coli DNA連接酶：平端連接效率遠(yuǎn)低于T4DNA連接酶，無(wú)法連接RNA分子。T4 RNA連接酶：催化兩個(gè)單鏈DNA或RNA分子的連接。1，連接酶功能1，間歇性恢復(fù)功能2，連接功能，3，粘性末端連接技術(shù)，1，連接體技術(shù)2，連接體技術(shù)3，變形器此方法是RFLP(Restriction

8、 Fragment Length Polymorphisms)使用人工連接器(Adaptor)連接到用限制性內(nèi)切酶切割的基因組DNA片段，并將其作為DNA模板，在系列3的末端隨機(jī)改變幾個(gè)堿基，合成與人工連接器序列互補(bǔ)的PCR特異條帶擴(kuò)增，并在電泳檢查后獲得DNA指紋。，這一技術(shù)優(yōu)勢(shì)(1)穩(wěn)定性、重復(fù)性；(2)所需DNA的楊怡少，適合分析的DNA大小范圍大。(。(3)可以產(chǎn)生更多多態(tài)標(biāo)記，結(jié)果頻帶也更密集，通常比RFLP和RAPD多10100倍，便于比較分析。(4)操作容易標(biāo)準(zhǔn)化和自動(dòng)化，適合大量樣品分析。第7節(jié)基因工程中的其他酶類，1，DNA，RNA的修飾酶(1)末端(脫氧核苷酸)轉(zhuǎn)移酶，(2)堿性磷酸酶(alkaline phosphatase)，(3)多核苷酸酶切部位的估算；酶切反應(yīng)。DNA聚合酶DNA聚合酶I、Klenow酶、T4D