SNAPtag蛋白標(biāo)記技術(shù)PPT課件

1、.,1,SNAP-tag蛋白標(biāo)記技術(shù)在生物學(xué)領(lǐng)域的的應(yīng)用研究進(jìn)展,生物物理學(xué)報(bào) 2014年6月 第30卷 第4期：251-263,.,2,背景,蛋白質(zhì)是細(xì)胞的基本組成成分，是生命功能的體現(xiàn)者。研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能及其在細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)動(dòng)特征、相互作用和化學(xué)微環(huán)境等，對(duì)于了解細(xì)胞復(fù)雜的生命過程至關(guān)重要。 1.綠色熒光蛋白（green fluorescent protein, GFP）的發(fā)現(xiàn)及應(yīng)用，是活細(xì)胞蛋白特異性標(biāo)記方法發(fā)展的一個(gè)里程碑，它可以在不額外加入任何底物的情況下發(fā)出熒光，結(jié)合熒光成像技術(shù)可實(shí)現(xiàn)對(duì)活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的可視化監(jiān)測(cè)。 缺點(diǎn)： GFP的熒光光譜較為單一，發(fā)光具有氧依賴性，且存在應(yīng)答較

2、為緩慢、靈敏度不高等。 2.SNAP-tag蛋白標(biāo)記技術(shù)克服了以上缺點(diǎn)，具有較高的特異性、穩(wěn)定性及配體的多樣性，在蛋白標(biāo)記等眾多領(lǐng)域獲得越來越廣泛的應(yīng)用。,.,3,SNAP-tag的設(shè)計(jì)原理,SNAP-tag蛋白中作為反應(yīng)位點(diǎn)的半膀氨酸親和進(jìn)攻O6修飾的苯甲基鳥嘌呤的芐基，脫去鳥嘌呤結(jié)構(gòu)后，半膀氨酸與芐基形成穩(wěn)定的硫醚共價(jià)鍵，實(shí)現(xiàn)對(duì)靶蛋白的共價(jià)標(biāo)記。,.,4,SNAP-tag的配體及功能,.,5,優(yōu)點(diǎn),.,6,SNAP-tag技術(shù)的應(yīng)用,.,7,SNAP-tag在細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)性質(zhì)與功能研究中的應(yīng)用,1.蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用研究 (1)SNAP-tag熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù),Johnsson等將

3、SNAP-tag及其突變體作為融合標(biāo)簽蛋白，成功應(yīng)用于雷帕霉素介導(dǎo)的FKBP與雷帕霉素靶蛋白結(jié)構(gòu)域的相互作用研究。,.,8,(2)SNAP-tag介導(dǎo)的選擇性交聯(lián)技術(shù),Johnsson利用SNAP與BG之間不可逆的共價(jià)結(jié)合特點(diǎn)，設(shè)計(jì)了帶有兩個(gè)BG結(jié)構(gòu)的交聯(lián)劑，用于特異性、穩(wěn)定交聯(lián)兩個(gè)SNAP-tag融合蛋白。,.,9,(3)SNAP-tag蛋白質(zhì)片段互補(bǔ)分析技術(shù),SNAP-tag蛋白由兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，Mie等將其分裂成nSNAP和cSNAP蛋白片段的組裝，分別與可能相互作用的兩個(gè)蛋白融合，從而迅速恢復(fù)與SNAP-tag底物的反應(yīng)活性，通過熒光檢測(cè)兩個(gè)蛋白是否相互作用。,.,10,2.蛋白質(zhì)定位

4、、運(yùn)輸?shù)母櫛O(jiān)測(cè)及動(dòng)力學(xué)分析,細(xì)胞內(nèi)的二氫葉酸還原酶常被融合于線粒體靶向序列，以用來研究線粒體輸入的動(dòng)力學(xué)過程，Krayl等通過構(gòu)建細(xì)胞色素2-DHFR-SNAP-tag融合蛋白分析了線粒體前體蛋白的運(yùn)輸過程。,.,11,3.體內(nèi)蛋白質(zhì)半衰期監(jiān)測(cè),.,12,展望,SNAP-tag技術(shù)的缺陷： 1.蛋白標(biāo)簽的分子量仍然較大，僅能與目標(biāo)蛋白通過N端或C端融合，可能對(duì)某些融合蛋白的構(gòu)象與功能產(chǎn)生影響 2.配體分子與SNAP-tag蛋白的結(jié)合雖具有較高的特異性，但受配體分子本身性質(zhì)的影響，仍可能產(chǎn)生非特異性標(biāo)記的干擾,.,13,在今后研究中，應(yīng)以生物學(xué)研究為設(shè)計(jì)依據(jù)，以功能性配體分子的設(shè)計(jì)為基礎(chǔ)，發(fā)揮S