基因工程考綱

1、第一章 緒論1. 基因工程的定義在體外對(duì)不同生物的遺傳物質(zhì)（基因）進(jìn)行剪切、重組、連接，然后插入到載體分子中（細(xì)菌質(zhì)粒、病毒或噬菌體DNA），轉(zhuǎn)入微生物、植物或動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行無(wú)性繁殖，并表達(dá)出基因產(chǎn)物。2. 基因工程的造作路線1) 目的基因的獲取2) 重組體的制備3) 轉(zhuǎn)化4) 克隆鑒定5) 目的基因擴(kuò)增6) 目的基因表達(dá)第二章 基本操作的主要技術(shù)原理第一節(jié) 核酸的分離與純化1. DNA的提取主要步驟1) 生物材料的準(zhǔn)備【選取DNA含量高的組織以及生長(zhǎng)期】2) 裂解細(xì)胞 3) 分離和抽提DNA4) DNA濃縮例子：大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取2. RNA分離純化（主要步驟不作要求）注意事項(xiàng)：RNA

2、比DNA更不穩(wěn)定，而RNase又無(wú)處不在，避免RNA酶的作用1) 避免外源RNase的污染：所有用于植被RNA的玻璃器皿均要滅菌處理2) 抑制內(nèi)源性RNase的活性：在破碎細(xì)胞的同時(shí)加入強(qiáng)變性劑使RNase失活3) 在RNA的反應(yīng)體系內(nèi)加入RNase的抑制劑第二節(jié) 凝膠電泳1. 電泳基本原理：1) 帶電荷的分子在電場(chǎng)中會(huì)以一定的速率向與其電荷性質(zhì)相反的電極移動(dòng)，速度稱(chēng)為電泳遷移率2) 電泳遷移率同電廠的強(qiáng)度和分子本身所帶的凈電荷數(shù)目成正比3) 電泳遷移率同分子與介質(zhì)的摩擦系數(shù)成反比第三章 分子克隆工具酶第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶1. 概念：是一類(lèi)能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由

3、此處切割DNA雙鏈的核酸內(nèi)切酶2. 識(shí)別位點(diǎn)：以環(huán)狀和線狀雙鏈DNA為底物，使兩條核糖鏈上特定位置3,5-磷酸二酯鍵斷開(kāi)，產(chǎn)生3-OH基團(tuán)和5-p基團(tuán)片段。3. 酶切位點(diǎn)：內(nèi)切酶可以在識(shí)別位點(diǎn)上將DNA的3,5-磷酸二酯鍵水解斷開(kāi)4. 內(nèi)切酶的反應(yīng)溫度：不同的酶的最適反應(yīng)溫度不同，大多數(shù)是37C，少數(shù)要求40-65C5. 內(nèi)切酶的Star活性l 某種內(nèi)切酶在特定條件下，可在不是原識(shí)別序列處切割DNA，這種現(xiàn)象稱(chēng)為內(nèi)切酶的Star活性l 幾乎所有的內(nèi)切酶均有Star活性l Star活性出現(xiàn)的頻率因采用的內(nèi)切酶底物DNA和反應(yīng)條件不同而不同6. DNA分子片段化（DNA常用的切割方法）：?jiǎn)蚊盖蟹ā?/p>

4、雙酶切法、部分酶切法【名詞解釋】酶切位點(diǎn)、識(shí)別序列，以及兩者的聯(lián)系區(qū)別內(nèi)切酶的兩種切割方式：粘性末端、平末端內(nèi)切酶的Star活性第二節(jié) DNA連接酶1. DNA連接酶特點(diǎn)：1）被連接的DNA鏈必須是雙螺旋DNA分子2）羥基和磷酸基團(tuán)之間形成磷酸二酯鍵是一種耗能反應(yīng)（大腸桿菌利用NAP+作為能源，動(dòng)物和噬菌體利用ATP作為能源第三節(jié) 其他工具酶1. DNA聚合酶包括：大腸桿菌聚合酶（全酶）、Klenow大片段酶、T4 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶共同特點(diǎn)：具有糾錯(cuò)和聚合的功能（能把脫氧核糖核苷酸連續(xù)地加到雙鏈DNA鏈的3-OH末端，催化核苷酸的聚合作用）2. 堿性磷酸酶

5、特點(diǎn)：能夠催化核算分子脫掉5-p基團(tuán)，從而使DNA（或RNA）片段的5-p末端轉(zhuǎn)換成5-OH末端使用：為了防止線性化的載體分子發(fā)生自我連接，移去5-p基團(tuán)3. 反轉(zhuǎn)錄酶第四章 第一節(jié) 分子克隆載體的特點(diǎn)一、 【基因克隆載體】：在基因工程操作中，把能攜帶外源DNA進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA分子叫做載體1. 克隆載體的DNA分子必須具備的條件：（未完）l 在宿主細(xì)胞內(nèi)能獨(dú)立復(fù)制l 有選擇性標(biāo)記l 有一段多克隆位點(diǎn)，外源DNA插入其中不影響載體的復(fù)制l 分子量小，拷貝數(shù)多l(xiāng) 容易在宿主細(xì)胞中分離純化二、 質(zhì)?？寺≥d體1. 【質(zhì)粒】：是獨(dú)立于染色體以外的能自主復(fù)制的雙鏈閉合環(huán)狀DNA分子。存在于細(xì)菌、霉菌、

6、；藍(lán)藻、酵母等細(xì)胞中2. 【質(zhì)粒的不親和性】：3. 構(gòu)建質(zhì)?？寺≥d體的基本策略（1） 能在轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞中進(jìn)行有效的復(fù)制，希望在受體細(xì)胞中有較多的拷貝數(shù)（2） 必須含有允許多源DNA片段克隆位點(diǎn)（3） 必須含有供選擇克隆子的標(biāo)記基因（4） 克隆載體質(zhì)粒分子盡可能小（5） 根據(jù)特殊需要，使構(gòu)建的質(zhì)粒載體中組裝各種：元件“例如：PBR322質(zhì)粒構(gòu)建步驟（1） 在體內(nèi)將R1drd19質(zhì)粒易位子Tn3易位到pMB3（2） 縮小pMB3體積，并保留其復(fù)制起點(diǎn)：用EcoRI消化pMB3，成為pMB8，pMB8失去了對(duì)amp基因（3） 將帶有抗藥性的DNA片段導(dǎo)入pMB8，EcoRI切割pSC101，然后同

7、pMB8連接形成pMB94. 【pUC質(zhì)粒載體】：是在pBR322質(zhì)粒載體的基礎(chǔ)上，組入了一個(gè)在其5-端帶有一段多克隆位點(diǎn)的lacZ基因，而發(fā)展成為具有雙功能檢測(cè)特性的信箱質(zhì)粒載體系列第二節(jié) 病毒（噬菌體）克隆片段1. 噬菌體載體1) 性質(zhì)：噬菌體是由DNA和外殼蛋白組成，是溫和噬菌體，長(zhǎng)度約為48000bp，有61個(gè)基因，DNA上有56種內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)2) 選用噬菌體作為構(gòu)建克隆載體的依據(jù)：l 噬菌體是一種溫和噬菌體l 能承載較大外源DNA片段，DNA上有20Kb區(qū)域?qū)κ删w的生長(zhǎng)不是絕對(duì)需要的l 在DNA上有許多內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)3) 構(gòu)建噬菌體克隆載體的基本策略a) 用內(nèi)切酶切去DNA上的非

8、必需區(qū)（用EcoRI部分切割DNA；用點(diǎn)突變或甲基化酶處理，使必需區(qū)酶的EcoRI識(shí)別位點(diǎn)失效b) 在DNA的必需區(qū)內(nèi)組入選擇性標(biāo)記基因c) 構(gòu)建重組DNA分子體外包裝系統(tǒng)2. 柯斯質(zhì)粒（cosmid載體，粘性載體）1) 特征：是一種4-6kb的環(huán)形雙鏈DNA，具有DNA的cos序列和控制包裝的序列2) 優(yōu)點(diǎn)：a) 具有質(zhì)粒載體的特性（具有pBR322質(zhì)粒的復(fù)制子、抗藥性基因和幾個(gè)限制性酶的單一位點(diǎn)；有抗菌素抗性基因，和插入失活的克隆位點(diǎn)，便于選擇）b) 高容量的克隆能力（45kb）：兼有了噬菌體載體和pBR322質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)第五章 一、 目的基因制備方法（四種大方法，物理化學(xué)法中的三個(gè)方法

9、原理不用背，其余的原理要記，四種方法使用情況）1. 直接分離法（1） 內(nèi)切酶酶切分離法（2） 基因分離的物理化學(xué)法A. 密度梯度離心法B. 單鏈酶解法C. 分子雜交法（3） 雙抗體免疫法分離編碼蛋白基因（4） 利用酶促反轉(zhuǎn)錄法直接從特定mRNA分離基因2. 構(gòu)建基因組文庫(kù)分離法（1） 【基因文庫(kù)】：某一種生物群體中的全部基因（2） 【cDNA文庫(kù)的構(gòu)建】A. cDNA：以mRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄出的DNAB. cDNA文庫(kù)：利用某種生物的總mRNA合成cDNA，再將這些cDNA與載體連接，轉(zhuǎn)入細(xì)菌細(xì)胞中進(jìn)行繁殖、保存和擴(kuò)增，稱(chēng)cDNA文庫(kù)C. 構(gòu)建cDNA文庫(kù)的一般步驟：a) 總RNA提取和mRN

10、A的分離純化b) cDNA的合成和克隆c) cDNA與載體連接d) 噬菌體的包裝、轉(zhuǎn)染及質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化l 兩種文庫(kù)的區(qū)別3. 利用PCR反應(yīng)擴(kuò)增目的基因4. 基因的化學(xué)合成：磷酸二酯法、磷酸三酯法、亞磷酸三酯法、固相合成法和自動(dòng)化合成法【名詞解釋】基因克?。褐赴承┨囟ɑ蚧駾NA片段的克隆基因文庫(kù)中包含著為數(shù)眾多的克隆，建成后可供隨時(shí)選取其中任何一個(gè)基因克隆之用二、 從基因文庫(kù)中篩選目的基因1 目的基因的功能克?。?） 根據(jù)特異蛋白分離目的基因原理：（2） 功能互補(bǔ)克隆法原理：利用被克隆DNA片段與宿主細(xì)胞染色體在功能上有同源互補(bǔ)性來(lái)進(jìn)行目的基因分離2 序列克隆法（1） 根據(jù)已知基因序列

11、或同源基因序列分離目的基因原理：（核酸探針進(jìn)行雜交篩選）從GenBank中查找有關(guān)基因序列，用該序列做探針篩選基因克隆第六章 PCR技術(shù)1. PCR技術(shù)基本原理（1） 【DNA變性】：雙鏈DNA在受熱后，配對(duì)堿基的氫鍵斷裂，DNA兩條鏈分開(kāi)成為單鏈。這些單鏈正好成為復(fù)制新的DNA模板（2） 【DNA復(fù)性】：人工合成的單鏈DNA小片段的堿基順序分別與所要擴(kuò)增的DNA雙鏈的5端相同，因而能與模板DNA復(fù)性成小段雙鏈，充當(dāng)體內(nèi)DNA復(fù)制時(shí)的引物（類(lèi)似體內(nèi)復(fù)制過(guò)程中的RNA引物）（3） 【DNA延伸】：DNA聚合酶按堿基配對(duì)原則在模板上延伸DNA鏈 ，類(lèi)似體內(nèi)的DNA的前導(dǎo)鏈復(fù)制（4） 新一輪循環(huán)開(kāi)始

12、：變性復(fù)性延伸（5） 循環(huán)的反復(fù)l 理論上25-30次循環(huán)就可以合成2的25-30次方l 循環(huán)原因，溫度，目的，結(jié)果2. 影響PCR因素（1） Taq DNA聚合酶A. 熱穩(wěn)定性：耐高溫，適合在PCR過(guò)程中的反復(fù)高溫變性要求（2） 引物（3） 模板：純度、模板量（4） dNTP：02mmol/L，濃度過(guò)高會(huì)抑制TaqDNA聚合酶的活性并增加錯(cuò)配率（5） Mg2+的濃度：1.5mmol/L的MgCl23. PCR中容易出現(xiàn)的問(wèn)題以及解決辦法（1） 假陽(yáng)性：不應(yīng)出現(xiàn)而出現(xiàn)A 原因：樣品污染、擴(kuò)增試劑污染、擴(kuò)增產(chǎn)物交叉污染B 解決辦法：隔離工作區(qū)、改進(jìn)操作、避免試劑污染（2） 假陰性：該出現(xiàn)不出現(xiàn)A

13、 原因：DNA樣品中含有Taq酶抑制劑、DNA樣品中含有重金屬等B 解決辦法：第七章 目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞第一節(jié) 受體細(xì)胞以及重組體分子導(dǎo)入受體細(xì)胞1. 受體細(xì)胞2. 受體細(xì)胞選擇原則（九個(gè)，未完）（1） 便于重組DNA分子導(dǎo)入（2） 能是重組DNA分子穩(wěn)定存在于細(xì)胞中（3） 便于重組體的篩選（4） 遺傳穩(wěn)定性高，易于擴(kuò)大培養(yǎng)或發(fā)酵生長(zhǎng)（5） 安全性高、無(wú)致病性3. 重組質(zhì)粒DNA分子轉(zhuǎn)化大腸桿菌轉(zhuǎn)化：重組質(zhì)粒DNA分子通過(guò)與膜蛋白結(jié)合進(jìn)入受體細(xì)胞，并在受體細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定維持和表達(dá)的過(guò)程4. 重組DNA分子轉(zhuǎn)入真核細(xì)胞（1） 重組DNA分子導(dǎo)入植物細(xì)胞A 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化法B DNA直接轉(zhuǎn)移法：（一句話簡(jiǎn)述原理）多聚物介導(dǎo)法：聚乙二醇等可以試細(xì)胞膜間接觸粘連、電荷紊亂、有利于細(xì)胞膜間融合和外源DNA進(jìn)入顯微注射法：電穿孔法：激光微束穿孔法：激光束引起細(xì)胞膜可逆性穿孔脂質(zhì)體介導(dǎo)