基因工程實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)2009版

1、廣東省高等教育廳核心實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)代生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)教材基因工程實(shí)驗(yàn)地圖(本科教材)華南農(nóng)業(yè)大學(xué)現(xiàn)代生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室基因工程實(shí)驗(yàn)丟失2009年4月編輯的話本實(shí)驗(yàn)圖是為廣東省高校廳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室之一“現(xiàn)代生命技術(shù)研究所”開設(shè)的“基因工程原理和方法”而編寫的。本課程主要面向廣州石牌地區(qū)6所高校的研究生，還包括部分高年級(jí)本科生。本課程以實(shí)驗(yàn)為主，要求所有學(xué)員提前完成“分子生物學(xué)”或“分子遺傳學(xué)”，以便學(xué)生在選修本課程時(shí)有較好的理論基礎(chǔ)。本課程實(shí)驗(yàn)采用了一致的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(用質(zhì)粒載體克隆植物DNA片段)，學(xué)生掌握了DNA體外重組的基本技術(shù)訓(xùn)練(實(shí)驗(yàn)1-7)。另外，根據(jù)本研究室多年的教育研究經(jīng)驗(yàn)，我們將近年來遺傳工程

2、技術(shù)發(fā)展的PCR、Southern雜交技術(shù)等納入實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，確保學(xué)生完成本課程后能更快地開展相應(yīng)的研究工作，更好地適應(yīng)今后研究工作的需要。(莎士比亞，北境外)。本實(shí)驗(yàn)地圖由張楚雄、穆紅、李繼才、姚下午安、吳虎、將軍宇、劉耀光、梅萬通等教師參與編寫，李繼才老師負(fù)責(zé)指導(dǎo)書的編輯等。本實(shí)驗(yàn)地圖是考試用的第三版，考試后將根據(jù)各學(xué)校的選課過程和要求做進(jìn)一步修改。請(qǐng)兄弟大學(xué)的同行們多多提出寶貴的意見。(David aser，Northern Exposure)編輯2005年2月目錄基因工程實(shí)驗(yàn)室學(xué)生代碼3實(shí)驗(yàn)堿分解法提取質(zhì)粒DNA 4實(shí)驗(yàn)瓊脂糖凝膠電泳7實(shí)驗(yàn)3 DNA酶9實(shí)驗(yàn)4目的片段回收11實(shí)驗(yàn)5 DNA

3、體外連接12實(shí)驗(yàn)6重組DNA的轉(zhuǎn)基因15實(shí)驗(yàn)7重組變壓器的快速鑒定18實(shí)驗(yàn)八聚酶鏈反應(yīng)(PCR) 19附錄一.各種試劑的母液公式28附錄二。常用實(shí)驗(yàn)設(shè)備的清洗方法31主要參考書32基因工程實(shí)驗(yàn)室學(xué)生守則1.實(shí)驗(yàn)課前必須預(yù)習(xí)實(shí)驗(yàn)地圖，了解實(shí)驗(yàn)原理和基本操作過程。實(shí)驗(yàn)課無緣無故缺席、遲到或早退渡邊杏。鄭智薰時(shí)間表上規(guī)定的實(shí)驗(yàn)時(shí)間要按照林老師的安排及時(shí)操作。3.實(shí)驗(yàn)課要自覺遵守課堂紀(jì)律，保持實(shí)驗(yàn)室安靜清潔的衛(wèi)生，渡邊杏大聲談笑，吸煙，隨地亂扔紙屑，吐痰，渡邊杏。4.實(shí)驗(yàn)前要檢查儀器、工具、試劑，實(shí)驗(yàn)臺(tái)隨時(shí)要整齊、儀器、藥品擺放整齊。公用試劑用完了，必須立即蓋上蓋子，放回原處。試劑，不要把藥品灑在實(shí)驗(yàn)

4、臺(tái)和地板上。5.在實(shí)驗(yàn)中要嚴(yán)格遵守操作規(guī)程進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，細(xì)心觀察實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，如實(shí)記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。每次實(shí)驗(yàn)完成后，都要寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告。6.實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，要好好清潔當(dāng)天使用的器皿和工具，整理儀器和實(shí)驗(yàn)臺(tái)，然后經(jīng)過林和教師的同意離開。7.使用儀器、藥品、試劑及各種其他物品時(shí)要注意節(jié)約。洗滌和使用機(jī)器時(shí)要小心，以免損壞機(jī)器。8.廢液倒入水槽，同時(shí)噴出水，噴出江珊、強(qiáng)堿等腐蝕性液體，先用水稀釋，然后倒入水槽，讓水流出。廢紙等其他固體廢棄物應(yīng)倒進(jìn)水槽渡邊杏，倒進(jìn)垃圾桶。9.嚴(yán)禁擅自使用非當(dāng)日實(shí)驗(yàn)所需的儀器和物品，使用儀器要嚴(yán)格按照儀器使用的程序進(jìn)行，貴重儀器要在林老師的指導(dǎo)下操作。實(shí)驗(yàn)過程中機(jī)器出了故障，要立即向林和老

5、師報(bào)告情況。例如，違反使用規(guī)定造成的損失，用戶負(fù)責(zé)維修和賠償。10.每一個(gè)實(shí)驗(yàn)課，任課教師輪流值班，值班生當(dāng)天負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)室的衛(wèi)生、安全、所有服務(wù)工作，最后關(guān)閉水電、門窗，經(jīng)過林課教師的檢查同意后才能離開。實(shí)驗(yàn)堿分解法提取質(zhì)粒DNA一、目的學(xué)習(xí)和掌握基因工程操作技術(shù)中最常用的載體質(zhì)粒DNA提取方法。二、原則質(zhì)粒DNA提取一般使用堿分解法、煮沸法、SDS法、三唑酮-溶菌酶法等，其中堿分解法最常用。該方法具有質(zhì)粒DNA產(chǎn)量高、速度快等優(yōu)點(diǎn)。其原理是，在：堿性溶液中，雙鏈DNA氫鍵斷裂，DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)被破壞，產(chǎn)生變性，但質(zhì)粒DNA分子量相對(duì)較小，環(huán)狀超螺旋結(jié)構(gòu)導(dǎo)致兩個(gè)互補(bǔ)鏈在高堿性pH條件下也沒有完全

6、分離，如果放入中和液，變性質(zhì)粒DNA就會(huì)恢復(fù)到原來的配置。線性大分子質(zhì)量細(xì)菌染色體DNA沒有報(bào)復(fù)性，形成細(xì)胞片段、蛋白質(zhì)、SDS等不溶性復(fù)合物。通過離心沉積可以去除細(xì)胞碎片、染色體DNA和大部分蛋白質(zhì)等，質(zhì)粒DNA和小分子量的RNA留在上清液中?；祀s的RNA可以用RNA酶(RNaseA)去除。用苯酚/氯仿處理，可以去除殘留蛋白質(zhì)。三、實(shí)驗(yàn)材料含有質(zhì)粒pBluescript II的大腸桿菌BH10B。四、設(shè)備和設(shè)備高壓滅菌鍋初順工作臺(tái)恒溫晃動(dòng)。臺(tái)式離心機(jī)(制冷或鄭智薰董潔)渦流振蕩器五、實(shí)驗(yàn)工具培養(yǎng)用試管測量桶冰盒幾根微量離心管微量拔出器吸管。六、試劑(準(zhǔn)備方法見附錄)LB培養(yǎng)基氨芐西林(Amp

7、，100 mg/ml) 20% SDS溶液I溶液II(目前最好使用)；溶液III(-20預(yù)冷)4 N NaOH 3 M NaAc(pH5.2)無水乙醇TE緩沖區(qū)(pH 8.0) RNase A(10 mg/ml) 70%乙醇飽和苯酚/氯仿/異丙醇(2533602433:1，注：本實(shí)驗(yàn)指南的其他章節(jié)省略為苯酚/氯仿，“氯仿是指增加了1/24體積的異丙醇”。）七、實(shí)驗(yàn)階段1.細(xì)菌培養(yǎng)(1)準(zhǔn)備LB液體和瓊脂培養(yǎng)基，進(jìn)行高壓滅菌。(2)在含有Amp 100 mg/ml的瓊脂培養(yǎng)基板(下劃線或涂布)上培養(yǎng)單菌落(37 C，1820小時(shí))。(3)將含有Amp 100 mg/ml的LB液體培養(yǎng)基(45 m

8、l/管)放入培養(yǎng)基中，將單體放入培養(yǎng)基中。把培養(yǎng)管斜插在搖床上，搖晃37，過夜(約200 rpm，1416小時(shí)，通常不超過18小時(shí))。需要大量提取的情況下，選擇單細(xì)胞，連接到裝有50MLB培養(yǎng)基的三角瓶，在37時(shí)搖晃18小時(shí)。質(zhì)粒DNA提取(如果使用制冷離心機(jī)，請(qǐng)?jiān)O(shè)置為4 預(yù)冷)將1.5毫升菌液吸入1.5毫升離心管。離心(5000 rpm，2分鐘)，放棄清液。如果你想再提取一些DNA，就把1.5毫升的菌液扔出同一個(gè)離心管，離心力，清液。用移動(dòng)器盡量去除清液。加入150毫升溶液I，用旋流振蕩器充分釋放菌體。加入250毫升溶液II，慢慢上下翻轉(zhuǎn)離心管，輕輕攪拌10多次。室溫下放置5分鐘。加入180

9、 ml預(yù)冷溶液III，上下翻轉(zhuǎn)離心管。10多次，輕輕混合。冰浴在10分鐘，或-20冰箱里放5分鐘左右(不要凍得太久)。離心(12000 rpm，5分鐘，4C)。(離心后，將離心機(jī)溫度設(shè)定為20 。）去除上清液。2/3倍苯酚/氯仿萃取，離心(12000 rpm，5分鐘)。去除上清液(約500 550毫升)，2倍體積的無水乙醇(大量提取時(shí)上清液的容量大，以0.6倍體積代替乙醇，混合異丙醇)。離心(12000 rpm，5分鐘，室溫)，倒入酒精。離心力在幾秒鐘內(nèi)用移動(dòng)器盡可能地除去酒精。用0.5毫升70%酒精沉淀一次DNA，在離心2分鐘內(nèi)倒入酒精。離心力幾秒，用移動(dòng)器盡可能地除去酒精，干燥10分鐘。添

10、加50100 ml TE(含20 mg/ml RNaseA)溶解DNA沉淀。37C放置幾個(gè)小時(shí)，-20C保存?zhèn)浼?。高輻射質(zhì)粒DNA的產(chǎn)量一般為3-5mg/ml菌液。這種DNA可以直接用于限制性內(nèi)切酶切等反應(yīng)。如果需要更高純度的DNA，可以進(jìn)一步純化。質(zhì)粒DNA的進(jìn)一步純化添加TE使DNA溶液達(dá)到100毫升，加入100毫升苯酚/氯仿，充分振動(dòng)。離心(12000 rpm，5分鐘)，吸收上清液。加入1/10體積的3 M NaAc，加入體積的預(yù)冷絕對(duì)乙醇2倍混合。在-70oC冰箱里放大約10分鐘以上，或者在-20oC冰箱里放30分鐘到幾小時(shí)左右。離心力(12000 rpm，15分鐘，4oC)，倒入酒精

11、，離心力幾秒鐘，用移動(dòng)器最大限度地去除酒精。用0.5毫升70%酒精沉淀一次DNA，在離心2分鐘內(nèi)倒入酒精。離心力在幾秒鐘內(nèi)用移動(dòng)器盡可能地除去酒精并干燥。添加50100 ml TE溶解DNA沉淀。(大量提取質(zhì)粒DNA，溶液I，II，III的使用量可能會(huì)相應(yīng)增加。例如，如果培養(yǎng)液為50毫升，則溶液I、II、III的用量分別為2.0毫升、4.0毫升和3.0毫升。）用這種實(shí)驗(yàn)方法提取和純化的質(zhì)粒DNA純度只能滿足一般目的的要求。如果純度高(例如用作復(fù)制載體和排序的模板)，建議使用制造商提供的質(zhì)粒純化套件進(jìn)行提取。八、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)1.高壓消毒要由專人管理，壓力為0.5磅時(shí)拔掉電源插頭，加熱到1.0磅，

12、保持20分鐘(通過，切斷開關(guān)控制)。2.使用滅菌工作臺(tái)前，請(qǐng)打開紫外線燈消毒，打開紫外線燈時(shí)不要打開北風(fēng)裝置。3.抗菌藥物不能使用高溫滅菌。培養(yǎng)基滅菌后要降溫，直到?jīng)]有熱孫怡。4.為了避免細(xì)菌污染環(huán)境，額外的菌液煮殺后再倒入水槽。5.加入溶液II，溶液III，攪拌好的時(shí)候一定要柔軟，劇烈攪拌渡邊杏。6.在苯酚/氯仿萃取后吸清液時(shí)，要注意不要吸入下層苯酚/氯仿。但是不要留下太多的上清液，讓DNA損失更多。(本杰明富蘭克林，DNA名言)九、實(shí)驗(yàn)日程1.第一天下午準(zhǔn)備液體和瓊脂培養(yǎng)基。(5:30)在瓊脂培養(yǎng)基板上劃線，熬夜培養(yǎng)短桿菌生長。2.第二天下午(5336030)，選擇單細(xì)胞乳酸菌，通宵培養(yǎng)。

13、3.上午停止培養(yǎng)9:00左右，在室溫或4下保管。下午提取質(zhì)粒(純化在實(shí)驗(yàn)2電泳過程中進(jìn)行)。實(shí)驗(yàn)瓊脂糖凝膠電泳一、目的學(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳分離DNA的原理和方法，檢測質(zhì)粒DNA的純度、濃度和分子量。二、原則瓊脂糖是溶解在沸水中的天然聚合長鏈分子，45開始形成多孔剛性過濾孔，凝膠孔徑的大小由瓊脂糖的濃度決定。DNA分子在堿性環(huán)境中帶負(fù)電荷，加上電場作用，向兩極游泳。DNA分子在瓊脂糖凝膠中游泳時(shí)有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。根據(jù)DNA，分子量的大小和構(gòu)成不同，電泳的游泳率不同，分成不同的樂隊(duì)。瓊脂糖凝膠電泳分離DNA主要利用分子體效應(yīng)，移動(dòng)速度與分子量的大數(shù)值成反比。溴化B (EB)是扁平的分子，在紫外

14、線中發(fā)出熒光。EB可以與DNA分子形成EB-DNA復(fù)合物，其釋放的熒光強(qiáng)度比自由狀態(tài)EB釋放的熒光強(qiáng)度大10倍以上，熒光強(qiáng)度與DNA含量成正比。用肉眼觀察，可以檢測5 ng以上的DNA。質(zhì)粒DNA有三種結(jié)構(gòu)，環(huán)狀的超螺旋、開環(huán)和線性，移動(dòng)速率因電泳而異(超螺旋線性開環(huán))。三、實(shí)驗(yàn)材料上次實(shí)驗(yàn)提取的質(zhì)粒DNA。四、實(shí)驗(yàn)設(shè)備微波電泳微電泳槽紫外透射檢測儀五、實(shí)驗(yàn)工具微量萃取器吸管頭幾個(gè)附加模板。兩桶100 ml1三角瓶500 ml1透明膠帶六、試劑(準(zhǔn)備方法見附錄)每個(gè)陣地10TBE電泳緩沖液10再型緩沖液EB母液(0.5MG/ML) DNA (HIND )七、實(shí)驗(yàn)階段1.制作膠水(1)將0.8 g瓊脂糖放入包含100 ml 1TBE電泳緩沖液的500 ml三角瓶中，搖晃得很好，用電子秤測量三角瓶的總重量。在微波爐或電爐中加熱至瓊脂糖完全融化，在天平上加入蒸餾水，添加到原來的重量。冷卻到