熒光定量PCR原理及操作步驟_第1頁
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文檔簡介

熒光定量PCRreal time-PCR,定量PCR反應體系,定量與常規(guī)PCR的差別,常規(guī)PCR技術： 對PCR擴增反應的終產(chǎn)物進行定量及定性分析,定量PCR技術： 通過對PCR擴增反應中每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實時檢測從而實現(xiàn)對起始模板定量及定性的分析,三個關鍵詞： 實時，定量，熒光,PCR分四個階段,如何定量？,Ct值的概念 Ct值的定義是PCR擴增過程中，熒光信號開始由本底進入指數(shù)增長階段的閾值所對應的循環(huán)次數(shù)。,定量原理,確定初始模板的濃度,初始 DNA量越多, 熒光達到某一值（域值）時所需要的循環(huán)數(shù)越少 Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關系，根據(jù)樣品擴增達到域值的循環(huán)數(shù)就可計算出樣品中所含的模板量,起點定量與終點定量,熒光化學,SYBR Green 1,TaqMan,TaqMan,SYBR Green I 工作原理,。 SYBR Green 1 結合到雙鏈DNA的小溝部位 SYBR Green 1 染料只有和雙鏈DNA結合后才發(fā)熒光,未結合SYBR Green 1 dye,變性: 無熒光信號,SYBR Green I 應用范圍,起始模板濃度定量 融解曲線分析 -可區(qū)分單一產(chǎn)物、變異產(chǎn)物、多種產(chǎn)物和（或）引物二聚體 基因型分析,SYBR Green I 優(yōu)點,SYBR Green I 缺點,PCR程序指南,UNG酶使用原理,金牌Tag酶活性,參比熒光：管家熒光R

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