植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)及有用物質(zhì)生產(chǎn)(PPT 63頁).ppt

1、植物細(xì)胞球的大規(guī)模培養(yǎng)和有用物質(zhì)生產(chǎn)(1)，概括(2)，植物細(xì)胞球規(guī)?；囵B(yǎng)系統(tǒng)的建構(gòu)(3)，利用細(xì)胞球培養(yǎng)生產(chǎn)有用物質(zhì)，植物次級(jí)代謝產(chǎn)物：植物中的一個(gè)不是植物生長發(fā)育所需的小分子有機(jī)化合物，其發(fā)生和分布通常為屬，包括器官組織和生長發(fā)育期的專一性。 植物中二次產(chǎn)物的合成和分解過程稱為次級(jí)代謝。 (1)、概要、植物產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的類型大致可分為分子結(jié)構(gòu)：酚類化合物：類黃酮類醌類(苯醌、萘醌、蒽醌)萜類化合物：三萜類化合物皂角苷； 甾類化合物皂角苷； 單萜烯、倍半萜、二萜類化合物含氮化合物：生物堿； 胺類(一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)、四級(jí)胺)的非蛋白氨基酸能產(chǎn)生氰乙炔類、有機(jī)酸，植物次級(jí)代謝產(chǎn)物在壓電石英藥、

2、食品、輕化工業(yè)等領(lǐng)域具有重要意義。 李時(shí)珍列入本草綱目的1892種藥物大部分是植物藥物，現(xiàn)在約25種法定藥物來源于植物。 其藥物的有效成分均為副產(chǎn)物。 許多植物次級(jí)代謝產(chǎn)物是優(yōu)良的食品添加劑和珍貴的化妝品原料。 部分是生物毒素的主要來源，可用于殺蟲、殺菌，但對(duì)環(huán)境和人畜無害是理想的環(huán)保產(chǎn)品。自然植物和細(xì)胞球培養(yǎng)的紫草寧含量比較生產(chǎn)方式生產(chǎn)周期紫草寧含量(干重)完全植物23年12植物細(xì)胞培養(yǎng)3周14植物次級(jí)代謝產(chǎn)品的市場(chǎng)潛在能力產(chǎn)品成分用途年銷售額(億美元)長春花堿治療白血病1820 (美國)奎寧治療瘧疾510 (美國) 熱致殺蟲劑20 (全球)地黃心臟病藥2055 (美國)、植物細(xì)胞球大規(guī)模培

3、養(yǎng)的技術(shù)要求：從工程細(xì)胞球的生長和培養(yǎng)技術(shù)方面來看，為了得到產(chǎn)量一定的產(chǎn)物，1、培養(yǎng)的細(xì)胞球必須滿足3個(gè)條件：遺傳穩(wěn)定。 2、細(xì)胞球生長和生物合成速度快，可在短時(shí)間內(nèi)得到高產(chǎn)的最終產(chǎn)物。 3 .代謝產(chǎn)物最好能儲(chǔ)存在細(xì)胞球中，釋放到培養(yǎng)基中，以免迅速分解。 (二)、植物細(xì)胞球規(guī)?；囵B(yǎng)系統(tǒng)的建構(gòu)1、種子細(xì)胞球的選擇(1)正確選擇可產(chǎn)生目的化合物的植物種類(2)盡可能選擇自然狀態(tài)下可產(chǎn)生天然產(chǎn)物的組織器官作為外植體(3)高產(chǎn)種子細(xì)胞克隆的方法：單細(xì)胞球培養(yǎng)后，對(duì)單細(xì)胞擴(kuò)增產(chǎn)生的愈傷組織進(jìn)行2份、一份成分含量分析，另一份保留培養(yǎng)。 2、種子細(xì)胞系增殖和擴(kuò)大培養(yǎng)種子細(xì)胞球增殖初期一般采用搖瓶培養(yǎng)，搖瓶

4、體積從數(shù)百毫升逐漸擴(kuò)大到數(shù)公升。 如果細(xì)胞球數(shù)增加到一定值，則轉(zhuǎn)移到體積小的生物反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)。 3、大規(guī)模培養(yǎng)系統(tǒng)的建構(gòu)(1)統(tǒng)一培養(yǎng)：在一個(gè)培養(yǎng)體積中接種細(xì)胞球或添加培養(yǎng)基后，中途不更換培養(yǎng)基的方式。 (2)連續(xù)培養(yǎng)：在培養(yǎng)過程中，不斷在反應(yīng)器中以一定產(chǎn)水量添加新培養(yǎng)基，并以一定產(chǎn)水量從系統(tǒng)中提取培養(yǎng)基的方式。 (3)半連續(xù)培養(yǎng)：批量培養(yǎng)一個(gè)周期結(jié)束后，從反應(yīng)器中取出大部分細(xì)胞球混懸劑，僅保留小部分細(xì)胞球混懸劑作為下一個(gè)培養(yǎng)周期的種子細(xì)胞球，然后加入新鮮培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)的方式。 (3)生物反應(yīng)器的類型和特征大規(guī)模培養(yǎng)系統(tǒng)的基本原理方法與上述實(shí)驗(yàn)室懸浮培養(yǎng)相一致，但大規(guī)模培養(yǎng)采用的設(shè)備和控制

5、技術(shù)比實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模培養(yǎng)復(fù)雜得多。 植物細(xì)胞培養(yǎng)具有周期長、細(xì)胞球抗剪能力弱、易凝聚等特點(diǎn)。 在云同步，植物細(xì)胞球規(guī)模培養(yǎng)的目的是生產(chǎn)天然產(chǎn)物，因此必須考慮修訂植物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器不僅有利于細(xì)胞球的生長，也有利于產(chǎn)物的積累和分離?？傮w而言，適于植物細(xì)胞培養(yǎng)的反應(yīng)器應(yīng)具有適宜的氧傳遞、良好的流變性和低剪切力。 機(jī)械攪拌式培養(yǎng)系統(tǒng)機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器通常根據(jù)微生物發(fā)酵槽改良設(shè)定，根據(jù)植物細(xì)胞球的特性，根據(jù)微生物發(fā)酵槽化學(xué)基，攪拌裝置減少剪切，一般將葉輪式變更為螺旋式，植物細(xì)胞的生長周期長，需要隨時(shí)補(bǔ)充水分和營養(yǎng)， 由于需要安裝修訂加液裝置的植物細(xì)胞球的大姨媽活動(dòng)需要新鮮空氣，細(xì)胞球代謝也可能產(chǎn)生有害瓦

6、斯氣體，因此為了便于安裝修訂通氣裝置的采樣觀察，還設(shè)置了采樣通訊端口。 生物反應(yīng)器、Stirred Tank Bioreactors、 anexternalmotorisusedtoagitatethegrowthmediumwithimpellers.sterileairorcombinationsofgasescanbeintroduced (sparkling )氣壓攪拌式培養(yǎng)系統(tǒng)考慮到免不得機(jī)械攪拌式反應(yīng)器的剪切作用，攪拌機(jī)旋轉(zhuǎn)的中軸大多是容易污染培養(yǎng)物的部位，所以開發(fā)了空氣提升式生物反應(yīng)器，但存在攪拌不均勻的缺點(diǎn)。bubblecolumnbioreactor (airlift rea

7、ctor )、introductionofsterileairorpuregasesisusedbothforagitationandoxygenation、internal loop tubeplacedinsidethereactorcreatesinternalcirculationloop，外部環(huán)形airlift生物反應(yīng)器。 circulationthroughanexternalloop，旋轉(zhuǎn)式培養(yǎng)系統(tǒng)一般用于產(chǎn)品中試驗(yàn)、不分解細(xì)胞球才能得到目標(biāo)物的培養(yǎng)，其優(yōu)點(diǎn)是控制精確、處理靈活、缺點(diǎn)是培養(yǎng)體積小。 固定化培養(yǎng)系統(tǒng)這一技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是，培養(yǎng)系統(tǒng)的理化化學(xué)環(huán)境可比較容易控制、研究特定代謝

8、途徑、調(diào)節(jié)簡單的細(xì)胞球定位于植株中間的狀態(tài)，可相互緊密接觸形成一定的理化梯度， 有利于二次產(chǎn)物合成的細(xì)胞球由于固定在載體上，培養(yǎng)基可不斷交換，從培養(yǎng)基中提取產(chǎn)物，由于培養(yǎng)基中含有許多初生產(chǎn)物而免除了細(xì)胞球代謝的種子文件回歸抑制，由于細(xì)胞球殘留在反應(yīng)器中，新的培養(yǎng)基就可以再利用這些個(gè)的細(xì)胞球來生產(chǎn)初生產(chǎn)物， 因?yàn)楣?jié)省了生產(chǎn)細(xì)胞球的時(shí)間和費(fèi)用的細(xì)胞球固定在一定的介質(zhì)上，可以從培養(yǎng)基中持續(xù)提取生成物，從而可以進(jìn)行連續(xù)生產(chǎn)。 細(xì)胞球固定化培養(yǎng)技術(shù)，根據(jù)其載體可分為兩類：包埋式固定化培養(yǎng)系統(tǒng)：載體多采用瓊脂、瓊脂、藻朊酸鹽、聚酰胺等吸附式固定化培養(yǎng)系統(tǒng)：載體采用尼龍網(wǎng)、烏拉坦泡沫、中空纖維等材料。 (1

9、)利用細(xì)胞球培養(yǎng)生產(chǎn)有用物質(zhì)的一般普洱茶(1)選項(xiàng)必須注意以下條件：藥效是肯定的，對(duì)其有效成分一盞茶了解的有效成分和藥理有測(cè)定可靠方法市場(chǎng)不足，或取價(jià)格高的有藥效成分的部位，該部位是卡爾(四)細(xì)胞球培養(yǎng)生產(chǎn)有用物質(zhì)；(二)細(xì)胞球株系通過誘導(dǎo)分離愈傷組織，建構(gòu)懸浮細(xì)胞球繁殖系統(tǒng)(液體培養(yǎng))。 在工廠化生產(chǎn)中，為了提高有用物質(zhì)產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量，對(duì)細(xì)胞球培養(yǎng)的選擇有兩個(gè)基本要求：有用物質(zhì)的合成積累能力強(qiáng)，生長速度快；(3)大量培養(yǎng)是將選擇的優(yōu)良細(xì)胞球株擴(kuò)大繁殖后，作為細(xì)胞球工廠化培養(yǎng)的生產(chǎn)“種子”進(jìn)行大量培養(yǎng)。 (4)從產(chǎn)品的提取和精制植物細(xì)胞培養(yǎng)物中提取和精制的產(chǎn)品。 2、提高有用物質(zhì)生產(chǎn)效率的技

10、術(shù)因素篩選高產(chǎn)細(xì)胞系從實(shí)驗(yàn)材料中篩選高產(chǎn)細(xì)胞球株系是提高生產(chǎn)率、降低生產(chǎn)成本的重要因素。 特異的次級(jí)代謝產(chǎn)物往往形成于特異的器官之中。 因此，以特異器官為材料，建構(gòu)特異功能的細(xì)胞系，從中篩選出反復(fù)多代培養(yǎng)的有效高產(chǎn)的細(xì)胞球株。篩選的高效、高產(chǎn)細(xì)胞球株系、某些植物細(xì)胞系高效、高產(chǎn)性能多年穩(wěn)定，而某些植物細(xì)胞系不穩(wěn)定，需要定期檢測(cè)更新細(xì)胞球株系。 第一步：解決生質(zhì)能源生產(chǎn)(促進(jìn)細(xì)胞分裂)第二步：促進(jìn)次級(jí)代謝物合成，即細(xì)胞球指數(shù)增長停搏前后更換培養(yǎng)基，有利于二次生質(zhì)能源的積累。 二步培養(yǎng)法，培養(yǎng)基中添加的前驅(qū)物：有用的次級(jí)代謝物的前驅(qū)物。 在煙愈傷組織培養(yǎng)中，加入前體物質(zhì)煙酸，煙堿的生成量就會(huì)增加。

11、 培養(yǎng)基中生長調(diào)節(jié)劑的作用植物生長調(diào)節(jié)劑不僅影響植物的脫分化和再分化，還影響次級(jí)代謝物質(zhì)的產(chǎn)生。 在煙草愈傷組織培養(yǎng)中，可以在培養(yǎng)基中添加IAA來合成煙堿，但是在含有2，4-d的培養(yǎng)基中煙堿的合成受到阻礙。 培養(yǎng)條件的影響光、溫度等影響次級(jí)代謝。 胡蘿卜愈傷組織培養(yǎng)中，光照條件下紫紅愈傷組織可生成大量花節(jié)氰苷類，且低溫條件下生成量高。 采用固相細(xì)胞球培養(yǎng)系統(tǒng)細(xì)胞球生長分裂旺盛時(shí)，次級(jí)代謝物的產(chǎn)量較低。 采用固相培養(yǎng)，將細(xì)胞球培養(yǎng)為惰性基質(zhì)，細(xì)胞球生長緩慢，可提高次級(jí)代謝物質(zhì)的產(chǎn)量。思考題1好的懸浮細(xì)胞系有什么特點(diǎn)？對(duì)建構(gòu)懸浮細(xì)胞系的愈傷組織有什么要求？ 2建構(gòu)懸浮細(xì)胞系的關(guān)鍵技術(shù)是什么？ 3懸

12、浮細(xì)胞系在繼代培養(yǎng)有集體成長規(guī)律嗎？ 4細(xì)胞球大規(guī)模培養(yǎng)有哪些培養(yǎng)系統(tǒng)紫杉醇：二萜類化合物類化合物最早從太平洋紅豆杉Taxus brevifolia的樹皮中分離，廣泛用于卵巢癌、乳腺癌、非小細(xì)胞球肺癌等十多種癌的治療，目前主要來源于紅豆杉屬植物，紫杉醇簡介、理化性質(zhì)、 英文名： Paclitaxel，Taxol or TM分子式： c440 pH 8容易分解的紫杉醇可以在特定條件下氧化，但還原極為困難，紫杉醇的研究開發(fā)過程， NCI是過去15年研制的最優(yōu)秀抗癌藥物20世紀(jì)90年代抗腫瘤藥的三大成果之一湯姆森科學(xué)技術(shù)桂冠獎(jiǎng)，Ramesh Panchagnula，internationaljour

13、nalofpharmaceutics.1998 (172 ) 抗癌一線藥的銷售額，一年5億美元的理論需求量為2g /人，500萬人/年1000kg/年的實(shí)際銷售量為350 kg/年，紫杉醇的供求有相當(dāng)大的差別，圖1 :國際紫杉醇原料藥的需求動(dòng)向圖(單位： kg )，圖2 :國際紫杉醇的銷售上游產(chǎn)業(yè)藥源問題下游制劑產(chǎn)業(yè)藥效(活性、水溶性)安全性生物相容性、藥源問題， 紅豆杉主要原料植物國家一級(jí)保護(hù)野生植物世界10大瀕危種之一是生長緩慢分布的有限Taxol含量低的樹皮中的Taxol含量為：0.00001-0.069% 3000棵樹=10噸樹皮=1kg Taxol=500人的患者，人工栽培是種子繁殖

14、， 扦插等無性繁殖方法快，采用大面積人工繁殖紅豆杉幼苗尋找紅豆杉替代物，從紅豆杉非樹皮部位提取生產(chǎn)紫杉醇的非紅豆杉植物，優(yōu)點(diǎn)：生長周期縮短簡便，直接，缺點(diǎn)： 1，紫杉醇含量低生長慢2，提取工藝復(fù)雜，藥源問題解決方法(1)、 藥源問題解決化學(xué)合成全合成1994年成功的目前6個(gè)途徑半合成是以10-DAB和Baccatin為半合成原料得到紫杉醇的新方法采用10-DAT，缺點(diǎn)： 1，合成過程復(fù)雜，幾十步2，費(fèi)用高，化學(xué)制劑昂貴，總收率過低(2% )。 充分利用再生資源2，生產(chǎn)效率高，具有最實(shí)用的價(jià)值，可以進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)，取得紫杉醇的結(jié)構(gòu)效果關(guān)系信息，可以進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，缺點(diǎn)：合成過程相對(duì)復(fù)雜(11階段化學(xué)

15、轉(zhuǎn)化和7階段分離)，藥源問題解決方法(3)、 生物方法組織和細(xì)胞球培養(yǎng)微生物發(fā)酵生物合成研究階段的紅豆杉生物合成路線基本上有10種相關(guān)酶催化劑基因愛沙尼亞克朗表達(dá)，利用基因工程手段改造紅豆杉，有利于提高紫杉醇產(chǎn)量的分離純化4，低成本，生長周期短5，為半合成提供原料6，有望工業(yè)化生產(chǎn)，缺點(diǎn)： 1， 產(chǎn)量低，不穩(wěn)定2，工業(yè)化擴(kuò)大研究，水溶性紫杉醇使用0.77mM/L增加溶劑差：聚氧乙烯蓖麻籽油和乙醇問題穩(wěn)定性和水溶性差(7mm )我國是中藥飲片資源最豐富的國家，有詳細(xì)記載的約5000種。 中藥飲片治療疾病的歷史長達(dá)一千年，中藥壓電石英已形成完整的科學(xué)系統(tǒng)。 植物藥效成分研究形成了“天然藥物化學(xué)”研

16、究的新領(lǐng)域。 在藥用植物中，具有藥物功能的物質(zhì)種類很多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜。 除了小分子的天然有機(jī)化合物以外，還有很多生物大分子活性物質(zhì)。 不同組方的藥用成分和功能研究是一項(xiàng)巨大的工程，相當(dāng)于染色體組和蛋白質(zhì)組研究。中藥飲片復(fù)方復(fù)雜系統(tǒng)研究(北京牌高等院校漢啟德院士)，二、植物來源藥物種類1、天然有機(jī)化合物(1)糖和氰苷類類(2)苯丙類：苯丙酸、丙酸、庫陸戰(zhàn)隊(duì)員等(3)醌類：補(bǔ)酶催化劑Q10、紫草素(。 (6)萜類：青蒿素、齊墩果酸(7)甾類化合物：牛葡萄糖苷、毛第黃毒葡萄糖苷(8)生物堿：咖啡因、喜樹鹽化學(xué)基、2、植物蛋白、多肽、酶催化劑類生理活性物質(zhì)表2-16 3，植物糖類藥物含單糖表2-17 4，植物脂質(zhì)藥物(1) 脂肪和脂肪酸類：亞油酸、亞麻油酸、花生四烯酸油脂(2)磷脂復(fù)合物類：大豆磷脂復(fù)合物(3)固醇類：豆固醇、-谷固醇。 三、植物來源藥物的植被實(shí)例1、植物SOD 2、植酸鈣元素鎂和肌醇3、植物不飽和脂肪酸4、植物來源藥物的研究前景1、植物細(xì)胞培養(yǎng)2、植物組織培養(yǎng)3、有效成分的分離、純化、結(jié)構(gòu)和功能測(cè)定。 3、生產(chǎn)一些有用物質(zhì)，生物堿多數(shù)生物堿已經(jīng)被用作醫(yī)藥。 嗎啡等生物堿通?？蓮镍f片中提取，用作神經(jīng)麻醉劑，利用罌粟種子愈傷組織培養(yǎng)可提取嗎啡堿及其生物堿。 氰苷類物質(zhì)利用胡籮卜愈傷組織培養(yǎng)生產(chǎn)皂角苷，進(jìn)入工廠化生產(chǎn)。 醌系物質(zhì)利用紫草