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文檔簡(jiǎn)介
1、植物細(xì)胞球的大規(guī)模培養(yǎng)和有用物質(zhì)生產(chǎn)(1),概括(2),植物細(xì)胞球規(guī)模化培養(yǎng)系統(tǒng)的建構(gòu)(3),利用細(xì)胞球培養(yǎng)生產(chǎn)有用物質(zhì),植物次級(jí)代謝產(chǎn)物:植物中的一個(gè)不是植物生長(zhǎng)發(fā)育所需的小分子有機(jī)化合物,其發(fā)生和分布通常為屬,包括器官組織和生長(zhǎng)發(fā)育期的專(zhuān)一性。 植物中二次產(chǎn)物的合成和分解過(guò)程稱(chēng)為次級(jí)代謝。 (1)、概要、植物產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的類(lèi)型大致可分為分子結(jié)構(gòu):酚類(lèi)化合物:類(lèi)黃酮類(lèi)醌類(lèi)(苯醌、萘醌、蒽醌)萜類(lèi)化合物:三萜類(lèi)化合物皂角苷; 甾類(lèi)化合物皂角苷; 單萜烯、倍半萜、二萜類(lèi)化合物含氮化合物:生物堿; 胺類(lèi)(一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)、四級(jí)胺)的非蛋白氨基酸能產(chǎn)生氰乙炔類(lèi)、有機(jī)酸,植物次級(jí)代謝產(chǎn)物在壓電石英藥、
2、食品、輕化工業(yè)等領(lǐng)域具有重要意義。 李時(shí)珍列入本草綱目的1892種藥物大部分是植物藥物,現(xiàn)在約25種法定藥物來(lái)源于植物。 其藥物的有效成分均為副產(chǎn)物。 許多植物次級(jí)代謝產(chǎn)物是優(yōu)良的食品添加劑和珍貴的化妝品原料。 部分是生物毒素的主要來(lái)源,可用于殺蟲(chóng)、殺菌,但對(duì)環(huán)境和人畜無(wú)害是理想的環(huán)保產(chǎn)品。自然植物和細(xì)胞球培養(yǎng)的紫草寧含量比較生產(chǎn)方式生產(chǎn)周期紫草寧含量(干重)完全植物23年12植物細(xì)胞培養(yǎng)3周14植物次級(jí)代謝產(chǎn)品的市場(chǎng)潛在能力產(chǎn)品成分用途年銷(xiāo)售額(億美元)長(zhǎng)春花堿治療白血病1820 (美國(guó))奎寧治療瘧疾510 (美國(guó)) 熱致殺蟲(chóng)劑20 (全球)地黃心臟病藥2055 (美國(guó))、植物細(xì)胞球大規(guī)模培
3、養(yǎng)的技術(shù)要求:從工程細(xì)胞球的生長(zhǎng)和培養(yǎng)技術(shù)方面來(lái)看,為了得到產(chǎn)量一定的產(chǎn)物,1、培養(yǎng)的細(xì)胞球必須滿(mǎn)足3個(gè)條件:遺傳穩(wěn)定。 2、細(xì)胞球生長(zhǎng)和生物合成速度快,可在短時(shí)間內(nèi)得到高產(chǎn)的最終產(chǎn)物。 3 .代謝產(chǎn)物最好能儲(chǔ)存在細(xì)胞球中,釋放到培養(yǎng)基中,以免迅速分解。 (二)、植物細(xì)胞球規(guī)?;囵B(yǎng)系統(tǒng)的建構(gòu)1、種子細(xì)胞球的選擇(1)正確選擇可產(chǎn)生目的化合物的植物種類(lèi)(2)盡可能選擇自然狀態(tài)下可產(chǎn)生天然產(chǎn)物的組織器官作為外植體(3)高產(chǎn)種子細(xì)胞克隆的方法:?jiǎn)渭?xì)胞球培養(yǎng)后,對(duì)單細(xì)胞擴(kuò)增產(chǎn)生的愈傷組織進(jìn)行2份、一份成分含量分析,另一份保留培養(yǎng)。 2、種子細(xì)胞系增殖和擴(kuò)大培養(yǎng)種子細(xì)胞球增殖初期一般采用搖瓶培養(yǎng),搖瓶
4、體積從數(shù)百毫升逐漸擴(kuò)大到數(shù)公升。 如果細(xì)胞球數(shù)增加到一定值,則轉(zhuǎn)移到體積小的生物反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)。 3、大規(guī)模培養(yǎng)系統(tǒng)的建構(gòu)(1)統(tǒng)一培養(yǎng):在一個(gè)培養(yǎng)體積中接種細(xì)胞球或添加培養(yǎng)基后,中途不更換培養(yǎng)基的方式。 (2)連續(xù)培養(yǎng):在培養(yǎng)過(guò)程中,不斷在反應(yīng)器中以一定產(chǎn)水量添加新培養(yǎng)基,并以一定產(chǎn)水量從系統(tǒng)中提取培養(yǎng)基的方式。 (3)半連續(xù)培養(yǎng):批量培養(yǎng)一個(gè)周期結(jié)束后,從反應(yīng)器中取出大部分細(xì)胞球混懸劑,僅保留小部分細(xì)胞球混懸劑作為下一個(gè)培養(yǎng)周期的種子細(xì)胞球,然后加入新鮮培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)的方式。 (3)生物反應(yīng)器的類(lèi)型和特征大規(guī)模培養(yǎng)系統(tǒng)的基本原理方法與上述實(shí)驗(yàn)室懸浮培養(yǎng)相一致,但大規(guī)模培養(yǎng)采用的設(shè)備和控制
5、技術(shù)比實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模培養(yǎng)復(fù)雜得多。 植物細(xì)胞培養(yǎng)具有周期長(zhǎng)、細(xì)胞球抗剪能力弱、易凝聚等特點(diǎn)。 在云同步,植物細(xì)胞球規(guī)模培養(yǎng)的目的是生產(chǎn)天然產(chǎn)物,因此必須考慮修訂植物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器不僅有利于細(xì)胞球的生長(zhǎng),也有利于產(chǎn)物的積累和分離??傮w而言,適于植物細(xì)胞培養(yǎng)的反應(yīng)器應(yīng)具有適宜的氧傳遞、良好的流變性和低剪切力。 機(jī)械攪拌式培養(yǎng)系統(tǒng)機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器通常根據(jù)微生物發(fā)酵槽改良設(shè)定,根據(jù)植物細(xì)胞球的特性,根據(jù)微生物發(fā)酵槽化學(xué)基,攪拌裝置減少剪切,一般將葉輪式變更為螺旋式,植物細(xì)胞的生長(zhǎng)周期長(zhǎng),需要隨時(shí)補(bǔ)充水分和營(yíng)養(yǎng), 由于需要安裝修訂加液裝置的植物細(xì)胞球的大姨媽活動(dòng)需要新鮮空氣,細(xì)胞球代謝也可能產(chǎn)生有害瓦
6、斯氣體,因此為了便于安裝修訂通氣裝置的采樣觀(guān)察,還設(shè)置了采樣通訊端口。 生物反應(yīng)器、Stirred Tank Bioreactors、 anexternalmotorisusedtoagitatethegrowthmediumwithimpellers.sterileairorcombinationsofgasescanbeintroduced (sparkling )氣壓攪拌式培養(yǎng)系統(tǒng)考慮到免不得機(jī)械攪拌式反應(yīng)器的剪切作用,攪拌機(jī)旋轉(zhuǎn)的中軸大多是容易污染培養(yǎng)物的部位,所以開(kāi)發(fā)了空氣提升式生物反應(yīng)器,但存在攪拌不均勻的缺點(diǎn)。bubblecolumnbioreactor (airlift rea
7、ctor )、introductionofsterileairorpuregasesisusedbothforagitationandoxygenation、internal loop tubeplacedinsidethereactorcreatesinternalcirculationloop,外部環(huán)形airlift生物反應(yīng)器。 circulationthroughanexternalloop,旋轉(zhuǎn)式培養(yǎng)系統(tǒng)一般用于產(chǎn)品中試驗(yàn)、不分解細(xì)胞球才能得到目標(biāo)物的培養(yǎng),其優(yōu)點(diǎn)是控制精確、處理靈活、缺點(diǎn)是培養(yǎng)體積小。 固定化培養(yǎng)系統(tǒng)這一技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是,培養(yǎng)系統(tǒng)的理化化學(xué)環(huán)境可比較容易控制、研究特定代謝
8、途徑、調(diào)節(jié)簡(jiǎn)單的細(xì)胞球定位于植株中間的狀態(tài),可相互緊密接觸形成一定的理化梯度, 有利于二次產(chǎn)物合成的細(xì)胞球由于固定在載體上,培養(yǎng)基可不斷交換,從培養(yǎng)基中提取產(chǎn)物,由于培養(yǎng)基中含有許多初生產(chǎn)物而免除了細(xì)胞球代謝的種子文件回歸抑制,由于細(xì)胞球殘留在反應(yīng)器中,新的培養(yǎng)基就可以再利用這些個(gè)的細(xì)胞球來(lái)生產(chǎn)初生產(chǎn)物, 因?yàn)楣?jié)省了生產(chǎn)細(xì)胞球的時(shí)間和費(fèi)用的細(xì)胞球固定在一定的介質(zhì)上,可以從培養(yǎng)基中持續(xù)提取生成物,從而可以進(jìn)行連續(xù)生產(chǎn)。 細(xì)胞球固定化培養(yǎng)技術(shù),根據(jù)其載體可分為兩類(lèi):包埋式固定化培養(yǎng)系統(tǒng):載體多采用瓊脂、瓊脂、藻朊酸鹽、聚酰胺等吸附式固定化培養(yǎng)系統(tǒng):載體采用尼龍網(wǎng)、烏拉坦泡沫、中空纖維等材料。 (1
9、)利用細(xì)胞球培養(yǎng)生產(chǎn)有用物質(zhì)的一般普洱茶(1)選項(xiàng)必須注意以下條件:藥效是肯定的,對(duì)其有效成分一盞茶了解的有效成分和藥理有測(cè)定可靠方法市場(chǎng)不足,或取價(jià)格高的有藥效成分的部位,該部位是卡爾(四)細(xì)胞球培養(yǎng)生產(chǎn)有用物質(zhì);(二)細(xì)胞球株系通過(guò)誘導(dǎo)分離愈傷組織,建構(gòu)懸浮細(xì)胞球繁殖系統(tǒng)(液體培養(yǎng))。 在工廠(chǎng)化生產(chǎn)中,為了提高有用物質(zhì)產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量,對(duì)細(xì)胞球培養(yǎng)的選擇有兩個(gè)基本要求:有用物質(zhì)的合成積累能力強(qiáng),生長(zhǎng)速度快;(3)大量培養(yǎng)是將選擇的優(yōu)良細(xì)胞球株擴(kuò)大繁殖后,作為細(xì)胞球工廠(chǎng)化培養(yǎng)的生產(chǎn)“種子”進(jìn)行大量培養(yǎng)。 (4)從產(chǎn)品的提取和精制植物細(xì)胞培養(yǎng)物中提取和精制的產(chǎn)品。 2、提高有用物質(zhì)生產(chǎn)效率的技
10、術(shù)因素篩選高產(chǎn)細(xì)胞系從實(shí)驗(yàn)材料中篩選高產(chǎn)細(xì)胞球株系是提高生產(chǎn)率、降低生產(chǎn)成本的重要因素。 特異的次級(jí)代謝產(chǎn)物往往形成于特異的器官之中。 因此,以特異器官為材料,建構(gòu)特異功能的細(xì)胞系,從中篩選出反復(fù)多代培養(yǎng)的有效高產(chǎn)的細(xì)胞球株。篩選的高效、高產(chǎn)細(xì)胞球株系、某些植物細(xì)胞系高效、高產(chǎn)性能多年穩(wěn)定,而某些植物細(xì)胞系不穩(wěn)定,需要定期檢測(cè)更新細(xì)胞球株系。 第一步:解決生質(zhì)能源生產(chǎn)(促進(jìn)細(xì)胞分裂)第二步:促進(jìn)次級(jí)代謝物合成,即細(xì)胞球指數(shù)增長(zhǎng)停搏前后更換培養(yǎng)基,有利于二次生質(zhì)能源的積累。 二步培養(yǎng)法,培養(yǎng)基中添加的前驅(qū)物:有用的次級(jí)代謝物的前驅(qū)物。 在煙愈傷組織培養(yǎng)中,加入前體物質(zhì)煙酸,煙堿的生成量就會(huì)增加。
11、 培養(yǎng)基中生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的作用植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑不僅影響植物的脫分化和再分化,還影響次級(jí)代謝物質(zhì)的產(chǎn)生。 在煙草愈傷組織培養(yǎng)中,可以在培養(yǎng)基中添加IAA來(lái)合成煙堿,但是在含有2,4-d的培養(yǎng)基中煙堿的合成受到阻礙。 培養(yǎng)條件的影響光、溫度等影響次級(jí)代謝。 胡蘿卜愈傷組織培養(yǎng)中,光照條件下紫紅愈傷組織可生成大量花節(jié)氰苷類(lèi),且低溫條件下生成量高。 采用固相細(xì)胞球培養(yǎng)系統(tǒng)細(xì)胞球生長(zhǎng)分裂旺盛時(shí),次級(jí)代謝物的產(chǎn)量較低。 采用固相培養(yǎng),將細(xì)胞球培養(yǎng)為惰性基質(zhì),細(xì)胞球生長(zhǎng)緩慢,可提高次級(jí)代謝物質(zhì)的產(chǎn)量。思考題1好的懸浮細(xì)胞系有什么特點(diǎn)?對(duì)建構(gòu)懸浮細(xì)胞系的愈傷組織有什么要求? 2建構(gòu)懸浮細(xì)胞系的關(guān)鍵技術(shù)是什么? 3懸
12、浮細(xì)胞系在繼代培養(yǎng)有集體成長(zhǎng)規(guī)律嗎? 4細(xì)胞球大規(guī)模培養(yǎng)有哪些培養(yǎng)系統(tǒng)紫杉醇:二萜類(lèi)化合物類(lèi)化合物最早從太平洋紅豆杉Taxus brevifolia的樹(shù)皮中分離,廣泛用于卵巢癌、乳腺癌、非小細(xì)胞球肺癌等十多種癌的治療,目前主要來(lái)源于紅豆杉屬植物,紫杉醇簡(jiǎn)介、理化性質(zhì)、 英文名: Paclitaxel,Taxol or TM分子式: c440 pH 8容易分解的紫杉醇可以在特定條件下氧化,但還原極為困難,紫杉醇的研究開(kāi)發(fā)過(guò)程, NCI是過(guò)去15年研制的最優(yōu)秀抗癌藥物20世紀(jì)90年代抗腫瘤藥的三大成果之一湯姆森科學(xué)技術(shù)桂冠獎(jiǎng),Ramesh Panchagnula,internationaljour
13、nalofpharmaceutics.1998 (172 ) 抗癌一線(xiàn)藥的銷(xiāo)售額,一年5億美元的理論需求量為2g /人,500萬(wàn)人/年1000kg/年的實(shí)際銷(xiāo)售量為350 kg/年,紫杉醇的供求有相當(dāng)大的差別,圖1 :國(guó)際紫杉醇原料藥的需求動(dòng)向圖(單位: kg ),圖2 :國(guó)際紫杉醇的銷(xiāo)售上游產(chǎn)業(yè)藥源問(wèn)題下游制劑產(chǎn)業(yè)藥效(活性、水溶性)安全性生物相容性、藥源問(wèn)題, 紅豆杉主要原料植物國(guó)家一級(jí)保護(hù)野生植物世界10大瀕危種之一是生長(zhǎng)緩慢分布的有限Taxol含量低的樹(shù)皮中的Taxol含量為:0.00001-0.069% 3000棵樹(shù)=10噸樹(shù)皮=1kg Taxol=500人的患者,人工栽培是種子繁殖
14、, 扦插等無(wú)性繁殖方法快,采用大面積人工繁殖紅豆杉幼苗尋找紅豆杉替代物,從紅豆杉非樹(shù)皮部位提取生產(chǎn)紫杉醇的非紅豆杉植物,優(yōu)點(diǎn):生長(zhǎng)周期縮短簡(jiǎn)便,直接,缺點(diǎn): 1,紫杉醇含量低生長(zhǎng)慢2,提取工藝復(fù)雜,藥源問(wèn)題解決方法(1)、 藥源問(wèn)題解決化學(xué)合成全合成1994年成功的目前6個(gè)途徑半合成是以10-DAB和Baccatin為半合成原料得到紫杉醇的新方法采用10-DAT,缺點(diǎn): 1,合成過(guò)程復(fù)雜,幾十步2,費(fèi)用高,化學(xué)制劑昂貴,總收率過(guò)低(2% )。 充分利用再生資源2,生產(chǎn)效率高,具有最實(shí)用的價(jià)值,可以進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn),取得紫杉醇的結(jié)構(gòu)效果關(guān)系信息,可以進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造,缺點(diǎn):合成過(guò)程相對(duì)復(fù)雜(11階段化學(xué)
15、轉(zhuǎn)化和7階段分離),藥源問(wèn)題解決方法(3)、 生物方法組織和細(xì)胞球培養(yǎng)微生物發(fā)酵生物合成研究階段的紅豆杉生物合成路線(xiàn)基本上有10種相關(guān)酶催化劑基因愛(ài)沙尼亞克朗表達(dá),利用基因工程手段改造紅豆杉,有利于提高紫杉醇產(chǎn)量的分離純化4,低成本,生長(zhǎng)周期短5,為半合成提供原料6,有望工業(yè)化生產(chǎn),缺點(diǎn): 1, 產(chǎn)量低,不穩(wěn)定2,工業(yè)化擴(kuò)大研究,水溶性紫杉醇使用0.77mM/L增加溶劑差:聚氧乙烯蓖麻籽油和乙醇問(wèn)題穩(wěn)定性和水溶性差(7mm )我國(guó)是中藥飲片資源最豐富的國(guó)家,有詳細(xì)記載的約5000種。 中藥飲片治療疾病的歷史長(zhǎng)達(dá)一千年,中藥壓電石英已形成完整的科學(xué)系統(tǒng)。 植物藥效成分研究形成了“天然藥物化學(xué)”研
16、究的新領(lǐng)域。 在藥用植物中,具有藥物功能的物質(zhì)種類(lèi)很多,結(jié)構(gòu)復(fù)雜。 除了小分子的天然有機(jī)化合物以外,還有很多生物大分子活性物質(zhì)。 不同組方的藥用成分和功能研究是一項(xiàng)巨大的工程,相當(dāng)于染色體組和蛋白質(zhì)組研究。中藥飲片復(fù)方復(fù)雜系統(tǒng)研究(北京牌高等院校漢啟德院士),二、植物來(lái)源藥物種類(lèi)1、天然有機(jī)化合物(1)糖和氰苷類(lèi)類(lèi)(2)苯丙類(lèi):苯丙酸、丙酸、庫(kù)陸戰(zhàn)隊(duì)員等(3)醌類(lèi):補(bǔ)酶催化劑Q10、紫草素(。 (6)萜類(lèi):青蒿素、齊墩果酸(7)甾類(lèi)化合物:牛葡萄糖苷、毛第黃毒葡萄糖苷(8)生物堿:咖啡因、喜樹(shù)鹽化學(xué)基、2、植物蛋白、多肽、酶催化劑類(lèi)生理活性物質(zhì)表2-16 3,植物糖類(lèi)藥物含單糖表2-17 4,植物脂質(zhì)藥物(1) 脂肪和脂肪酸類(lèi):亞油酸、亞麻油酸、花生四烯酸油脂(2)磷脂復(fù)合物類(lèi):大豆磷脂復(fù)合物(3)固醇類(lèi):豆固醇、-谷固醇。 三、植物來(lái)源藥物的植被實(shí)例1、植物SOD 2、植酸鈣元素鎂和肌醇3、植物不飽和脂肪酸4、植物來(lái)源藥物的研究前景1、植物細(xì)胞培養(yǎng)2、植物組織培養(yǎng)3、有效成分的分離、純化、結(jié)構(gòu)和功能測(cè)定。 3、生產(chǎn)一些有用物質(zhì),生物堿多數(shù)生物堿已經(jīng)被用作醫(yī)藥。 嗎啡等生物堿通常可從鴉片中提取,用作神經(jīng)麻醉劑,利用罌粟種子愈傷組織培養(yǎng)可提取嗎啡堿及其生物堿。 氰苷類(lèi)物質(zhì)利用胡籮卜愈傷組織培養(yǎng)生產(chǎn)皂角苷,進(jìn)入工廠(chǎng)化生產(chǎn)。 醌系物質(zhì)利用紫草
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