分子診斷在乙肝診療中應(yīng)用

1、中華醫(yī)學(xué)會熱帶病與寄生蟲學(xué)分會全國委員 江西省醫(yī)學(xué)會感染病學(xué)分會常委秘書 江西省中西結(jié)合學(xué)會肝病學(xué)分會副主任委員 2005 研究方向：病毒性肝炎、肝炎后肝硬化發(fā)病機制研究、肝炎后肝硬化頑固性腹水的治療,乙肝檢測指標(biāo) 在臨床診療中的應(yīng)用,乙肝病毒復(fù)制周期給我們的啟發(fā),乙肝病毒復(fù)制周期給我們的啟發(fā),病毒顆粒上裝配,乙肝病毒復(fù)制周期給我們的啟發(fā),HBsAg “空殼”,乙肝病毒復(fù)制周期給我們的啟發(fā),人基因組持續(xù)分泌,HBeAg的形成僅在一個途徑上與HBsAg相同,乙肝病毒復(fù)制周期給我們的啟發(fā),乙肝病毒復(fù)制周期給我們的3點啟發(fā),HBV cccDNA是真正的“核心” HBsAg的形成有三個獨立的“路徑”

2、與病毒顆粒不完全相關(guān) 與rcDNA水平不呈比例關(guān)系 HBeAg與rcDNA并非一條“通路”，與HBsAg合成路徑亦非同道，其水平不與HBsAg呈比例關(guān)系,停藥與停藥后復(fù)發(fā)是個令人困惑的問題,治療終點 = 停藥標(biāo)準(zhǔn),？,治療終點 = 治愈標(biāo)準(zhǔn),？,所以我們不斷地和回顧性尋找“預(yù)測、評估”療效和“預(yù)測、評估”治愈（不復(fù)發(fā)）的各種指標(biāo)和現(xiàn)象,目 錄,乙肝檢測指標(biāo)作療效預(yù)測的意義,乙肝檢測指標(biāo)作治療終點的意義,各國指南對乙肝治療終點和目標(biāo)的描述,目 錄,乙肝檢測指標(biāo)作療效預(yù)測的意義,乙肝檢測指標(biāo)作治療終點的意義,各國指南對乙肝治療終點和目標(biāo)的描述,2012 EASL指南對治療目標(biāo)的描述,治療目標(biāo) 防止

3、疾病進展為肝硬化、失代償肝硬化、終末期肝病、HCC和死亡，從而改善生活質(zhì)量和提高生存率 實現(xiàn)目標(biāo) 持續(xù)抑制HBV復(fù)制 但是，因cccDNA 持續(xù)存在于感染的肝細(xì)胞核，HBV不可能完全清除，必須長期抑制病毒復(fù)制 另外，HBV基因整合至宿主基因組，HCC很難完全避免,2012 EASL指南關(guān)于治療終點的描述,慢乙肝患者的治療終點： 理想的治療終點：HBeAg陽性和陰性患者在停藥后持久HBsAg消失，伴有或不伴有抗-HBs血清學(xué)轉(zhuǎn)換 (A1) 滿意的治療終點：基線HBeAg陽性患者獲得持久抗-HBe血清學(xué)轉(zhuǎn)換或基線HBeAg陰性在停藥后持久的病毒學(xué)和生化學(xué)應(yīng)答，且HBeAg持續(xù)陰性 (A1) 次滿意

4、的治療終點：未獲得抗-HBe血清學(xué)轉(zhuǎn)換的HBeAg陽性患者以及HBeAg陰性患者，經(jīng)過長期抗病毒治療，達(dá)到持續(xù)的病毒學(xué)抑制 (A1) 最希望達(dá)到的治療終點：達(dá)到持續(xù)的病毒學(xué)抑制（用最靈敏方法檢測不到HBV-DNA ）（A1）。,當(dāng)前的實際情況是，理想的終點只是一個“理想”，大多數(shù)患者能達(dá)到“次滿意”終點，“滿意”者也很困難,2012 APASL指南對治療目標(biāo)的描述,主要治療目標(biāo)(Primary aim) ：持久抑制HBV復(fù)制,達(dá)到“初始應(yīng)答”，即HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換和/或HBV DNA抑制，ALT復(fù)常，并預(yù)防肝功失代償，保證“維持/持久應(yīng)答”，降低治療期間或治療后肝臟壞死性炎癥和肝纖維化的發(fā)生

5、,預(yù)防肝臟失代償、減少或預(yù)防疾病進展到肝硬化和/或HCC，并延長生存期,2012 APASL指南關(guān)于治療終點的描述,對應(yīng)用核苷酸類藥物治療的HBeAg陽性者，當(dāng)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換，且HBV-DNA至少12個月低于檢測水平(10-15 IU/ml)時，可以考慮停藥。 對HBeAg陰性者，若HBsAg持續(xù)陽性，若患者已治療2年，且3次HBV-DNA不可測(間隔6個月)，可考慮終止治療。,2010中國指南對治療終點的描述,HBeAg陽性患者 HBV DNA低于檢測下限、ALT復(fù)常、HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換鞏固至少1年（經(jīng)過至少2次復(fù)查，每次間隔6個月）仍保持不變且總療程至少已達(dá)2年者，可考慮停藥，但延

6、長療程可減少復(fù)發(fā) HBeAg陰性患者 HBV DNA低于檢測下限、ALT復(fù)常至少再鞏固1年半（經(jīng)過至少3次復(fù)查，每次間隔6個月）仍保持不變、且總療程至少已達(dá)到2年半者，可考慮停藥。,當(dāng)前的實際情況是，即使達(dá)到“終點”，停藥后復(fù)發(fā)的比例很大，少有人能在2年或2.5年停藥,目 錄,乙肝檢測指標(biāo)作療效預(yù)測的意義,乙肝檢測指標(biāo)作治療終點的意義,各國指南對乙肝治療終點和目標(biāo)的描述,乙肝檢測指標(biāo)在診療中的應(yīng)用,高靈敏度HBV DNA定量 （內(nèi)標(biāo)法） 感染早期判斷 病情監(jiān)測 藥物療效判斷 用藥方案指導(dǎo) 停藥判斷,HBV基因分型 病情預(yù)后發(fā)展評估 抗病毒藥物療效判斷,cccDNA檢測 確定病毒清除 判斷停藥時

7、間 判斷肝外組織感染,乙肝耐藥全基因測序 （測序法） 抗藥監(jiān)測 治療藥物選擇,HBsAg定量檢測 （全定量） 乙肝兩對半定量檢測 療效預(yù)測 療效監(jiān)測,乙肝檢測指標(biāo)作療效預(yù)測的意義,HBeAg消失與血清轉(zhuǎn)換,HBeAg“陰轉(zhuǎn)”與乙肝病毒的基因型有關(guān)，與治療有相關(guān)性 A型（北美、歐洲）：HBeAg陰性乙肝比例高 D型（地中海和中東）：HBeAg陽性和陰性乙肝比例近似 B型和C型（遠(yuǎn)東）：HBeAg陽性乙肝比例較高 亞洲兒童HBeAg自發(fā)血清轉(zhuǎn)換率： 3歲：2%/年 3歲：4-5%/年 近90%的HBsAg攜帶者中，在其15-20歲期間保持HBeAg陽性；隨著年齡增長，HBeAg陽性率逐漸下降，在4

8、0歲的人群中，HBeAg陽性率10%,LiawYF. HBeAg seroconversion as an important end point in the treatment of chronic hepatitis B. Hepatol Int (2009) 3:425433,采用HBeAg定量預(yù)測PegIFN治療者HBeAg血清轉(zhuǎn)換,患者來自一項隨機、多中心、III期注冊研究的數(shù)據(jù)分析 對其中271例HBeAg陽性且用Peg-IFN-2a+口服安慰劑治療48周的患者回顧性地進行HBeAg定量檢測 HBeAg定量檢測用微粒子酶免疫分析，并以來自Paul Ehrlich Institut

9、e (PEIU/mL)內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn),基線、治療12周和24周HBeAg水平與HBeAg血清轉(zhuǎn)換的相關(guān)性,基線HBeAg定量低的患者獲得HBeAg血清轉(zhuǎn)換率高 治療12周時，HBeAg 10PEIU/ml的患者中53%在停藥24周時獲得HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換 治療24周時，HBeAg水平越低，停藥后獲得血清學(xué)轉(zhuǎn)換率越高,HBsAg自發(fā)清除率：亞洲0.12-2.38%,Chia-Ming Chu，Yun-Fan Liaw Antiviral therapy,2010;15:133-143,HBsAg定量：Why and how to use?,qHBsAg預(yù)測干擾素的療效(HBeAg陽性),干擾素治療1

10、2周，HBsAg無明顯下降的患者預(yù)示可能出現(xiàn)不應(yīng)答 干擾素治療24周，HBsAg下降明顯的患者預(yù)示干擾素療效良好,(12/92),(9/92),(31/114),(117/510),(173/510),(46/114),(112/510),(66/510),(21/114),(16/114),(63/202),(51/209),(97/399),qHBsAg預(yù)測干擾素的療效(HBeAg陰性),患者在12W時qHBsAg下降10%的患者，病毒學(xué)應(yīng)答率低(16% vs 47%, P0.01),qHBsAg預(yù)測干擾素的療效(HBeAg陰性),患者在12W時qHBsAg下降10%的患者，5年HBsAg

11、消失率低(5% vs 23%, P0.01),qHBsAg預(yù)測NUCs療效,NA治療，qHBsAg下降緩慢且與HBV DNA下降的水平無相關(guān)性 但在NA治療期間，尤其是在獲得VR后，HBsAg 快速下降，預(yù)示著患者長期治療后可獲得HBsAg清除 每6-12月HBsAg定量可以作為NA治療中的監(jiān)測指標(biāo) 亞洲人群中（B、C型），qHBsAg100IU/ml者，停藥后復(fù)發(fā)的可能性小，可據(jù)此作為停藥依據(jù)，但需要更多的多中心研究來證實 本研究是文獻(xiàn)回顧，數(shù)據(jù)也是來自回顧,從HBV復(fù)制周期與看NUC對HBsAg的清除,NUC治療阻斷逆轉(zhuǎn)錄，選擇性地抑制HBV病毒顆粒的合成；但由于cccDNA 的長期存在，

12、不能降低HBsAg水平,目 錄,乙肝檢測指標(biāo)作療效預(yù)測的意義,乙肝檢測指標(biāo)作治療終點的意義,各國指南對乙肝治療終點和目標(biāo)的描述,乙肝檢測指標(biāo)在診療中的應(yīng)用,高靈敏度HBV DNA定量 （內(nèi)標(biāo)法） 感染早期判斷 病情監(jiān)測 藥物療效判斷 用藥方案指導(dǎo) 停藥判斷,HBV基因分型 病情預(yù)后發(fā)展評估 抗病毒藥物療效判斷,cccDNA檢測 確定病毒清除 判斷停藥時間 判斷肝外組織感染,乙肝耐藥全基因測序 （測序法） 抗藥監(jiān)測 治療藥物選擇,HBsAg定量檢測 （全定量） 乙肝兩對半定量檢測 療效預(yù)測 療效檢測,乙肝檢測指標(biāo)作治療終點的意義,高靈敏HBV-DNA定量在臨床中的應(yīng)用,開始治療,治療12周,治療

13、24周,基于HBV DNA、ALT水平和疾病發(fā)展階段,是否存在原發(fā)性無應(yīng)答 （HBV DNA較基線降低不到1 log10）,完全病毒學(xué)應(yīng)答 60 IU/ml 繼續(xù)治療 每6個月監(jiān)測HBV DNA,部分病毒學(xué)應(yīng)答 60-2000 IU/ml 加其他藥物治療 每3個月監(jiān)測HBV DNA,不充分病毒學(xué)應(yīng)答 2000 IU/ml 改用或加用更強藥物 每3個月監(jiān)測HBV DNA,治療終點,達(dá)到持續(xù)的病毒學(xué)抑制 （用最靈敏方法檢測不到HBV-DNA ）,常規(guī)定量PCR檢測下限偏高，無法準(zhǔn)確評價治療應(yīng)答情況及判斷治療終點，使得治療后臨床復(fù)發(fā)率高,HBV DNA （0-20 IU/ml）,HBV DNA （5

14、00 IU/ml）,更準(zhǔn)確檢測低濃度病毒 判斷治療終點，避免假陰性,HBV DNA （20-1.7108 IU/ml）,HBV DNA （103-107 IU/ml）,線性范圍更寬，可以更準(zhǔn)確地檢測低濃度與高濃度的HBV DNA,高靈敏度定量,常規(guī)定量PCR,優(yōu)勢,檢出限,線性范圍,目前監(jiān)測HBV-DNA中存在的問題,“HBV DNA定量檢測需要高靈敏度方法 （最低值為20 IU/ml以下）”,“一個能夠偵測10-15 IU/ml 的real-time PCR方法是最好的疾病監(jiān)測的工具”,2011 EASL指南 要進行高敏感度HBV DNA定量檢測,COBAS HBV,430例血漿 Real

15、time PCR HBV1000 copies/mL,222例（51.6%） 20 IU/mL,208/430(48.4%) 20 IU/mL,2.0 test,經(jīng)COBAS TaqMan HBV 檢測后，共有158/430（36.7%）病毒載量 1000 copies/mL,Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan HBV病毒載量系統(tǒng)對慢性乙型肝炎抗病毒治療監(jiān)測的意義 李敏偉 沃健兒 倪淑君 王 靜 李蘭娟 浙江大學(xué)附屬第一醫(yī)院傳染病診治國家重點實驗室Data on file,普通乙肝病毒定量檢測假陰性率高達(dá)36.7%,64/222（28.38%）E+02 copies/mL

16、,107/222（48.20%）E+03 copies/mL,35/222（15.77%）E+04 copies/mL,7/222（3.15%）E+05 copies/mL,2/222（0.9%）E+07 copies/mL,7/222（3.15%）E+06 copies/mL,華西醫(yī)院采用COBAS TaqMan HBV檢測20例治療48周普通PCR報告HBV DNA1000 copies/ml樣本的結(jié)果分析,20例患者組成特點 -9例服用ETV、11例服用ADV（48周） -10例eAg陽性、8例eAg陰性患者、 2例1,5陽患者,*包括1例服用ETV患者,普通PCR法 “假陰性”率高達(dá)45% (9/20),高靈敏度HBV-DNA定量 幫助臨床醫(yī)生更準(zhǔn)確監(jiān)測療效及判斷治療終點,高靈敏度HBV-DNA定量檢測是國內(nèi)唯一滿足治療指南和專家共識的HBV-DNA檢測項目,高靈敏度HBV-DNA定量,檢測下限：020 IU/ml,COBASAmpliPrep/COBASTaqMan 分析儀,2007年美國新修訂的慢性乙型肝炎病毒感染