雙水相萃取脂肪酶課件.ppt

1、雙水相萃取脂肪酶,2,雙水相萃取脂肪酶,3,雙水相萃取脂肪酶,概述：本實(shí)驗(yàn)主要研究用雙水相萃取法分離和提純脂肪酶的技術(shù)，探究了雙水相的形成條件及不同濃度的雙水相體系對(duì)脂肪酶的提純效果。,概述,4,雙水相萃取法是利用生物大分子物質(zhì)在由高聚物/高聚物/水或者高聚物/無機(jī)鹽/水形成的體系中的分配系數(shù)不同而實(shí)現(xiàn)對(duì)生物大分子的分離的。 現(xiàn)在研究最多的雙水相體系有高聚物/高聚物以及高聚物/無機(jī)鹽體系，常用的高聚物有聚乙二醇（PEG）和葡聚糖等，無機(jī)鹽主要有磷酸鹽、硫酸鹽等。本實(shí)驗(yàn)所采用的就是PEG/硫酸鹽體系，,概述,5,黃酮類化合物的提取和分離,概述,與傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)分離提純方法相比， 雙水相萃取方法具有

2、很多優(yōu)點(diǎn)： 體系含水量高，可達(dá)80以上； 蛋白質(zhì)在其中不易變性； 界面張力遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于水有機(jī) 溶劑兩相體系的界面張力， 一般為0.510-4mN*m-1 ，有助于強(qiáng)化相際間的質(zhì)量傳遞；,6,黃酮類化合物的提取和分離,為了得到適合的兩相配比，就要通過繪制相圖來進(jìn)行分析，相圖的繪制就是通過調(diào)整兩相比例，得到能夠分相的臨界點(diǎn)，從而得到相圖。 脂肪酶經(jīng)過雙水相的初步分離后，還要通過凝膠過濾的方法對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的分離和純化，從而達(dá)到更高的純度。但是經(jīng)過雙水相后，體系中有大量的PEG（脂肪酶主要分配在PEG相）從而不能直接經(jīng)過凝膠過濾，還需要采取一定手段去除過量的PEG，可以采用PEG沉淀的方法或者反萃取來去

3、除多余的PEG。 本實(shí)驗(yàn)采用的是PEG/（NH4）2SO4體系和SDS/CTAB體系兩種雙水相。PEG/（NH4）2SO4體系是較為常用的一種雙水相體系， SDS/CTAB體系是一種表面活性劑雙水相體系，,實(shí)驗(yàn)原理,7,黃酮類化合物的提取和分離,實(shí)驗(yàn)材料：假單胞菌脂肪酶（由假單胞菌發(fā)酵制備） 實(shí)驗(yàn)儀器：紫外可見分光光度計(jì)，離心機(jī)，乳化機(jī)，恒溫?fù)u床，恒溫水浴鍋，PH計(jì),實(shí)驗(yàn)用品,8,黃酮類化合物的提取和分離,PEG1000、（NH4）2SO4、十二烷基硫酸鈉（SDS）、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、橄欖油、2%聚乙烯醇（PVA）溶液、糊精、蛋白胨、 K2HPO43H2O，MgSO47H2O，

4、0.05mol/L NaOH溶液，酚酞指示劑，EDTA,pNPP,乙腈,實(shí)驗(yàn)藥品,實(shí)驗(yàn)藥品,9,多呈黃色，且顏色與分子中的交叉共軛體系(發(fā)色團(tuán))及助色團(tuán)有關(guān),黃酮苷均有旋光性，且多為左旋。游離的二氫黃酮、二氫黃酮醇、二氫異黃酮和黃烷醇等具有旋光性。其余的游離黃酮?jiǎng)t無旋光性,在紫外燈光下 普遍具有熒光,10,學(xué)習(xí)目標(biāo),1,雙水相相圖的制作,熟練進(jìn)行黃芩、葛根、銀杏葉中黃酮的提取分離操作； 能進(jìn)行補(bǔ)骨脂、槐花中黃酮的提取分離操作。,實(shí)驗(yàn)方法,11,黃酮類化合物的提取和分離,藥 材,水或醇-水，加熱提取,提取液,濃縮，加3-4倍醇,醇水液,沉淀（水溶性雜質(zhì)）,濃縮，回收醇，加水,水 液,依次用石油醚

5、、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取,石油醚層,氯仿層,乙酸乙酯層,正丁醇層,水層,葉綠素等脂 溶性成分,黃酮苷元,大極性苷元 小極性的苷,黃酮苷,多糖 蛋白質(zhì),原理： 利用黃酮類與其它雜質(zhì)極性 不同，選不同溶劑進(jìn)行萃取,溶劑萃取法,12,黃酮類化合物的提取和分離,原理：酚羥基與堿成鹽，溶于水；加酸后析出 堿： 常用Ca(OH)2，即石灰乳(石灰水),堿提酸沉法,藥材,堿水液,H+,OH-,沉淀 （黃酮苷，苷元）,水液 （水雜，M+）,13,黃酮類化合物的提取和分離,優(yōu)點(diǎn) A：使含酚羥基化合物成鹽溶解。 B：使含羧基雜質(zhì)（果膠、粘液質(zhì)、蛋白質(zhì)等） 形成鈣鹽沉淀。 注意 a：提取時(shí)，堿液濃度不宜過高。

6、b：加酸酸化時(shí)，酸性也不宜過強(qiáng)。 應(yīng)用：蘆丁和槲皮素等的提取、分離和鑒定。,堿提酸沉法,14,黃酮類化合物的提取和分離,原理：活性炭吸附黃酮苷類化合物 用途：主要用于含量較高的黃酮苷類的精制,活性炭吸附法,甲醇粗提液,活性炭,黃酮-活性炭,沸水,沸甲醇,7酚/水,15%酚/醇,黃酮苷,15,黃酮類化合物的提取和分離,極性 氫鍵 分子大小（量） 酸性 特殊結(jié)構(gòu),硅膠 聚酰胺 凝膠 梯度pH萃取法 金屬鹽絡(luò)合法,柱色譜法,分離方法,16,黃酮類化合物的提取和分離,硅膠是一種高活性吸附材料，其化學(xué)分子式為mSiO2nH2O 應(yīng)用范圍： 主要分離小極性和中等極性的化合物，應(yīng)用最為廣泛。 異黃酮、二氫黃

7、酮（醇）、高度甲基化（乙?；┑狞S 、 酮及黃酮醇。 多羥基黃酮、黃酮醇及其苷類：硅膠加水去活化。 吸附規(guī)律： 極性大吸附能力強(qiáng) e g ： A 苷元 B 二糖苷 C 單糖苷 Rf：A C B,硅膠柱色譜,17,黃酮類化合物的提取和分離,原理：氫鍵吸附（作用） 洗脫規(guī)律：（先后） 母核上游離羥基增加，越難于洗脫。 羥基數(shù)目相同時(shí)，有締合羥基 無締合羥基 苷元相同：三糖苷 雙糖苷 單糖苷 苷元 不同類型黃酮類化合物的洗脫先后順序?yàn)椋?異黃酮二氫黃酮醇黃酮黃酮醇 分子中芳香程度高、共軛雙鍵多，則聚酰胺對(duì)其的吸附力強(qiáng)，故難于洗脫。 應(yīng)用范圍：適合各種類型的黃酮類化合物，包括苷、苷元、查耳酮及二氫黃酮

8、。,聚酰胺柱色譜,18,正相與反相色譜,硅膠 固定相（硅醇） 流動(dòng)相（醇）極性時(shí)為正相 聚酰胺 固定相（聚酰胺脂肪鏈） 流動(dòng)相（醇水）極性時(shí)為反相,槲皮素對(duì)照品,槲皮素,蘆丁,蘆丁對(duì)照品,槲皮素對(duì)照品,槲皮素,蘆丁,蘆丁對(duì)照品,聚酰胺TLC,硅膠TLC,黃酮類化合物的提取和分離,19,黃酮類化合物的提取和分離,常用型號(hào)：Sephadex-G和Sephadex-LH20 原理：吸附作用和分子篩 對(duì)游離黃酮，主要是吸附作用, 吸附程度取決于游離酚羥基的數(shù)目，苷元的羥基數(shù)目越多，越難洗脫。 對(duì)黃酮苷，主要是分子篩原理, 洗脫時(shí)按分子量由大到小先后洗脫下來。 常用洗脫劑： 堿性水溶液（0.1mol/L

9、 NH4OH），鹽水溶液(0.05mol/L NaCl) 醇及含水醇，如甲醇，甲醇-水，乙醇等。 其它溶劑：含水丙酮、甲醇-氯仿(凝膠會(huì)膨脹， 體積變大)。,葡聚糖凝膠柱色譜,20,黃酮類化合物的提取和分離,規(guī)律： 苷元的羥基數(shù)越多，越難以洗脫。 吸附作用 苷的分子量越大,其上聯(lián)結(jié)糖的數(shù)目越多,容易洗脫。 分子篩原理 苷比苷元先洗脫。,葡聚糖凝膠柱色譜,21,黃酮類化合物的提取和分離,原理： 黃酮類化合物具有酸性、且不同數(shù)目和不同位置的酚羥基的酸性強(qiáng)弱不同。 適用范圍：適用于分離酸性強(qiáng)弱不同的黃酮苷元,酸性： 7,4-OH 7-或4-OH 一般酚OH 5-OH,溶于 5%NaHCO3,溶于 5

10、%NaCO3,溶于 0.2%NaOH,梯度pH萃取法,溶于 4%NaOH,22,黃酮類化合物的提取和分離,乙醚液 （脂雜）,乙醚液,乙醚液,乙醚提取液,乙醚液,堿液(3或5-OH黃酮),堿液(一般酚OH黃酮),堿液(7,4-二OH黃酮),堿液(7或4-OH黃酮),5% NaHCO3,5% Na2CO3,0.2% NaOH,4% NaOH,梯度pH萃取法,23,黃酮類化合物的提取和分離,原理：利用分子中某些特定官能團(tuán)性質(zhì)進(jìn)行分離 具有鄰二酚羥基的成分，用醋酸鉛沉淀 不具有鄰二酚羥基的成分，用堿式醋酸鉛沉淀 具有鄰二酚羥基的黃酮類化合物還可以與硼酸反應(yīng)形成溶于水的硼酸絡(luò)合物，可以與不具有鄰二酚羥基

11、的其它黃酮類化合物分離。,金屬鹽絡(luò)合法,24,第十一章 黃酮類化合物,概 述,1,黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)和分類,2,黃酮類化合物的理化性質(zhì),3,黃酮類化合物的提取和分離,4,黃酮類化合物的檢識(shí)和結(jié)構(gòu)鑒定,5,25,黃酮類化合物的檢識(shí)和結(jié)構(gòu)鑒定,一 色譜法的應(yīng)用二 紫外光譜三 1H-NMR四 13C-NMR五 質(zhì)譜,概 述,26,黃酮類化合物的檢識(shí),顏色：多呈黃色 母核檢識(shí)： 鹽酸-鎂粉反應(yīng) 黃酮、黃酮醇、二氫黃酮、二氫黃酮醇 四氫硼鈉反應(yīng) 二氫黃酮（醇）類 取代基團(tuán)檢識(shí)：鋯鹽-枸櫞酸反應(yīng) 3-OH、 5-OH黃酮鑒別 氨性氯化鍶反應(yīng) 鄰二酚羥基 色譜檢識(shí): 硅膠 TLC 聚酰胺TLC 紙色譜（PC

12、）,理化檢識(shí),27,黃酮類化合物的檢識(shí)和結(jié)構(gòu)鑒定,硅膠TLC：用于分析與鑒定弱極性黃酮類化合物。 展開劑：甲苯-甲酸甲酯-甲酸(5:4:1)，苯-甲醇，氯仿-甲醇等。 聚酰胺TLC： 適合于含游離酚OH的黃酮及其苷類的分析。 聚酰胺對(duì)黃酮類化合物吸附能力強(qiáng)，大多數(shù)展開劑中含有醇、酸或水。 紙色譜（PC）： 適用于各種黃酮類化合物及其苷類的分析。,色譜法,28,黃酮類化合物的檢識(shí)和結(jié)構(gòu)鑒定,第一相展開采用醇性展開劑 如: BAW、TBA、水飽和n-BuOH 色譜行為: Rf值: 苷元單糖苷雙糖苷 一般:苷元在0.70以上，而苷則小于0.7。,分 配 作 用,第二相展開采用水性展開劑 如：26%

13、HOAc水溶液 3% NaCl 水溶液 HOAc:濃HCl:H2O= 30: 3 : 10 色譜行為: 連接糖越多, Rf 越大(0.5); 苷元Rf較小，有的留在原點(diǎn)。,吸 附 作 用,雙向色譜,29,黃酮類化合物的檢識(shí)和結(jié)構(gòu)鑒定,苷元:平面型分子: 黃酮(醇)、查耳酮的Rf小, 幾乎留在 原點(diǎn)不動(dòng) (Rf 0.02);非平面型分子: 二氫黃酮(醇)、二氫查耳酮的Rf大, 因親水性較強(qiáng) (Rf 0.10-0.30)。,紙色譜,紙色譜（PC）：采用雙向紙色譜。,色譜檢查方法：觀察熒光，NH3處理產(chǎn)生明顯的色變。AlCl3顯色，UV燈下呈亮黃色熒光斑點(diǎn)。,30,黃酮類化合物結(jié)構(gòu)鑒定,一般步驟：

14、1 待測(cè)樣品在甲醇中的UV光譜。 2 待測(cè)樣品在甲醇中加入各種診斷試劑后的UV光譜。 診斷試劑：NaOCH3 , NaOAc, NaOAc/H3BO3, AlCl3, AlCl3/HCl 3 苷類水解后的UV光譜。,UV,31,黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)鑒定,苯甲?；?帶II：220280nm,桂皮酰基 帶I：300400nm,UV,32,兩者UV光譜圖形相似，但帶I位置不同。整個(gè)母核上氧取代程度越高，則帶I將向長(zhǎng)波方向位移（紅移）。,不同類型黃酮的UV基本特征,a. b.,黃酮 黃酮醇,33,帶II吸收峰為主峰，帶I很弱，常在主峰的長(zhǎng)波方向有一肩峰。,c. d.,不同類型黃酮的UV基本特征,245-

15、270nm,270-295nm,異黃酮、二氫黃酮 二氫黃酮醇,34,共同特征是帶I很強(qiáng)，為主峰 而帶II則較弱，為次強(qiáng)峰。帶I的位置不同。,不同類型黃酮的UV基本特征,查耳酮 橙酮類,35,不同類型黃酮的UV基本特征,UV,36,診斷試劑在結(jié)構(gòu)測(cè)定中的應(yīng)用,常用的診斷試劑： 甲醇鈉 (NaOCH3) 醋酸鈉 (NaOCOCH3) 醋酸鈉 / 硼酸 (NaOCOCH3 / H3BO3) 三氯化鋁 (AlCl3) 三氯化鋁 / 鹽酸 (AlCl3 / HCl),UV,37,診斷試劑在結(jié)構(gòu)測(cè)定中的應(yīng)用,NaOMe：堿性強(qiáng)，酚OH易形成鈉鹽。PhOHPhO-Na+，增加電子云密度和流動(dòng)性 使UV譜 紅

16、移。 2. NaOAc： 未熔融: 堿性較弱，只能使黃酮母核上酸性較強(qiáng) 的酚OH解離而使UV譜 紅移。 熔 融：堿性，表現(xiàn)出與NaOMe類似的效果。,UV,38,診斷試劑在結(jié)構(gòu)測(cè)定中的應(yīng)用,3. NaOAc / H3BO3：用于鑒定鄰二酚OH。 在醋酸鈉堿性下，鄰二酚OH與硼酸絡(luò)合，引起峰帶紅移。,UV,39,診斷試劑在結(jié)構(gòu)測(cè)定中的應(yīng)用,4. AlCl3 5. AlCl3 /HCl： 分子中有3-OH，5-OH，鄰二酚OH時(shí)，可與Al3+絡(luò)合，引起吸收峰紅移。 鋁絡(luò)合物穩(wěn)定性： 黃酮醇3-OH 黃酮5-OH 二氫黃酮5-OH 鄰二酚OH 二氫黃酮醇3-OH,UV,40,診斷試劑對(duì)黃酮類化合物U

17、V譜圖的影響及結(jié)構(gòu)的關(guān)系,41,診斷試劑對(duì)黃酮類化合物UV譜圖的影響及結(jié)構(gòu)的關(guān)系,42,測(cè)定順序：,1樣品/CH3OH,確定黃酮類型,2加診斷試劑：,CH3OH+ NaOCH3,確定4-OH，3 - OH,CH3OH+ NaOAC,確定7- OH,t,對(duì)堿敏感的結(jié)構(gòu),CH3OH+ NaOAC +H3BO3,鄰二酚OH,AlCl3/HCl與CH3OH, C3-OH、C5 - OH,AlCl3-AlCl3/HCl,鄰二酚OH,3苷類水解后測(cè)定苷元的UV光譜，與苷比較。,診斷試劑在結(jié)構(gòu)測(cè)定中的應(yīng)用,UV,43,氫譜在黃酮類結(jié)構(gòu)分析中的應(yīng)用,常用溶劑: CDCl3、DMSO-d6、C5H5N; 當(dāng)用D

18、MSO-d6 時(shí): 5-OH: 12.40; 7-OH: 10.93; 3-OH: 9.70。 加入D2O交換后，OH信號(hào)消失。,1H-NMR,44,氫核磁共振基礎(chǔ)知識(shí)（一）,45,氫核磁共振基礎(chǔ)知識(shí)（二）,1,0,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,C3CH C2CH2 C-CH3 環(huán)烷烴,0.2-1.5,CH2Ar CH2NR2 CH2S CCH CH2C=O CH2=CH-CH3,1.7-3,CH2F CH2Cl CH2Br CH2I CH2O CH2NO2,2-4.7,0.5(1)-5.5,6-8.5,10.5-12,CDCl3 (7.27),4.6-5.9,9-1

19、0,OH NH2 NH,CR2=CH-R,RCOOH,RCHO,特征質(zhì)子化學(xué)位移,46,Chemical shift (d),Cl2CHCH3,4 lines; quartet,2 lines; doublet,CH3,CH,氫核磁共振基礎(chǔ)知識(shí)（三）,47,Chemical shift (d),BrCH2CH3,4 lines; quartet,3 lines; triplet,CH3,CH2,核磁共振基礎(chǔ)知識(shí)（四）,48,Chemical shift (d),BrCH(CH3)2,7 lines; septet,2 lines; doublet,CH3,CH,核磁共振基礎(chǔ)知識(shí)（五）,49,C

20、hemical shift (d),OCH3,核磁共振基礎(chǔ)知識(shí)（六）,50,doublet of doublets,doublet,doublet,核磁共振基礎(chǔ)知識(shí)（七）,51,Chemical shift (d),ClCH2,CH3,ClCH2CH2CH2CH2CH3,1H,核磁共振基礎(chǔ)知識(shí)（八）,52,Chemical shift (d, ppm),ClCH2CH2CH2CH2CH3,13C,CDCl3,核磁共振基礎(chǔ)知識(shí)（九）,53,Chemical shift (d, ppm),核磁共振基礎(chǔ)知識(shí)（十）,54,Chemical shift (d),C,C,CH,CH,CH,CH2,CH2,

21、CH2,CH3,核磁共振基礎(chǔ)知識(shí)（十一）,55,1H-NMR在黃酮結(jié)構(gòu)分析中的應(yīng)用,A 環(huán)質(zhì)子 B環(huán)質(zhì)子 C環(huán)質(zhì)子 糖上質(zhì)子 取代基團(tuán)質(zhì)子,芳環(huán)質(zhì)子 芳環(huán)質(zhì)子 與類型有關(guān) 端基質(zhì)子 -OH、-CH3、 其他質(zhì)子 -OCH3、,-OCOCH3,黃酮類化合物各質(zhì)子的信號(hào)特征（、峰形狀、J、峰面積）,符合芳環(huán)質(zhì)子規(guī)律,56,黃酮類化合物A、B環(huán)的取代模式,A環(huán)取代模式,B環(huán)取代模式,57,黃酮類化合物1H-NMR譜,5,7-二取代黃酮,A環(huán),58,5,7-二取代黃酮實(shí)例,芹菜素,59,5-H 7.9-8.2 (d, J = 9.0 Hz) 6-H 6.7-7.1 (dd, J=9.0, 2.5 Hz

22、) 8-H 6.7-7.0 (d, J = 2.5 Hz),7-取代黃酮,A環(huán),黃酮類化合物1H-NMR譜,60,7-取代黃酮實(shí)例,刺槐亭,61,B環(huán)質(zhì)子形成H-2,6及H-3,5兩組 形成AABB系統(tǒng) 總體比A環(huán)質(zhì)子低場(chǎng) H-2,6比H-3,5低場(chǎng),4-取代黃酮,B環(huán),黃酮類化合物1H-NMR譜,62,4-取代黃酮實(shí)例,芹菜素,63,Chemical shift (d, ppm),OCH3,AABB 取代模式,64,對(duì)于黃酮與黃酮醇 H-5作為一個(gè)二重峰 (d, J=8.5 Hz)出現(xiàn)在6.7-7.1處 H-2(d, J=2.5 Hz)及 H-6(dd, J=8.5, 2.5Hz) 信號(hào)出現(xiàn)

23、在7.2-7.9,異黃酮、二氫黃酮及二氫異黃酮 H-2,5,6作為一個(gè)多重峰出現(xiàn)在 6.7-7.1,3,4-取代黃酮,B環(huán),黃酮類化合物1H-NMR譜,65,3,4-取代黃酮實(shí)例,木犀草素,66,若3 位和5 位取代基相同時(shí)，H-2 , H-6 作為一個(gè)單峰，出現(xiàn)在 6.50 7.50。 若3 位和5 位取代基不相同時(shí)， H-2 , H-6 將以不同的化學(xué)位移分別作為二重峰出現(xiàn)，J=2.0Hz。,3,4,5-取代黃酮,B環(huán),黃酮類化合物1H-NMR譜,67,刺槐亭,3,4,5-取代黃酮實(shí)例,68,C環(huán),黃酮及異黃酮,黃酮類C環(huán)1H-NMR譜,69,黃酮類C環(huán)1H NMR實(shí)例,芹菜素 黃酮,70

24、,黃酮類C環(huán)1H NMR實(shí)例,奧洛波爾 異黃酮,71,黃酮類C環(huán)1H NMR,二氫黃酮,72,黃酮類C環(huán)1H NMR實(shí)例,甘草素 二氫黃酮,73,黃酮類C環(huán)1H NMR實(shí)例,二氫黃酮醇,74,黃酮類C環(huán)1H NMR實(shí)例,二氫槲皮素 二氫黃酮醇,75,黃酮類C環(huán)1H NMR,H- 6.5-6.7 (1H, d, J=17.0Hz) H- 7.3-7.7 (1H, d, J=17.0Hz),芐氫 6.5-6.7 (1H, s, CDCl3) 6.4-6.9 (1H, s, DMSO-d6),查耳酮及橙酮,76,黃酮類化合物1H-NMR譜,糖,77,黃酮類1H NMR實(shí)例,芹菜素-7-O葡萄糖苷,7

25、8,黃酮類化合物1H NMR,5OH： 12 ppm 7OH： 11 ppm 3OH： 10 ppm,其他取代基,79,黃酮類型1H NMR實(shí)例,5-OH,7-OH,4-OH,3-OH,木犀草素,80,13C-NMR在黃酮類化合物結(jié)構(gòu)鑒定中的應(yīng)用,苷化位移,骨架類型,81,黃酮類化合物骨架類型,82,黃酮類化合物取代圖式,83,黃酮類化合物中糖的連接位置,苷化位移,84,質(zhì)譜在黃酮類化合物鑒定中的應(yīng)用,方法：EI-MS（電子轟擊質(zhì)譜）、FD-MS（場(chǎng)解吸質(zhì)譜）、FAB-MS（快原子轟擊質(zhì)譜） 苷元：EI-MS可得到分子離子峰(強(qiáng), 往往為基峰)；苷：用FD-MS、FAB-MS或?qū)⑦白鞒杉谆蛉谆杳鸦苌铮贉y(cè)EI-MS。,85,主要碎片離子峰為裂解途徑I 產(chǎn)生的A1和B1 母核確定 及裂解途徑II產(chǎn)生的 B2+ A、B-環(huán)取代情況,裂解途徑