GB-T15356-1994 化學(xué)試劑 核苷酸測(cè)定通則

中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)

GB/T15356一94

劑貝

通

試定

觀

學(xué)酸

普

化。

核

Chemicalreagent

Generalrulesforthedeterminationofnucleotides

1主題內(nèi)容與適用范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了化學(xué)試劑核昔酸含量、熔點(diǎn)、比旋光度、層析試驗(yàn)和干燥失重測(cè)定的通用方法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于化學(xué)試劑核昔酸及其衍生物的分析。

本標(biāo)準(zhǔn)不適用于藥用核昔酸及其衍生物的分析。

2弓}用標(biāo)準(zhǔn)

GB/T601化學(xué)試劑滴定分析(容量分析)用標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

GB/T602化學(xué)試劑雜質(zhì)測(cè)定用標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

GB/T603化學(xué)試劑試驗(yàn)方法中所用制劑及制品的制備

GB/"I'613化學(xué)試劑比旋光度測(cè)定通用方法

GB/T617化學(xué)試劑熔點(diǎn)范圍測(cè)定通用方法

GB/T6”化學(xué)試劑采樣及驗(yàn)收規(guī)則

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

GB/T9008液相色譜法術(shù)語柱液相色譜法和平面色譜法

GB/T9721化學(xué)試劑分子吸收分光光度法通則(紫外和可見部分)

3一般規(guī)定

3.1本標(biāo)準(zhǔn)中所用的水、在沒有注明其他要求時(shí)，應(yīng)符合GB/T6682中三級(jí)水的規(guī)格。

3.2本標(biāo)準(zhǔn)中所用試劑的純度應(yīng)為分析純。

3.3本標(biāo)準(zhǔn)中凡層析測(cè)定時(shí)，核普酸R，值均應(yīng)以在完全相同條件下的對(duì)照樣品的R，值為判斷標(biāo)準(zhǔn)，

且每次測(cè)定都不得省去作為判斷標(biāo)準(zhǔn)的對(duì)照樣品。

3.4本標(biāo)準(zhǔn)中凡層析測(cè)定需作雜質(zhì)限量檢測(cè)時(shí)，應(yīng)使用符合6.1.2.1條之規(guī)定的對(duì)照樣品。

熔點(diǎn)測(cè)定

按GB/T617規(guī)定測(cè)定。

核昔酸的熔點(diǎn)數(shù)值可參考附錄A(參考件)。

比旋光度的測(cè)定

按GB/T613之規(guī)定測(cè)定。

核昔酸的比旋光度數(shù)值可參考附錄A(參考件)。

國家技術(shù)監(jiān)督局1994一12一22批準(zhǔn)1995一10一01實(shí)施

GB/T15356一94

6層析試驗(yàn)

層析試驗(yàn)用于檢測(cè)核昔酸的純度及定性鑒別。所有核昔酸均應(yīng)以下列方法中選擇一種方法進(jìn)行測(cè)

定。

6.，紙層析

6.1.1方法原理

紙層析法是以a紙為惰性支持物的一種層析法。分離原理屬分配層析的范疇，它利用不同溶質(zhì)在靜

止的水相，亦即紙上所吸附的水為固定相和沿紙流動(dòng)的有機(jī)相(即流動(dòng)相)兩相溶劑的不斷分配而達(dá)分

離的目的。核昔酸經(jīng)層析后，常用比移值(凡)來表示各組分在層析譜中的位置。(凡)值按式(1)計(jì)算:

·····，.??.”.”.“，”。。”..?(1)

式中:R,—比移值;

d.-溶質(zhì)遷移距離,cm;

dm—流動(dòng)相遷移距離，cm.

在一定的條件下，同一核普酸的R。值是一定的。但由于影響R，值的因素較多，一般都采用與對(duì)照

樣品對(duì)比，即根據(jù)樣品與對(duì)照樣品在層析譜中R，值來進(jìn)行鑒別，并可在254nm的紫外燈下觀察，以顯

示出雜質(zhì)斑點(diǎn)的多少和色量來確定樣品的純度。也可剪下斑點(diǎn)，溶于特定溶劑，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定

吸光度，并計(jì)算樣品的含量和雜質(zhì)的含量。

6.1.2試劑及材料

6.1.2.1對(duì)照樣品

紙層析和薄層層析所用的對(duì)照樣品，主體含量不少于98.0%.

6.1-2.2層析用紙

層析用紙是指具有一定強(qiáng)度、質(zhì)地均勻平整的純棉漿制成的撼紙。紙的裁切方向應(yīng)使流動(dòng)相能順著

紋理方向移動(dòng)。.定性用的層析診紙灰分須小于0.1%，一般可選用新華一號(hào)層析濾紙。

6.，.2.3展開劑

展開劑可參照附錄B(參考件)之規(guī)定，使用前制備.

必要時(shí)可選用其他展開劑。

6.1.2.4展開室

可選用大小適宜的標(biāo)本缸。

6.，.3操作步驟

取新華一號(hào)層析濾紙，長30cm，離底邊2cm處用鉛筆劃一條直線，在直線兩端2cm處開始點(diǎn)樣，

點(diǎn)與點(diǎn)之間距離為2cm，點(diǎn)樣擴(kuò)散的直徑不超過0.5cm.同一張層析紙上可點(diǎn)數(shù)個(gè)樣品，紙的寬度取決

于樣品的數(shù)目，井留有點(diǎn)對(duì)照樣品的位置。

稱取。.005g核昔酸樣品，精確至0.0001g,溶于0.5mL水或鹽酸溶液Cc(HCl)=0.01mol/L),

必要時(shí)稍微加熱溶解。用微量進(jìn)樣器或徽量吸管點(diǎn)樣，每次點(diǎn)樣后須用冷風(fēng)吹干，點(diǎn)樣量按檢測(cè)要求不

少于5uL，即相當(dāng)于50fag樣品。

核昔酸紙層析一般采用上行。將已吹干后的層析紙兩邊卷成圖筒狀，用二根塑料絲上下固定。在一

高為36cm的標(biāo)本缸內(nèi)平放一培養(yǎng)皿，內(nèi)盛高度為。.5cm的展開劑，將層析紙置于缸內(nèi)以展開劑的飽

和蒸氣平衡2^-4h后，將樣品端朝下放入培養(yǎng)皿中，蓋緊玻璃蓋。展開1216h,流動(dòng)相前沿即可上升

2628cm,此時(shí)將層析紙取出晾干或在50℃干燥。

6.1.4觀察吸收斑點(diǎn)

GB/T15356一94

將除去展開劑后的層析紙，在254ran的紫外燈下觀察，即觀察出紫外吸收斑點(diǎn)。

6.，.5結(jié)果的確定

6.1.5.1以50pg點(diǎn)樣量，按規(guī)定展開并在紫外燈下觀察，只觀察出一個(gè)紫外吸收斑點(diǎn)，且與對(duì)照樣品

的R，值一致，即可確定其層析試驗(yàn)為合格。

6.1.5.2以50lag點(diǎn)樣量，按規(guī)定展開并在紫外燈下觀察，除顯示出一個(gè)斑點(diǎn)外，其他核昔酸的斑點(diǎn)小

于或等于按產(chǎn)品規(guī)格制備的雜質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)的斑點(diǎn)時(shí)，即可確定含其他核昔酸小于或等于標(biāo)準(zhǔn)。

6.2薄層層析

6.2.，方法原理

薄層層析是一種將吸附劑均勻地鋪在一塊玻璃板上形成一薄層，在此薄層上進(jìn)行色層分離的一種

層析法，按分離機(jī)理可以分為吸附、分配、離子交換、凝膠過癮等法。本標(biāo)準(zhǔn)主要使用吸附薄層層析法。

6.2.2試劑及材料

6.2.2.1對(duì)照樣品

應(yīng)符合6.1.2.1條之規(guī)定。

6.2.2.2硅膠GF

本品系白色均勻細(xì)粉及螢光粉，粒度平均在10^40jAm之間，含有約13%的半水合硫酸鈣。本品應(yīng)

附合下列分離要求:各取。.040g二甲基黃、蘇丹.、靛酚藍(lán)，溶于100mL苯中。取2WL，點(diǎn)樣于按

6.2.3.1條之規(guī)定制備的硅膠GF板上，用苯展開10cm，色譜圖應(yīng)顯示三個(gè)清晰的分離斑點(diǎn)，靛酚藍(lán)斑

點(diǎn)接近于起始點(diǎn)，二甲基黃在色譜圖的中央，蘇丹，介于二者之間。

6.2-2.3展開劑

通常選用正丁醇+丙酮+冰乙酸+500氨水+水=7+5+3十3+2(體積比)。必要時(shí)可選用其他展

開劑。可參照附錄B(參考件)或其他文獻(xiàn)。

6.2.3操作步驟

6.2.3.1制板

制備薄層板所用的玻璃板必需表面光滑，清潔，其大小可根據(jù)需要選擇。小的可用載玻片，大的可裁

成20cmX20cm的玻璃片。

取一定量的吸附劑(硅膠GF可按25^30g加60^65mL水)在研缽中加水調(diào)成糊狀，按玻璃板的

尺寸取一定量的吸附劑糊均勻地鋪成一厚度為。.2-0.3mm的薄層。若使用涂鋪器可按制造廠商推薦

的方法涂鋪。鋪成的薄層須置于水平臺(tái)上室溫干燥過夜。硅膠GF制板的時(shí)間從調(diào)成糊狀到鋪板不應(yīng)超

過1.5min,

市售的預(yù)制板經(jīng)6.2.2.2條試驗(yàn)，符合分離要求的，亦可使用。

6.2-3.2點(diǎn)樣和展層

取薄層板一塊，距底邊1.5cm處為基線點(diǎn)樣，點(diǎn)與點(diǎn)之間的距離為1.5cm，點(diǎn)樣擴(kuò)散的直徑不超

過。.2cm，點(diǎn)與點(diǎn)之間距離可視斑點(diǎn)擴(kuò)散情況以不影響檢出為宜。

稱取0.004g核昔酸樣品，精確至0.0001g,溶于0.2mL水或鹽酸溶液〔c(HCI)二0.01mol/L),

必要時(shí)稍微加熱溶解，用微量進(jìn)樣器或微量吸管點(diǎn)樣，如要多次點(diǎn)樣時(shí)，可用冷風(fēng)將前一次點(diǎn)樣吹干后，

再點(diǎn)下一次樣，點(diǎn)樣量按檢測(cè)要求不少于2KL，即相當(dāng)于20yg樣品，點(diǎn)樣時(shí)必須注意勿損傷薄層表面。

薄層層析可選用大小適宜的標(biāo)本缸，將已點(diǎn)樣的薄層板平衡后，將樣品端朝下放人培養(yǎng)皿中，薄層

板浸人展開劑的深度不超過0.5cm，上行至流動(dòng)相前沿離頂端。.5-1.0cm處(展開距離一般在15-

20cm)取出晾干，在50℃干燥除去溶劑。

6.2.4觀察吸收斑點(diǎn)

應(yīng)符合6.1.4條之規(guī)定。

6.2.5結(jié)果的確定

應(yīng)符合6.1.5.1及6.1.5.2條之規(guī)定。

GB/T15356一94

7含里的測(cè)定

按GB/T9721之規(guī)定，其中:

了.1測(cè)定條件

波長:用樣品所需的最大吸收波長;

吸收池厚度:1cm;

參比溶液:水或鹽酸溶液〔c(HC1)=0.1mol/L〕或鹽酸溶液〔c(HCI)=0.01mol/LJ.

72測(cè)定方法

稱取10mg樣品，精確至。.00001g，用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液〔c(HCI)=0.1mol/L〕或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液〔。

(HCI)二。.01mol/L)溶解，轉(zhuǎn)移至1。。。mL容量瓶中，稀釋至刻度，搖勻。按測(cè)定條件7.1條之規(guī)定，

測(cè)定吸光度。

7.3

式中

結(jié)果的計(jì)算

核昔酸的含量按式(2)計(jì)算:

Ale.M·1000

bxC

X100

二‘二，.”，·····??(2)

x—核昔酸的質(zhì)量百分含量，YD;

A—核普酸樣品在最大吸收波長處的吸光度;

?！似账針悠返哪栁障禂?shù)，L/cm"mot,

M—核昔酸樣品的相對(duì)分子質(zhì)量;

b—吸收池厚度,cm;

C-溶液濃度，mg/L;

1。。。—換算系數(shù)。

8千操失重

稱取。.1g樣品，精確至0.0001gp置于已在10512℃干燥至恒重的稱量瓶中.于105士2℃的電烘

箱中干燥至恒重。

干燥失重按式((3)計(jì)算:

x=m,-m2X100

叨1

·，，··??“.·..······??(3)

式中:x—干燥失重，%;

I'-恒重前樣品的質(zhì)量，9;

M,—恒重后樣品的質(zhì)量，9。

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附錄A

部分核昔酸的比旋光度、熔點(diǎn)和率爾吸收系數(shù)

(參考件)

表A1

中文名稱

英文名稱

(縮寫)

相對(duì)

分子質(zhì)量

熔點(diǎn)，'C(,1

比旋光度

Ca7o

摩爾吸收系數(shù),LA.·mol

pHA.-,n.pm..X10'

腺嗦嶺核普一5憶碑酸(5'-

腺普酸)

adenosine-5'-

monophosphate

(5'-AMP)

347.22196-200

一460~一480

C=5,INNaOH

225715.1

鳥頤嶺核昔-5'-磷酸(5'-

鳥昔酸)

guanosine-5'-

monophosphate

(5'-GMP)

363.24190-200d125612.2

胞啥呢核昔-5‘一磷酸(5'-

胞昔酸)

cytidine-5'-

monophosphate

(5'-CMP)

323.20233d

+27.10

C=O.5,HpO

228013.2

尿啥PA核昔一5‘一碑酸(5，-

尿昔酸)

uridine-5'-

monophosphate

(5'-UMP)

324.19198.5226210.0

腺嗦嶺核普-5，一二磷酸

(5‘一腺昔二磷酸)

adenosine-5'-

diphosphate(5'-

ADP)

427.212

25715.0

腺嗦吟核昔一5‘一三磷酸

(5‘一腺昔三碑酸)

adenosine-5'-

triphosphate(5'-

ATP)

507.192257

14.7

腺嗦吟脫氧核昔-5‘一磷酸

(5，一腺嗦吟脫氧核昔酸)

adeninedeoxyri-

bose-5'-phos-

phate(5'-dAMP)

331.22

-38.00

C=O.2,H,0

225814.8

鳥嗦吟脫氧核昔-5，一礴酸

(5，一鳥頤嶺脫氧核昔酸)

guaninedeoxyri-

bose-5'-phos-

phate(5'-dGMP)

347.23

一31.0'

C=0.4,H,O

1255

11.8

胞啥9T脫氧核普一5‘一磷酸

(5，一胞哈陡脫筑核昔酸)

cytosinedeoxyri-

bose-5'-phos-

phate(5'-dCMP)

307.20183^-184

+38.60

C=1.2,H,O

1.527913.0

胸腺啥Q脫氧核昔一‘一碑

酸(5‘一胸腺啥咤脫氧核普

酸)

thymidine-5'-

phosphate(5'-

dTMP)

322.21175

一4.40

C=4.H,O

7

2679.6

鳥嗦吟核昔一5，一二磷酸

(5‘一鳥昔二磷酸)

guanosine-5'-

diphosphate(5'-

GDP)

443.21

1

25612.3

2R0

GB/T15356一94

續(xù)表A1

摩爾吸收系數(shù),L/cm·mol

中文名稱

英文名稱

(縮寫)

相對(duì)

分子質(zhì)量

熔點(diǎn).℃‘”

比旋光度

[a習(xí)D

PHIA...,nmIft..X10'

12.4

12.8

256-280

鳥嗦吟核普-5'-三磷酸

(5‘一鳥普三確酸)

523.19

胞啥咤核昔一5，一二碑酸

(5‘一胞昔二磷酸)

403.18

胞哈陡核昔一5，一三碑酸

(5‘一胞普三磷酸)

483.1628012.8

262.-、一256

尿心陡核昔-5，一二磷酸

(5‘一尿昔二碑酸)

404.1710.0

尿啼吮核昔-5'一三磷酸

(5，一尿普三碑酸)

484.1510.0

腺嗦吟核昔-3