《疫學(xué)基本知識(shí)》PPT課件.ppt

1、免疫學(xué)基本知識(shí),抗原的概念,抗原(antigen，Ag)是指能刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答并能與應(yīng)答產(chǎn)生的抗體或致敏淋巴細(xì)胞發(fā)生特異反應(yīng)的物質(zhì)。一個(gè)完整的抗原應(yīng)包括兩方面的免疫性質(zhì)：免疫原性(immunogenicity)指誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生免疫應(yīng)答的能力，具有這種能力的物質(zhì)稱為免疫原(immunogen)；,抗原的概念,反應(yīng)原性(immunoreactivity)指抗原與抗體或致敏淋巴細(xì)胞發(fā)生特異性結(jié)合的能力，亦稱為反應(yīng)原性。有些物質(zhì)在獨(dú)立存在時(shí)只具有反應(yīng)原性而無(wú)免疫原性，稱為半抗原(hapten)；而免疫原通常同時(shí)具有免疫反應(yīng)能力。,抗體的概念,抗原刺激機(jī)體，產(chǎn)生免疫學(xué)反應(yīng)，由機(jī)體的漿細(xì)胞合成并

2、分泌的與抗原有特異性結(jié)合能力的一組球蛋白，這就是免疫球蛋白，這種與抗原有特異性結(jié)合能力的免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)就是抗體。 Ig由漿細(xì)胞產(chǎn)生，存在于血液和其他體液（包括組織液和外分泌液）中，約占血漿蛋白總量的20；還可分布在B細(xì)胞表面。,抗體的概念,抗原通常是由多個(gè)抗原決定簇組成的，由一種抗原決定簇刺激機(jī)體，由一個(gè)B淋巴細(xì)胞接受該抗原所產(chǎn)生的抗體稱之為單克隆抗體（Monclone antibody）。由多種抗原決定簇刺激機(jī)體，相應(yīng)地就產(chǎn)生各種各樣的單克隆抗體，這些單克隆抗體混雜在一起就是多克隆抗體，機(jī)體內(nèi)所產(chǎn)生的抗體就是多克隆抗體；除了抗原決定簇的多樣性以外，同樣一類抗

3、原決定簇，也可刺激機(jī)體產(chǎn)生IgG、IgM、IgA、IgE和IgD等五類抗體。,免疫應(yīng)答,免疫應(yīng)答（immuneresponse）是機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)抗原刺激所產(chǎn)生的以排除抗原為目的的生理過(guò)程。這個(gè)過(guò)程是免疫系統(tǒng)各部分生理功能的綜合體現(xiàn)，包括了抗原遞呈、淋巴細(xì)胞活化、免疫分子形成及免疫效應(yīng)發(fā)生等一系列的生理反應(yīng)。,免疫應(yīng)答,通過(guò)有效的免疫應(yīng)答，機(jī)體得以維護(hù)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定,免疫應(yīng)答的基本過(guò)程,抗原識(shí)別階段（antigen-recogniting phase）是抗原通過(guò)某一途徑進(jìn)入機(jī)體，并被免疫細(xì)胞識(shí)別、遞呈和誘導(dǎo)細(xì)胞活化的開(kāi)始時(shí)期，又稱感應(yīng)階段。一般，抗原進(jìn)入機(jī)體后，首先被局部的單核巨噬細(xì)胞或其他輔佐細(xì)

4、胞吞噬和處理，然后以有效的方式（與MHC類分子結(jié)合）遞呈給TH細(xì)胞。 (TO BE CONTINUE）,免疫應(yīng)答的基本過(guò)程,B細(xì)胞可以利用其表面的免疫球蛋白分子直接與抗原結(jié)合，并且可將抗原遞呈給TH細(xì)胞。T細(xì)胞與B細(xì)胞可以識(shí)別不同種類的抗原，所以不同的抗原可以選擇性地誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答或抗體免疫應(yīng)答，或者同時(shí)誘導(dǎo)兩種類型的免疫應(yīng)答。 （TO BE CONTINUE）,免疫應(yīng)答的基本過(guò)程,另一方面，一種抗原顆?；蚍肿悠慰赡芎卸喾N抗原表位，因此可被不同克隆的細(xì)胞所識(shí)別，誘導(dǎo)多種特異性的免疫應(yīng)答。 (TO BE CONTINUE）,免疫應(yīng)答的類型,按參與細(xì)胞分類： 根據(jù)主導(dǎo)免疫應(yīng)答的活性細(xì)胞類型，

5、可分為細(xì)胞介導(dǎo)免疫和體液免疫兩大類。T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，簡(jiǎn)稱為細(xì)胞免疫，體液免疫是B細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，也可稱抗體應(yīng)答，以血清中出現(xiàn)循環(huán)抗體為特征。 （TO BE CONTINUE）,免疫應(yīng)答的類型,按抗原刺激順序分類： 某抗原初次刺激機(jī)體與一定時(shí)期內(nèi)再次或多次刺激機(jī)體可產(chǎn)生不同的應(yīng)答效果。據(jù)此可分為初次應(yīng)答和再次應(yīng)答兩類。一般地說(shuō)，不論是細(xì)胞免疫還是體液免疫，初次應(yīng)答比較緩慢柔和，再次應(yīng)答則較快速激烈。 （TO BE CONTINUE）,免疫應(yīng)答的類型,按應(yīng)答效果分類： 一般情況下，免疫應(yīng)答的結(jié)果是產(chǎn)生免疫分子或效應(yīng)細(xì)胞，具有抗感染、抗腫瘤等對(duì)機(jī)體有利的效果，稱為免疫保護(hù)；但在另一些條件下

6、，過(guò)度或不適宜的免疫應(yīng)答也可導(dǎo)致病理?yè)p傷，稱為超敏反應(yīng)，包括對(duì)自身抗原應(yīng)答產(chǎn)生的自身免疫病。與此相反，特定條件下的免疫應(yīng)答可不表現(xiàn)出任何明顯效應(yīng)，稱為免疫耐受。 （TO BE CONTINUE）,免疫應(yīng)答的類型,另外，在免疫系統(tǒng)發(fā)育不全時(shí)，可表現(xiàn)出某一方面或全面的免疫缺陷；而免疫系統(tǒng)的病理性增生而稱為免疫增殖病。,免疫應(yīng)答間的關(guān)系,免疫學(xué)技術(shù),抗原抗體反應(yīng),抗原抗體反應(yīng)(antigen-antibody reaction) 是指抗原與相應(yīng)抗體之間所發(fā)生的特異性結(jié)合反應(yīng)?？砂l(fā)生于體內(nèi)（invivo），也可發(fā)生于體外(invitro)。體內(nèi)反應(yīng)可介導(dǎo)吞噬、溶菌、殺菌、中和毒素等作用；體外反應(yīng)則根據(jù)

7、抗原的物理性狀、抗體的類型及參與反應(yīng)的介質(zhì)（例如電解質(zhì)、補(bǔ)體、固相載體等）不同，可出現(xiàn)凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)、補(bǔ)體參與的反應(yīng)及中和反應(yīng)等各種不同的反應(yīng)類型。因抗體主要存在于血清中，在抗原或抗體的檢測(cè)中多采用血清作試驗(yàn)，所以體外抗原抗體反應(yīng)亦稱為血清反應(yīng)（serologicreaction）。,第一節(jié)抗原抗體反應(yīng)的原理,抗原抗體反應(yīng)可分為兩個(gè)階段。 第一為抗原與抗體發(fā)生特異性結(jié)合的階段，此階段反應(yīng)快，僅需幾秒至幾分鐘，但不出現(xiàn)可見(jiàn)反應(yīng)。 第二為可見(jiàn)反應(yīng)階段，抗原抗體復(fù)合物在環(huán)境因素（如電解質(zhì)、pH、溫度、補(bǔ)體）的影響下，進(jìn)一步交聯(lián)和聚集，表現(xiàn)為凝集、沉淀、溶解、補(bǔ)體結(jié)合介導(dǎo)的生物現(xiàn)象等肉眼可見(jiàn)的反應(yīng)

8、。此階段反應(yīng)慢，往往需要數(shù)分鐘至數(shù)小時(shí)。 實(shí)際上這兩個(gè)階段難以嚴(yán)格區(qū)分，而且兩階段的反應(yīng)所需時(shí)間亦受多種因素和反應(yīng)條件的影響，若反應(yīng)開(kāi)始時(shí)抗原抗體濃度較大且兩者比較適合，則很快能形成可見(jiàn)反應(yīng)。,第二節(jié)抗原抗體反應(yīng)的特點(diǎn),（一）特異性 抗原抗體的結(jié)合實(shí)質(zhì)上是抗原表位與抗體超變區(qū)中抗原結(jié)合點(diǎn)之間的結(jié)合。由于兩者在化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型上呈互補(bǔ)關(guān)系，所以抗原與抗體的結(jié)合具有高度的特異性。這種特異性如同鑰匙和鎖的關(guān)系。 例如白喉抗毒素只能與相應(yīng)的外毒素結(jié)合，而不能與破傷風(fēng)外毒素結(jié)合。 較大分子的蛋白質(zhì)常含有多種抗原表位。如果兩種不同的抗原分子上有相同的抗原表位，或抗原、抗體間構(gòu)型部分相同，皆可出現(xiàn)交叉反應(yīng)

9、。,（二）按比例,在抗原抗體特異性反應(yīng)時(shí)，生成結(jié)合物的量與反應(yīng)物的濃度有關(guān)。無(wú)論在一定量的抗體中加入不同量的抗原或在一定量的抗原中加入不同量的抗體，均可發(fā)現(xiàn)只有在兩者分子比例合適時(shí)才出現(xiàn)最強(qiáng)的反應(yīng)。 以沉淀反應(yīng)為例，若向一排試管中中入一定量的抗體，然后依次向各管中加入遞增量的相應(yīng)可溶性抗原，根據(jù)所形成的沉淀物及抗原抗體的比例關(guān)系可繪制出反應(yīng)曲線（圖1）。,圖1沉淀反應(yīng)中沉淀量與抗原抗體的比例關(guān)系 Ag：抗原；Ab：抗體,從圖中可見(jiàn)，曲線的高峰部分是抗原抗體分子比例合適的范圍，稱為抗原抗體反應(yīng)的等價(jià)帶（zoneofequivalence）。在此范圍內(nèi)，抗原抗體充分結(jié)合，沉淀物形成快而多。其中有一

10、管反應(yīng)最快，沉淀物形成最多，上清液中幾乎無(wú)游離抗原或抗體存在，表明抗原與抗體濃度的比例最為合適，稱為最適比（optimalratio）。 在等價(jià)帶前后分別為抗體過(guò)剩則無(wú)沉淀物形成，這種現(xiàn)象稱為帶現(xiàn)象（zonephenomenon）。出現(xiàn)在抗體過(guò)量時(shí)，稱為前帶（prezone），出現(xiàn)在抗原過(guò)剩時(shí)，稱為后帶（postzone）。,在用沉淀反應(yīng)對(duì)不同來(lái)源的抗血清進(jìn)行比較后，發(fā)現(xiàn)抗體可按等價(jià)帶范圍大小分為兩種類型，即R型抗體和H型抗體。R型抗體以家兔免疫血清為代表，具有較寬的抗原抗體合適比例范圍，只在抗原過(guò)量時(shí)，才易出現(xiàn)溶性免疫復(fù)合物，大多數(shù)動(dòng)物的免疫血均屬此型。H型抗體以馬免疫血清為代表，其抗原與抗

11、體的合適比例范圍較窄，抗原或抗體過(guò)量，均可形成可溶性免疫復(fù)合物。人和許多大動(dòng)物的抗血清皆屬H型。,（三）可逆性,抗原抗體反應(yīng)遵循生物大分子熱動(dòng)力學(xué)反應(yīng)原則，其反應(yīng)式為： Ab-AgAb.Ag=k1/k2=k 式中各反應(yīng)項(xiàng)的單位以mol表示，k1表示反應(yīng)速度常數(shù)，k2為逆反應(yīng)速度常數(shù)，K是反應(yīng)平衡時(shí)的速度常數(shù)。由上式可知，K值是反映抗原抗體間結(jié)合能力的指示，所以抗體親和力通常以K值表示。,（三）可逆性,抗原抗體復(fù)合物解離取決于兩方面的因素，一是抗體對(duì)相應(yīng)抗原的親和力；二是環(huán)境因素對(duì)復(fù)合物的影響。 反之，低親和性抗體與抗原形成的復(fù)合物較易解離。解離后的抗原或抗體均能保持未結(jié)合前的結(jié)構(gòu)、活性及特異性

12、。,（三）可逆性,在環(huán)境因素中，凡是減弱或消除抗原抗體親和力的因素都會(huì)使逆向反應(yīng)加快，復(fù)合物解離增加。如pH改變，過(guò)高或過(guò)低的pH值均可破壞離子間電引力消失。對(duì)親合力本身較弱的反應(yīng)體系而言，僅增加離子強(qiáng)度即可解離抗原抗體復(fù)合物的目的；增加溫度可增加分子間的熱動(dòng)能，加速已結(jié)合的復(fù)合物的解離，但由于溫度變化易致蛋白變性，所以實(shí)際工作中極少應(yīng)用。改變pH和離子強(qiáng)度是最常用的促解離方法，免疫技術(shù)中的親和層析就是以此為根據(jù)純化抗原或抗體。,影響抗原抗體反應(yīng)的因素,（一）電解質(zhì) 抗原與抗體發(fā)生特異性結(jié)合后，雖由親水膠體變?yōu)槭杷z體，若溶液中無(wú)電解質(zhì)參加，仍不出現(xiàn)可見(jiàn)反應(yīng)。為了促使沉淀物或凝集物的形成，常用

13、0.85氯化鈉或各種緩沖液作為抗原及抗體的稀釋液。由于氯化鈉在水溶液中解離成Na+和C1，可分別中和膠體粒子上的電荷，使膠體粒子的電勢(shì)下降。當(dāng)電勢(shì)降至臨界電勢(shì)（1215mV）以下時(shí)，則能促使抗原抗體復(fù)合物從溶液中析出，形成可見(jiàn)的沉淀物或凝集物。,影響抗原抗體反應(yīng)的因素,（二）酸堿度 抗原抗體反應(yīng)必須在合適的pH環(huán)境中進(jìn)行。蛋白質(zhì)具有兩性電離性質(zhì)，因此每種蛋白質(zhì)都有固定的等電點(diǎn)?？乖贵w反應(yīng)一般在pH為68進(jìn)行。pH過(guò)高或過(guò)低都將影響抗原與抗體的理化性質(zhì)，例如pH達(dá)到或接近抗原的等電點(diǎn)時(shí)，即使無(wú)相應(yīng)抗體存在，也會(huì)引起顆粒性抗原非特異性的凝集，造成假陽(yáng)性反應(yīng)。,（三）溫度,在一定范圍內(nèi)，溫度升高可

14、加速分子運(yùn)動(dòng)，抗原與抗體碰撞機(jī)會(huì)增多，使反應(yīng)加速。但若溫度高于56時(shí)，可導(dǎo)致已結(jié)合的抗原抗體再解離，甚至變性或破壞；在40時(shí)，結(jié)合速度慢，但結(jié)合牢固，更易于觀察。常用的抗原抗體反應(yīng)溫度為37。每種試驗(yàn)都有其獨(dú)特的最適反應(yīng)溫度，例如冷凝集素在4 左右與紅細(xì)胞結(jié)合最好，20以上反而解離。 此外，適當(dāng)振蕩也可促進(jìn)抗原抗體分子的接觸，加速反應(yīng)。,沉淀反應(yīng),沉淀反應(yīng)是指可溶性抗原（細(xì)菌培養(yǎng)濾液、細(xì)胞或組織的浸出液、血清蛋白等）與相應(yīng)抗體在液相中特異結(jié)合后，形成的免疫復(fù)合物受電解質(zhì)影響出現(xiàn)的沉淀現(xiàn)象。反應(yīng)中的抗原稱為沉淀原（precipitinogen），可以是類脂、多糖或蛋白質(zhì)等；抗體稱為沉淀素（pre

15、cipitin）。,第一節(jié)液體內(nèi)沉淀試驗(yàn),一、絮狀沉淀試驗(yàn) 將抗原與抗體溶液混合在一起，在電解質(zhì)存在下，抗原與抗體結(jié)合，形成絮狀沉淀物。這種沉淀試驗(yàn)受到抗原和抗體比例的直接影響，因而產(chǎn)生了兩種最適比例的基本測(cè)定方法。,（一）抗原稀釋法,將可溶性抗原作一系列稀釋，與恒定濃度的抗血清等量混合，置室溫或37反應(yīng)后，產(chǎn)生的沉淀物隨抗原的變化而不同。 （二）抗體稀釋法（Ramon）法 用恒定的抗原量與不同程度稀釋的抗體反應(yīng) 二、環(huán)狀沉淀試驗(yàn),第二節(jié)凝膠內(nèi)沉淀試驗(yàn),用可溶性抗原和相應(yīng)抗體在凝膠中擴(kuò)散，形成濃度梯度，在抗原與抗體濃度比例恰當(dāng)?shù)奈恢眯纬扇庋劭梢?jiàn)的沉淀線或沉淀環(huán)。,一、單向擴(kuò)散試驗(yàn),是在瓊脂膠中

16、混入一定量抗體，使待測(cè)的抗原溶液從局部向瓊脂內(nèi)自由擴(kuò)散，在一定區(qū)域內(nèi)形成可見(jiàn)的沉淀環(huán)。 可分為試管法和平板法兩種,（二）平板法,是目前最常用的簡(jiǎn)易抗原定量技術(shù)，其要點(diǎn)是： 將抗體或抗血清混入0.9瓊脂糖內(nèi)（約50），未凝固前傾注成平板，凝固后在瓊脂板上打孔（一般直徑約35mm），孔中加入抗原溶液，放室溫或37讓其向四周擴(kuò)散，2448h后可見(jiàn)周圍出現(xiàn)沉淀環(huán) 由于試驗(yàn)中抗原向四周擴(kuò)散，故又稱單向輻射狀免疫擴(kuò)散 單向瓊脂免疫擴(kuò)散法作為抗原的定量方法，其重復(fù)性和線性皆是可信賴的，唯敏感度稍差（不能測(cè)g/ml以下含量）。,二、雙向擴(kuò)散試驗(yàn),在瓊脂內(nèi)抗原和抗體各自向?qū)Ψ綌U(kuò)散，在最恰當(dāng)?shù)谋壤幮纬煽乖贵w沉

17、淀線，觀察這種沉淀線的位置、形狀以及對(duì)比關(guān)系，可作出對(duì)抗原或抗體的定性分析。雙向擴(kuò)散也可分為試管法和平板法兩種方法。,免疫電泳技術(shù),免疫電泳技術(shù)是電泳分析與沉淀反應(yīng)的結(jié)合產(chǎn)物。這種技術(shù)有兩大優(yōu)點(diǎn)，一是加快了沉淀反應(yīng)的速度，二是將某些蛋白組分利用其帶電荷的不同而將其分開(kāi)，再分別與抗體反應(yīng)，以此作更細(xì)微的分析,一、免疫電泳 二、對(duì)流免疫電泳 三、火箭免疫電泳 四、免疫固定電泳 經(jīng)典的沉淀試驗(yàn)有4個(gè)缺點(diǎn)無(wú)法克服，即操作繁瑣、敏感度低（10100g/ml）、時(shí)間長(zhǎng)和難以自動(dòng)化。,凝集反應(yīng),凝集作用（反應(yīng)）（agglutination）:特異性抗體引起抗原顆粒凝集或形成塊狀的作用（反應(yīng)） 。 凝集素（a

18、gglutinin）: 凝集素即凝集抗體。在凝集反應(yīng)中與顆粒性抗原起反應(yīng)的抗體。 凝集原（agglutinogen）: 在凝集反應(yīng)中，刺激凝集素產(chǎn)生或與抗體反應(yīng)的抗原，這種抗原通常是顆粒性抗原。,凝集反應(yīng)的特點(diǎn),凝集反應(yīng)的發(fā)生分兩階段： 抗原抗體的特異結(jié)合； 出現(xiàn)可見(jiàn)的顆粒凝集。 凝集試驗(yàn)是一個(gè)定性的檢測(cè)方法，也可以進(jìn)行半定量檢測(cè)， 凝集試驗(yàn)靈敏度高，方法簡(jiǎn)便。,凝集反應(yīng),凝集反應(yīng)可分為 直接凝集反應(yīng)； 間接凝集反應(yīng)； 自身紅細(xì)胞凝集試驗(yàn) 抗球蛋白參與的凝集試驗(yàn),是兩種特殊的凝集反應(yīng),第二節(jié)直接凝集反應(yīng),細(xì)菌、螺旋體和紅細(xì)胞等顆?？乖?，在適當(dāng)電解質(zhì)參與下可直接與相應(yīng)抗體結(jié)合出現(xiàn)凝集，稱為直接凝

19、集反應(yīng)（direct agglutination）。常用的凝集試驗(yàn)有玻片法和試管法兩種。,（一）玻片凝集試驗(yàn),玻片凝集試驗(yàn)為定性試驗(yàn)方法，一般用已知抗體作為診斷血清、與受檢顆?？乖缇夯蚣t細(xì)胞懸液各加一滴在玻片上，混勻，數(shù)分鐘后即可用肉眼觀察凝集結(jié)果，出現(xiàn)顆粒凝集的為陽(yáng)性反應(yīng)。 此法簡(jiǎn)便、快速，適用于從病人標(biāo)本中分離得到的菌種的診斷或分型。玻片法還用于紅細(xì)胞ABO血型的鑒定。,（二）試管凝集試驗(yàn),為半定量試驗(yàn)方法， 常用已知細(xì)菌作為抗原液與一系列稀釋的受檢血清混合，保溫后觀察每管內(nèi)抗原凝集程度，通常以產(chǎn)生明顯凝集現(xiàn)象的最高稀釋度作為血清中抗體的效價(jià)，亦稱為滴度。 在試驗(yàn)中，由于電解質(zhì)濃度和p

20、H不適當(dāng)?shù)仍?，可引起抗原的非特異性凝集，出現(xiàn)假陽(yáng)性反應(yīng)，因此必須設(shè)不加抗體的稀釋液作對(duì)照組。 常用的直接試管凝集試驗(yàn)為肥達(dá)試驗(yàn)（Widal test）和外斐試驗(yàn)（Weil-Felix test）。,第三節(jié)間接凝集反應(yīng),將可溶性抗原（或抗體）先吸附于適當(dāng)大小的顆粒性載體的表面，然后與相應(yīng)抗體（或抗原）作用，在適宜的電解質(zhì)存在的條件下，出現(xiàn)特異性凝集現(xiàn)象，稱間接凝集反應(yīng)（indirectagglutination）或被動(dòng)凝集反應(yīng)（passiveagglutination）。 其敏感度高于沉淀反應(yīng),一、間接凝集反應(yīng)的類型,1（正向）間接凝集反應(yīng)用抗原致敏載體以檢測(cè)標(biāo)本中的相應(yīng)抗體： （正向）間接凝

21、集反應(yīng)原理示意圖,（正向）間接凝集反應(yīng)原理示意圖,（正向）間接凝集反應(yīng)原理示意圖,2反向間接凝集反應(yīng),用特異性抗體致敏載體以檢測(cè)標(biāo)本中的相應(yīng)抗原。,反向間接凝集反應(yīng)原理示意圖,3間接凝集抑制反應(yīng),診斷試劑為抗原致敏的顆粒載體及相應(yīng)的抗體，用于檢測(cè)標(biāo)本中是否存在與致敏抗原相同的抗原。 檢測(cè)方法為將標(biāo)本先與抗體試劑作用，然后再加入致敏的載體，若出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，說(shuō)明標(biāo)本中不存在相同抗原，抗體試劑未被結(jié)合，因此仍與載體上的抗原起作用。如標(biāo)本中存在相同抗原，則凝集反應(yīng)被抑制。 可用抗體致敏的載體及相應(yīng)的抗原作為診斷試劑，以檢測(cè)標(biāo)本中的抗體，此時(shí)稱反向間接凝集抑制反應(yīng)。,間接凝集抑制反應(yīng)原理示意圖 A：標(biāo)本

22、中含抗原B：標(biāo)本中不含抗原,4協(xié)同凝集反應(yīng),協(xié)同凝集反應(yīng)（coaggoltination）與間接凝集反應(yīng)的原理相類似，但所用載體是一種金黃色葡萄球菌。它的菌體細(xì)胞壁中含有A蛋白（staphylococcusprotienA，SPA）。SPA具有與IgG的Fc段結(jié)合的特性，因此當(dāng)這種葡萄球菌與IgG抗體連接時(shí)，就成為抗體致敏的顆粒載體。如與相應(yīng)抗原接觸，即出現(xiàn)反向間接凝集反應(yīng)。 協(xié)同凝集反應(yīng)也適用于細(xì)菌的直接檢測(cè)。,中和反應(yīng),細(xì)菌外毒素或病毒與相應(yīng)抗體結(jié)合所致的中和反應(yīng) (neutralization)中和試驗(yàn)是免疫學(xué)和病毒學(xué)中常用的一種抗原抗體反應(yīng)試驗(yàn)方法，用以測(cè)定抗體，中和病毒感染性或細(xì)菌毒

23、素的生物學(xué)效應(yīng)。凡能與病毒結(jié)合，使其失去感染力的抗體又稱中和抗體。能與細(xì)菌外毒素結(jié)合，中和其毒性作用的抗體稱為抗毒素。中和試驗(yàn)可以在敏感動(dòng)物體內(nèi)(包括雞胚)，體外組織(細(xì)胞)培養(yǎng)或試管內(nèi)進(jìn)行。觀察特異性抗體能否保護(hù)易感的試驗(yàn)動(dòng)物死亡，能否抑制病毒的細(xì)胞病變效應(yīng)或中和毒素對(duì)細(xì)胞的毒作用；以及測(cè)定抗體的其他生物學(xué)效應(yīng)。,免疫標(biāo)記技術(shù),經(jīng)典的三大標(biāo)記技術(shù)：熒光抗體技術(shù)、放射免疫分析和酶免疫技術(shù)。 首先被用作標(biāo)記免疫技術(shù)中標(biāo)記物的是熒光素； 放射性核素作為標(biāo)記物在免疫技術(shù)中的應(yīng)用又開(kāi)創(chuàng)了特異性的超微量測(cè)定； 酶用作免疫技術(shù)標(biāo)記物是從抗原定位開(kāi)始的。1966年Nakene和Pierce利用酶使底物顯色的

24、作用而得到與熒光抗體技術(shù)相似的結(jié)果。,酶免疫技術(shù),這種標(biāo)記免疫技術(shù)一般分為兩類，一類用于組織切片或其他標(biāo)本中抗原或抗體的定位，屬于免疫組化技術(shù)（immunohisto chemical technique）范疇， 另一類用于液體標(biāo)本中抗原或抗體的測(cè)定。稱為免疫測(cè)定（immunoassay）。,ELISA的原理和類型,基本原理： 1971年Engvall和Perlmann發(fā)表了酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）用于IgG定量測(cè)定的文章，使得1966年開(kāi)始用于抗原定位的酶標(biāo)抗體技術(shù)發(fā)展成液體標(biāo)本中微量物質(zhì)的測(cè)定方法。,ELISA的基

25、本原理,使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。 使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。,ELISA的基本原理,在測(cè)定時(shí)，把受檢標(biāo)本和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。 用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開(kāi)，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。 加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺刊物定性或定量分析。 由于酶的催化頻率很高，故可極大地地放大反應(yīng)效果，從而使測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感度。,E

26、LISA,有3種必要的試劑： 固相的抗原或抗體， 酶標(biāo)記的抗原或抗體， 酶作用的底物。,（一）雙抗體夾心法檢測(cè)抗原最常用的方法,（二）雙位點(diǎn)一步法,在雙抗體夾心法測(cè)定抗原時(shí)，如應(yīng)用針對(duì)抗原分子上兩個(gè)不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標(biāo)抗體，則在測(cè)定時(shí)可使標(biāo)本的加入和酶標(biāo)抗體的加入兩步并作一步簡(jiǎn)化了操作，縮短了反應(yīng)時(shí)間， 它應(yīng)用高親和力的單克隆抗體，測(cè)定的敏感性和特異性也顯著提高。,鉤狀效應(yīng),一步法測(cè)定中，應(yīng)注意鉤狀效應(yīng)（hook effect），類同于沉淀反應(yīng)中抗原過(guò)剩的后帶現(xiàn)象。當(dāng)標(biāo)本中待測(cè)抗原濃度相當(dāng)高時(shí)，過(guò)量抗原分別和固相抗體及酶標(biāo)抗體結(jié)合，而不再形成夾心復(fù)合物，所得結(jié)果將低

27、于實(shí)際含量。鉤狀效應(yīng)嚴(yán)重時(shí)甚至可出現(xiàn)假陰性結(jié)果。,（三）間接法測(cè)抗體是檢測(cè)抗體最常用的方法,（四）競(jìng)爭(zhēng)法可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體,（五）捕獲法測(cè)IgM抗體,血清中針對(duì)某些抗原的特異性IgM常和特異性IgG同時(shí)存在，后者會(huì)干擾IgM抗體的測(cè)定。因此測(cè)定IgM抗本多用捕獲法。,ELISA的技術(shù)要點(diǎn),（一）固相載體 最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后保留原來(lái)的免疫活性。 聚苯乙烯為塑料，可制成各種形式。 最常用的載體為微量反應(yīng)板， 國(guó)際通用的標(biāo)準(zhǔn)板形是812的96孔式。為便于作少量標(biāo)本的檢測(cè)，有制成8聯(lián)或12聯(lián)孔條的，放入座架后，大小與標(biāo)準(zhǔn)EL

28、ISA板相同。,ELISA的固相載體,好的ELISA板應(yīng)該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間和同一板各孔之間性能相近。 每一批號(hào)的聚苯乙烯制品在使用前須檢查其性能。常用的檢查方法為：以一定濃度的人IgG（一般為10ng/ml）包被ELISA板各孔后，每孔內(nèi)加入適當(dāng)稀釋的酶標(biāo)抗人IgG抗人IgG抗體，保溫后洗滌，加底物顯色，終止酶反應(yīng)后分別測(cè)每孔溶液的吸光度?？刂品磻?yīng)條件，使各讀數(shù)在0.8左右。計(jì)算所有讀數(shù)的平均值。所有單個(gè)讀數(shù)與平均讀數(shù)之差應(yīng)小于10。 與聚苯乙烯類似的塑料為聚氯乙烯。作為ELISA固相載體，聚氯乙烯板的特點(diǎn)為質(zhì)軟板薄，可切割，價(jià)廉、但光潔度不如聚苯乙烯板。,（二）

29、抗原和抗體,要求：抗原純度高，抗體效價(jià)高、親和力強(qiáng)。 抗原有三個(gè)來(lái)源： 天然抗原取材于動(dòng)物組織或體液、微生物培養(yǎng)物等，一般含有多種抗原成分，需經(jīng)純化。 重組抗原（recombinantantigen）和多肽抗原（peptideantigen）均為人工合成品，使用安全，而且純度高，干擾物質(zhì)少。,抗原和抗體,抗體有多克隆的和單克隆。 抗血清成分復(fù)雜，應(yīng)從中提取IgG才可用于包被固相或酶標(biāo)記。含單克隆抗體的小鼠腹水中的特異性抗體含量較高，有時(shí)可適當(dāng)稀釋后直接進(jìn)行包被。 制備酶結(jié)合物用的抗體的質(zhì)量往往要求有較高的純度。經(jīng)硫酸銨鹽析純化的IgG可進(jìn)一步用各種分子篩層析提純。也可用親和層析法提純。,（三）

30、免疫吸附劑,固相的抗原或抗體稱為免疫吸附劑。 抗原或抗體固相化的過(guò)程稱為包被(coating)。 通常將抗原或抗體溶于緩沖液（最常用的為pH9.6的碳酸緩沖液）中，加于ELISA板孔中在4過(guò)夜，經(jīng)清洗后即可應(yīng)用。,包被,如果包被液中的蛋白質(zhì)濃度過(guò)低，固相載體表面沒(méi)有能被此蛋白質(zhì)完全覆蓋，其后加入的血清標(biāo)本和酶結(jié)合物中的蛋白質(zhì)也會(huì)部分地吸附于固相載體表面，最后產(chǎn)生非特異性顯色而導(dǎo)致本底偏高 。 可再用15牛血清白蛋白包被一次，可以消除這種干擾。這一過(guò)程稱為封閉（blocking）。 包被好的ELISA板在低溫(-20)可放置一段時(shí)間而不失去其免疫活性。,（四）酶和底物,最常用的酶： 辣根過(guò)氧化酶

31、（HRP）:在蔬菜作物辣根中含量很高，是一種糖蛋白. 堿性磷酸酶（AP）:從牛腸粘膜或大腸桿菌提取。從大腸桿菌提取的AP作用的最適pH為8.0；用小牛腸粘膜提取的AP最適pH為9.6。一般用對(duì)硝基苯磷酸酯（p-nitrophenyl phosphate，p-NPP）作為底物。產(chǎn)物為黃色的對(duì)硝基酚，在405nm有吸收峰。用NaOH終止酶反應(yīng)。AP敏感性高于HRP，空白值也較低。但AP較難得到高純度制劑，穩(wěn)定性較HRP低，價(jià)格較HRP高，國(guó)內(nèi)在ELISA中一般均采用HRP。,HRP催化下列反應(yīng)：,上式中DH2為供氫體，H2O2為受氫體。HRP對(duì)受氫體的專一性很高，除H2O2外，僅作用于小分子醇的過(guò)

32、氧化物和尿素的過(guò)氧化物 . ELISA中常用的供氫體底物為鄰苯二胺 （orthopenylenediamine，OPD）、四甲基聯(lián)苯胺（3，3 ，5，5-tetramethylbenzidine，TMB）和ABTS2，2-azino-bis(3-ethyl-benzthiazolinesulfonate-6)。,底物,OPD為在ELISA中應(yīng)用最多的底物，靈敏度高，比色方便。其缺點(diǎn)是配成應(yīng)用液后穩(wěn)定性差，而且具有致異變性。 TMB無(wú)此缺點(diǎn)。TMB經(jīng)酶作用后由無(wú)色變藍(lán)色，目測(cè)對(duì)比鮮明；加酸停止酶反應(yīng)后變黃色，可在比色計(jì)中定量；因此應(yīng)用日見(jiàn)增多。ABTS，雖然靈敏度不如OPD和TMB，但空白值很低

33、。,HRP催化OPD的反應(yīng)如下：,（五）結(jié)合物,酶標(biāo)記的抗原或抗體稱為酶結(jié)合物（conjugate）。制備酶結(jié)合物的方法通常有： 1戊二醛交聯(lián)法 2過(guò)碘酸鹽氧化法,ELISA測(cè)定的注意事項(xiàng),測(cè)定方法要標(biāo)準(zhǔn)化： 要使ELISA測(cè)定得到準(zhǔn)確的結(jié)果，不論是定性的還是定量的，必須嚴(yán)格按照規(guī)定的方法制備試劑和實(shí)施測(cè)定。 緩沖液可于冰箱中短期保存，使用前應(yīng)觀察是否變質(zhì)。蒸餾水的質(zhì)量在ELISA中也至關(guān)重要，最好使用新鮮重蒸餾的。不合格的蒸餾水可使空白值升高。,（一）加樣,ELISA在定性測(cè)定（臨床標(biāo)本）中有時(shí)不強(qiáng)調(diào)加樣量的準(zhǔn)確性，例如規(guī)定為加樣一滴。此時(shí)應(yīng)該使用相同口徑的滴管，保持準(zhǔn)確的加樣姿勢(shì)，使每滴液

34、體的體積基本相同。 在非臨床標(biāo)本和半定量的測(cè)定中則加樣量應(yīng)力求準(zhǔn)確。標(biāo)本和結(jié)合物的稀釋液應(yīng)按規(guī)定配制。加樣時(shí)應(yīng)將液體加在孔底，避免加在孔壁上部，并注意不可出現(xiàn)氣泡。,（二）保溫,ELISA中一般有二次抗原抗體反應(yīng)（二步法），即加標(biāo)本后和加結(jié)合物后； 反應(yīng)的溫度和時(shí)間嚴(yán)格按規(guī)定的要求； 保溫容器最好是水浴箱，可使溫度迅速平衡。 各ELISA板不應(yīng)疊在一起。為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋。 如用保溫箱，空濕盒應(yīng)預(yù)先放在其中，將板平放在底部墊有濕紗布的濕盒中。濕盒應(yīng)該是金屬的，傳熱容易。 以平衡溫度，這在室溫較低時(shí)更為重要。 加入底物后，反應(yīng)的時(shí)間和溫度通常不做嚴(yán)格要求。如室溫高于20，ELISA板可避光放

35、在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，以便不時(shí)觀察，待對(duì)照管顯色適當(dāng)時(shí)，即可終止酶反應(yīng)。(實(shí)驗(yàn)室應(yīng)裝空調(diào)),（三）洗滌,洗滌在ELISA過(guò)程中不是反應(yīng)，但卻是決定實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。 洗滌的目的洗去反應(yīng)液中沒(méi)有與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)以及在反應(yīng)過(guò)程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。 聚苯乙烯待塑料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附作用是普遍性的，在洗滌時(shí)應(yīng)把非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來(lái)。,（三）洗滌,在標(biāo)本和結(jié)合物的稀釋液和洗滌液中加入聚山梨酯（吐溫，Tween）類物質(zhì)即可達(dá)到去非特異物的目的。 聚山梨酯是聚氧乙烯去水山梨醇脂肪酸酯，為非離子型的表面張力物質(zhì)，常作為助溶劑。根據(jù)脂肪酸的種類而對(duì)聚山梨酯編號(hào)； 結(jié)合月桂酸的為聚山梨酯20

36、，在ELISA中最為常用。它的洗滌效果好，并具有減少非特異性吸附和增強(qiáng)抗原抗體結(jié)合的作用。,ELISA板的洗滌一般可采用以下方法：,吸干孔內(nèi)反應(yīng)液； 將洗滌液注滿板孔； 放置2min，略作搖動(dòng)； 吸干孔內(nèi)液，也可傾去液體后在吸水紙上拍干。洗滌的次數(shù)一般為34次，有時(shí)甚至需洗56次。,（四）比色,用酶標(biāo)儀測(cè)定結(jié)果，準(zhǔn)確性決定于： ELISA板底的平整度； ELISA板的透明度； 選用的波長(zhǎng)是否正確： OPD490/492，TMB450/620或630； 酶標(biāo)儀的質(zhì)量。,免疫印跡技術(shù),免疫印跡(immunoblotting)又稱蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)，是一種借助特異性抗原（

37、抗體）鑒定抗體（抗原）的有效方法。該法是在凝膠電泳和固相免疫測(cè)定技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種新的免疫生化技術(shù)。 將含有目標(biāo)蛋白(抗原)的樣品首先用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)或非變性電泳(Native-PAGE)等分離后，通過(guò)轉(zhuǎn)移電泳原位轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜或其它膜的表面，然后將膜表面的蛋白質(zhì)再用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行特異性檢測(cè)。,免疫印跡技術(shù),例如，將經(jīng)SDS-PAGE分離的蛋白質(zhì)帶轉(zhuǎn)移到膜上后，膜用封閉液處理，然后與第一抗體(樣品)反應(yīng)，膜經(jīng)漂洗后再與偶有辣根過(guò)氧化物酶(HRP)或堿性磷酸(酯)酶(AP)的第二抗體反應(yīng)，加人生色底物反應(yīng)之后，即可顯示出目標(biāo)蛋白（樣品中的抗體）的位置。

38、 免疫印跡具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫測(cè)定的高特異性和敏感性，其優(yōu)點(diǎn)是方法簡(jiǎn)便、標(biāo)本可長(zhǎng)期保存、結(jié)果便于比較，故廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)等領(lǐng)域，成為免疫學(xué)、微生物學(xué)及其他生命科學(xué)常用的一種研究方法。,熒光免疫技術(shù),熒光免疫技術(shù)是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展最早的一種。很早以來(lái)就有一些學(xué)者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合，利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行組織或細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。Coons等于1941年首次采用熒光素進(jìn)行標(biāo)記而獲得成功。這種以熒光物質(zhì)標(biāo)記抗體而進(jìn)行抗原定位的技術(shù)稱為熒光抗體技術(shù)（fluorescent antibody technique）。,有關(guān)熒光的基本知識(shí),一、熒光現(xiàn)象 （一）熒光的產(chǎn)

39、生 一此化學(xué)物質(zhì)能從外界吸收并儲(chǔ)存能量（如光能、化學(xué)能等）而進(jìn)入激發(fā)態(tài)，當(dāng)其從激發(fā)態(tài)再回復(fù)到基態(tài)時(shí)，過(guò)剩的能量可以電磁輻射的形式放射（即發(fā)光）。 熒光發(fā)射的特點(diǎn)是：可產(chǎn)生熒光的分子或原子在接受能量后即刻引起發(fā)光；而一旦停止供能，發(fā)光（熒光）現(xiàn)象也隨之在瞬間內(nèi)消失。 可以引起發(fā)熒光的能量種類很多，由光激發(fā)所引起的熒光稱為致熒光。由化學(xué)反應(yīng)所引起的稱為化學(xué)熒光，由X線或陰極射線引起的分別稱為X線熒光或陰極射線熒光。熒光免疫技術(shù)一般應(yīng)用致熒光物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記。,（二）熒光效率,熒光分子不會(huì)將全部吸收的光能都轉(zhuǎn)變成熒光，總或多或少地以其他形式釋放。熒光效率是指熒光分子將吸收的光能轉(zhuǎn)變成熒光的百分率，與發(fā)射

40、熒光光量子的數(shù)值成正比。,（三）熒光的猝滅,熒光分子的輻射能力在受到激發(fā)光較長(zhǎng)時(shí)間的照射后會(huì)減弱甚至猝滅，這是由于激發(fā)態(tài)分子的電子不能回復(fù)到基態(tài)，所吸收的能量無(wú)法以熒光的形式發(fā)射。 一些化合物有天然的熒光猝滅作用而被用作猝滅劑，以消除不需用的熒光。因此熒光物質(zhì)的保存應(yīng)注意避免光（特別是紫外光）的直接照射和與其他化合物的接觸。 在熒光抗體技術(shù)中常用一些非熒的色素物質(zhì)如亞甲藍(lán)、堿性復(fù)紅。伊文思藍(lán)或低濃度的過(guò)錳酸鉀、碘溶液等對(duì)標(biāo)本進(jìn)行得當(dāng)復(fù)染，以減弱非特異性熒光本質(zhì)，使特異熒光更突出顯示。,二、熒光物質(zhì),（一）熒光色素 許多物質(zhì)都可產(chǎn)生熒光現(xiàn)象，但并非都可用作熒光色素。只有那些能產(chǎn)生明顯的熒光并能作

41、為染料使用的有機(jī)化合物才能稱為免疫熒光色素或熒光染料。常用的熒光色素有：,1異硫氰酸熒光素,（fluoresceinisothiocyanate，F(xiàn)ITC）為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，易溶于水或酒精等溶劑。分子量為389.4，最大吸收光波長(zhǎng)為490495nm，最大發(fā)射光波長(zhǎng)520530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光，其主要優(yōu)點(diǎn)是：人眼對(duì)黃綠色較為敏感，通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色。,2四乙基羅丹明（rhodamine，RIB200）,為橘紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮。性質(zhì)穩(wěn)定，可長(zhǎng)期保存。 3四甲基異硫氰酸羅丹明（tetramethyl rhodam ineisothio cyanate，

42、TRITC） 最大吸引光波長(zhǎng)為550nm，最大發(fā)射光波長(zhǎng)為620nm，呈橙紅色熒光。與FITC的翠綠色熒光對(duì)比鮮明，可配合用于雙重標(biāo)記或?qū)Ρ热旧?（二）其他熒光物質(zhì),1酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)某些化合物本身無(wú)熒光效應(yīng)，一旦經(jīng)酶作用便形成具有強(qiáng)熒光的物質(zhì)。例如4-甲基傘酮-D半乳糖苷受-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基傘酮，后者可發(fā)出熒光，激發(fā)光波長(zhǎng)為360nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為450nm。 2鑭系螯合物某些3價(jià)稀土鑭系元素如銪（Eu3+）、鋱（Tb3+）、鈰（Ce3+）等的螯合物經(jīng)激發(fā)后也可發(fā)射特征性的熒光，其中以Eu3+應(yīng)用最廣。Eu3+螯合物的激發(fā)光波長(zhǎng)范圍寬，發(fā)射光波長(zhǎng)范圍窄，熒光衰變時(shí)間長(zhǎng)，

43、最適合用于分辨熒光免疫測(cè)定。,熒光抗體技術(shù),一、熒光抗體的制備 （一）抗體的熒光素標(biāo)記 （二）熒光抗體的鑒定,二、免疫熒光顯微技術(shù),免疫熒顯微技術(shù)的基本原理是：使熒光抗體與標(biāo)本切片中組織或細(xì)胞表面的抗原進(jìn)行反應(yīng)，洗滌除去游離的熒光抗體后，于熒光顯微鏡下觀察，在黑暗背景上可見(jiàn)明亮的特異熒光。,（一）標(biāo)本的制作,標(biāo)本切片要求盡量薄些，以利抗原抗體接觸和鏡檢。標(biāo)本中干擾抗原抗體反應(yīng)的物質(zhì)要充分洗去，有傳染性的標(biāo)本要注意安全。 標(biāo)本主要有組織、細(xì)胞和細(xì)菌三大類 ； 組織材料可制備成石蠟切片或冷凍切片； 細(xì)胞或細(xì)菌可制成涂片，涂片應(yīng)薄而均勻 ； 涂片或印片制成后應(yīng)迅速吹干、封裝。置10保存或立即使用 。

44、,（二）熒光抗體染色,于已固定的標(biāo)本上滴加經(jīng)適當(dāng)稀釋的熒光抗體。置濕盒內(nèi)，在一定溫度下溫育一定時(shí)間，一般可用253730min，不耐熱抗原的檢測(cè)則以4過(guò)夜為宜。用PBS充分洗滌，干燥。,（三）熒光顯微鏡檢查,熒光抗體染色的標(biāo)本 ，在染色當(dāng)天即作鏡檢，以防熒光消退，影響結(jié)果。 熒光顯微鏡檢查應(yīng)在通風(fēng)良好的暗室內(nèi)進(jìn)行。 首先要選擇好光源或?yàn)V光片。濾光片的其作用是提供合適的激發(fā)光。,激發(fā)濾光片有兩種：,MG為紫外光濾片，只允許波長(zhǎng)275400nm的紫外光通過(guò)，最大透光度在365nm； BG為藍(lán)紫外光濾片，只允許波長(zhǎng)325500nm的藍(lán)外光通過(guò)，最大透光度為410nm。 靠近目鏡的一組阻擋濾光片（又稱

45、吸收濾光片或抑制濾光片）的作用是濾除激發(fā)光，只允許熒光通過(guò)。透光范圍為410650nm，代號(hào)有OG（橙黃色）和GG（淡綠黃色）兩種。 觀察FITC標(biāo)記物可選用激發(fā)濾光片BG12，配以吸收濾光片OG4或GG9。觀察RB200標(biāo)記物時(shí)，可選用BG12與OG5配合。,（四）實(shí)驗(yàn)的類型,1直接法用特異熒光抗體直接滴加于標(biāo)本上，使之與抗原發(fā)生特異性結(jié)合。（本法操作簡(jiǎn)便，特異性高，非特異熒光染色因素少；缺點(diǎn)是敏感度偏低，每檢查一種抗原需制備相應(yīng)的特異熒光抗體。,直接免疫熒光法原理示意圖,實(shí)驗(yàn)的類型,2間接法：可用于檢測(cè)抗原和抗體。 本法有兩種抗體相繼作用，第一抗體為針對(duì)抗原的特異抗體，第二抗體（熒光抗體）

46、為針對(duì)第一抗體的抗抗體。本法靈敏度高，而且在不同抗原的檢測(cè)中只需應(yīng)用一種熒光抗體。,間接免疫熒光法原理示意圖 3補(bǔ)體結(jié)合法：較少應(yīng)用。 4標(biāo)記法本法用FITC及羅丹明分別標(biāo)記不同的抗體，而對(duì)同一標(biāo)本作熒光染色。在有兩種相應(yīng)抗原存在時(shí)，可同時(shí)見(jiàn)到橙紅和黃綠兩種熒光色澤。,熒光免疫測(cè)定,一、時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定 熒光素作為標(biāo)記物的熒光免疫測(cè)定易受血清成分、試管、儀器組件等的本底熒光及激發(fā)光源的雜射光干擾，使靈敏度受到限制。 時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定（time resolved fluorescence immuno assay，TR-FIA）是針對(duì)這缺點(diǎn)加以改進(jìn)的一種新型檢測(cè)技術(shù)。,TR-FIA的基本

47、原理,是以鑭系元素銪（Eu）螯合物作熒光標(biāo)記物，利用這類熒光物質(zhì)有長(zhǎng)熒光壽命的特點(diǎn)，延長(zhǎng)熒光測(cè)量時(shí)間，待短壽命的自然本底熒光完全衰退后再行測(cè)定，所得信號(hào)完全為長(zhǎng)壽命鑭系螯合物的熒光，從而有效地消除非特異性本底熒光的干擾。 其中增強(qiáng)液的作用是使熒光信號(hào)增強(qiáng)。因?yàn)槊庖叻磻?yīng)完成后，生成的抗原抗體銪標(biāo)記物復(fù)合物在弱堿性溶液中，經(jīng)激發(fā)后所產(chǎn)生的熒光信號(hào)甚弱。在增強(qiáng)液中pH可至23，銪離子很容易解離出來(lái)，并與增強(qiáng)液中的-二酮體生成帶有強(qiáng)烈熒光的新的銪螯合物，大大有利于熒光測(cè)量。 用檢測(cè)儀器為時(shí)間分辨熒光計(jì)，與一般的熒光分光光度計(jì)不同，采用脈沖光源（每秒閃爍1000次的氙燈），照射樣品后即短暫熄滅，以電子設(shè)

48、備控制延緩時(shí)間，待非特異本底熒光衰退后，再測(cè)定樣品發(fā)出的長(zhǎng)鑭系熒光。檢測(cè)靈敏度可達(dá)0.21ng/ml。,TR-FIA測(cè)定原理示意圖,雙抗體夾心法TR-FIA反應(yīng)程序示意圖,熒光偏振免疫測(cè)定,熒光物質(zhì)經(jīng)單一平面的偏振光藍(lán)光（波長(zhǎng)485nm）照射后，可吸收光能躍入激發(fā)態(tài)；在恢復(fù)至基態(tài)時(shí)，釋放能量并發(fā)出單一平面的偏振熒光（波長(zhǎng)525nm）。偏振熒光的強(qiáng)度與熒光物質(zhì)受激發(fā)時(shí)分子轉(zhuǎn)動(dòng)的速度成反比。大分子物質(zhì)旋轉(zhuǎn)慢，發(fā)出的偏振熒光強(qiáng)；小分子物質(zhì)旋轉(zhuǎn)快，其偏振熒光弱。利用這一現(xiàn)象建立了熒光偏振免疫測(cè)定（floutescencepolarizationimmunoassay，F(xiàn)PIA），用于小分子物質(zhì)特別是藥

49、物的測(cè)定。,放射免疫分析,放射免疫分析是由Yalow和Berson于1960年創(chuàng)建的標(biāo)記免疫分析技術(shù)。由于標(biāo)記物放射性核素的檢測(cè)靈敏性，本法的靈敏度高達(dá)ng甚至pg水平。測(cè)定的準(zhǔn)確性良好，ng量的回收率接近100。本法特別適用于微量蛋白質(zhì)、激素和多肽的定量測(cè)定。,一、基本原理,放射免疫分析的基本原理是標(biāo)記抗原（Ag*）和非標(biāo)記抗原（Ag）對(duì)特異性抗體（Ab）的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合反應(yīng)。它的反應(yīng)式為：,在這一反應(yīng)系統(tǒng)中，作為試劑的標(biāo)記抗原和抗體的量是固定的?？贵w的量一般取用能結(jié)合4050的標(biāo)記抗原，而受檢標(biāo)本中的非標(biāo)記抗原是變化的。根據(jù)標(biāo)本中抗原量的不同，得到不同的反應(yīng)結(jié)果。 將抗原抗體復(fù)合物與游離標(biāo)記抗原

50、分開(kāi)，分別測(cè)定其放射性強(qiáng)度，就可算性結(jié)合態(tài)的標(biāo)記抗原（B）與游離態(tài)的標(biāo)記抗原（F）的比值（B/F），或算出其結(jié)合率B/(BF)，這與標(biāo)本中的抗量呈函數(shù)關(guān)系。用一系列不同劑量的標(biāo)準(zhǔn)抗原進(jìn)行反應(yīng)，計(jì)算相應(yīng)的B/F，可以繪制出一條劑量反應(yīng)曲線。受檢標(biāo)本在同樣條件下進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算B/F值，即可在劑量反應(yīng)曲線上查出標(biāo)本中抗原的含量。,放射免疫分析原理示意圖,劑量反應(yīng)曲線,（一）標(biāo)記物,標(biāo)記用的核素有放射射線和射線兩大類。 前者主要為131I、125I、57Cr和60Co； 后者有14C、3H和32P。放射性核素的選擇首先考慮比活性。,（二）標(biāo)記方法 標(biāo)記125I的方法可分兩大類，即直接標(biāo)記法和間接標(biāo)記法

51、。 （三）標(biāo)記物的鑒定 （四）抗血清的檢定,二、測(cè)定方法,（一）抗原抗體反應(yīng) 將抗原（標(biāo)準(zhǔn)品和受檢標(biāo)本）、標(biāo)記抗原和抗血清按順序定量加入小試管中，在一定的溫度下進(jìn)行反應(yīng)一定時(shí)間，使競(jìng)爭(zhēng)抑制反應(yīng)達(dá)到平衡。不同質(zhì)量的抗體和不同含量的抗原對(duì)溫育的溫度和時(shí)間有不同的要求。如受檢標(biāo)本抗原含量較高，抗血清的親和常數(shù)較大，可選擇較高的溫度（1537）進(jìn)行較短時(shí)間的溫育，反之應(yīng)在低溫（4）作較長(zhǎng)時(shí)間的溫育，形成的抗原抗體復(fù)合物較為牢固。,（二）B、F分離技術(shù) 在RIA反應(yīng)中，標(biāo)記抗原和特異性抗體的含量極微，形成的標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物（B）不能自行沉淀，因此需用一種合適的沉淀劑使它徹底沉淀，以完成與游離標(biāo)記抗原（

52、F）的分離。另外對(duì)小分子量的抗原也可采取吸附法使B與F分離。,第一節(jié)有關(guān)發(fā)光的基本知識(shí),發(fā)光免疫技術(shù)是將發(fā)光系統(tǒng)與免疫反應(yīng)相結(jié)合，以檢測(cè)抗原或抗體的方法。其既具有免疫反應(yīng)的特異性，更兼有發(fā)光反應(yīng)的高敏感性，在免疫學(xué)檢驗(yàn)中應(yīng)用日趨廣泛。 1光照發(fā)光（photoluminescence）發(fā)光劑經(jīng)短波長(zhǎng)入射光照射后進(jìn)入激發(fā)態(tài)，當(dāng)回復(fù)至基態(tài)時(shí)發(fā)出較長(zhǎng)波長(zhǎng)的可見(jiàn)光。 2生物發(fā)光（bioluminescence）典型例子為螢火蟲(chóng)發(fā)光。反應(yīng)底物為螢火蟲(chóng)光素（fire fly luciferin），在熒光素酶（luciferase）的催化下利用ATP產(chǎn)能，生成激發(fā)態(tài)的氧化熒光素（oxyluciferin），后

53、者在回復(fù)到基態(tài)時(shí)多余的能量以光子形式放出。,3化學(xué)發(fā)光（chemiluminescence）,在常溫下由化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的光的發(fā)射?；瘜W(xué)發(fā)光是一個(gè)多步驟的過(guò)程，其機(jī)制為某些化合物（發(fā)光劑或發(fā)光底物）可以利用一個(gè)化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的能量使其產(chǎn)物分子或反應(yīng)中間態(tài)分子上升至電子激態(tài)。當(dāng)此產(chǎn)物分子或中間態(tài)分子衰退至基態(tài)時(shí)，以發(fā)射光子的形式釋放能量（即發(fā)光）。,第二節(jié)化學(xué)發(fā)光底物,在化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中參與能量轉(zhuǎn)移并最終以發(fā)射光子的形式釋放能量的化合物稱為化學(xué)發(fā)光劑或發(fā)光底物。 常用的化學(xué)發(fā)光底物有 ： 1氨基苯二酰肼類：主要是魯米諾及異魯米諾衍生物，是最常用的一類化學(xué)發(fā)光劑。魯米諾（luminol，5-氨基-2，3-

54、二氫-1，4-酞嗪二酮）的分子結(jié)構(gòu)及化學(xué)反應(yīng)式如下：,魯米諾在免疫測(cè)定中既可用作標(biāo)記物，也可用作過(guò)氧化物酶的底物。異魯米諾衍生物ASEI和ABMI等也是常用的標(biāo)記物。 2吖啶酯（acridiniumester，AE）類這類發(fā)光劑不需催化劑的存在，在有過(guò)氧化氫的稀堿溶液中即能發(fā)光。反應(yīng)式見(jiàn)電化學(xué)發(fā)光原理圖：,3電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）反應(yīng)在電極表面進(jìn)行。發(fā)光底物為三聯(lián)吡啶釕Ru(bpy)32+，另一反應(yīng)物為三丙胺（TPA）。在陽(yáng)電極表面，以上兩化學(xué)物質(zhì)可同時(shí)失去電子發(fā)生氧化反應(yīng)（圖18-1）。二價(jià)的Ru(bpy)32+被氧化成三價(jià)Ru(bpy)33+

55、，TPA被氧化成陽(yáng)離子自由基TPA+，后者失去一個(gè)質(zhì)子（H+），成為自由基TPA，這是一個(gè)強(qiáng)還原劑，可將一個(gè)電子遞給三價(jià)的Ru(bpy)32+*，而TPA自身被氧化成TPA氧化產(chǎn)物。激發(fā)態(tài)的Ru(bpy)32+*在衰減時(shí)發(fā)射一個(gè)波長(zhǎng)為620nm的光子，重新生成基態(tài)的Ru(bpy)32+。這一過(guò)程在電極表面周而復(fù)始地進(jìn)行，產(chǎn)生許多光子，使信號(hào)得以增強(qiáng)。,電化學(xué)發(fā)光原理 上式反應(yīng)迅速，在15s內(nèi)即可完成；具有背景低、信比高的優(yōu)點(diǎn)，其檢測(cè)極限可達(dá)510-9mol，發(fā)光量與AE濃度呈良好的線性反應(yīng)，是一類的標(biāo)記物。,第三節(jié)化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定,一、化學(xué)發(fā)光酶免疫測(cè)定 從標(biāo)記免疫測(cè)定來(lái)看，化學(xué)發(fā)光酶免疫測(cè)定

56、（chemiluminescentenzymeimmunoasssay，CLEIA）應(yīng)屬酶免疫測(cè)定。 測(cè)定中2次抗原抗體反應(yīng)步驟均與酶免疫測(cè)定相同，僅最后一步酶反應(yīng)所用底物為發(fā)光劑，通過(guò)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)發(fā)出的光在特定的儀器上進(jìn)行測(cè)定。 兩種常用的標(biāo)記酶，辣根過(guò)氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶（AP）均有其發(fā)光底物，,（一）HRP標(biāo)記的CLEIA ：,常用的底物為魯米諾或其衍生物。魯米諾的氧化反應(yīng)在堿性緩沖液中進(jìn)行，通常以0.1mol/L pH8.6 Tris緩沖液作底物液，魯米諾和H2O2在無(wú)HRP催化時(shí)也能緩慢自發(fā)發(fā)光，而在最后光強(qiáng)度測(cè)定中造成空白干擾，因而宜分別配制成2瓶試劑溶液，只在用前即刻混

57、合。 HRP催化魯米諾氧化的反應(yīng)可被某些酚試劑（如鄰碘酚）或螢火蟲(chóng)熒光素酶等加強(qiáng)。加強(qiáng)劑的作用是增強(qiáng)發(fā)光和延長(zhǎng)發(fā)光時(shí)間，由此可提高敏感度。,（二）AP標(biāo)記的CLEIA,在以AP為標(biāo)記酶的CLEIA中，應(yīng)用的底物為adamantyldioxetasephosphate，有不少衍生物的商品試劑如PPD可供應(yīng)用。發(fā)光反應(yīng)的反應(yīng)式如下：,二、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫測(cè)定,化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫測(cè)定亦稱化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定（chemiluminescent immunoassay，CLIA），是用化學(xué)發(fā)光劑直接標(biāo)記抗原或抗體的一類免疫測(cè)定方法。 用作標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光劑應(yīng)符合以下幾個(gè)條件： 能參與化學(xué)發(fā)光反應(yīng)； 與抗原或抗體

58、偶聯(lián)后能形成穩(wěn)定的結(jié)合物試劑； 偶聯(lián)后仍保留高的量子效應(yīng)和反應(yīng)動(dòng)力； 應(yīng)不改變或極少改變被標(biāo)記物的理化特性，特別是免疫活性。魯米諾類和吖啶酯類發(fā)光劑等均是常用的標(biāo)記發(fā)光劑。,魯米諾類的發(fā)光反應(yīng)須有催化劑（例如過(guò)氧化物酶）催化，且與蛋白質(zhì)或肽結(jié)合后其發(fā)光作用減弱，因此魯米諾類在CLEIA中是很好的底物，但已較少用于CLIA的標(biāo)記。 吖啶酯類更為適用，其顯著的優(yōu)點(diǎn)： 氧化反應(yīng)不需催化劑，只要堿性環(huán)境中就可以進(jìn)行。反應(yīng)物在加入H2O2后再加氫化鈉溶液，發(fā)光反應(yīng)迅速，本底低。 在氧化反應(yīng)過(guò)程中，結(jié)合物被分解，因此游離的吖啶酯的發(fā)光不受抑制。試劑穩(wěn)定性好。,三、電化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定,在電化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定（

59、electrochemluminescence immunoassay，ECLI）中應(yīng)用的標(biāo)記物為電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的底物三聯(lián)吡啶釕，其衍生物N-羥基琥珀酰胺（NHS）酯可通過(guò)化學(xué)反應(yīng)與抗體或不同化學(xué)結(jié)構(gòu)的抗原分子結(jié)合，制成標(biāo)記的抗體或抗原。 ECLI的測(cè)定模式與ELISA相似，分二個(gè)步驟進(jìn)行。以雙抗體夾心法測(cè)定抗原為例： 第一步在試管中進(jìn)行，反應(yīng)物為Ru(bpy)32+標(biāo)記的抗體、吸附在磁性微球上的固相抗體以及受檢的標(biāo)本，反應(yīng)式如圖。,ECLI中的抗原抗體反應(yīng) 反應(yīng)后除由標(biāo)記抗體、固相抗體與標(biāo)本中的抗原形成的夾心復(fù)合物外，尚有多余的標(biāo)記抗體和固相抗體。 第二步是將反應(yīng)液輸入特殊的檢測(cè)儀器的反應(yīng)室中，隨即用含三丙胺（TPA）的緩沖液沖洗。反應(yīng)室電極下有磁鐵。含磁性微球的夾心復(fù)合物及游離的固相抗體被吸附在電極表面，游離的標(biāo)記抗體隨沖洗液流出。此時(shí)在反應(yīng)室中即發(fā)生電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。發(fā)出的光由光電倍增管轉(zhuǎn)為信號(hào)，通過(guò)電信號(hào)的測(cè)定反映標(biāo)本中抗原的含量。,ECLI中的ECL反應(yīng),ECLI具有以下優(yōu)點(diǎn)：,標(biāo)記物在再循環(huán)利用，使發(fā)光時(shí)間更長(zhǎng)、強(qiáng)度更高、易于測(cè)定； 敏感度高，可達(dá)pg/ml或pmol水平； 線性范圍寬，104； 反應(yīng)時(shí)間短，20min以內(nèi)可完成測(cè)定； 試劑穩(wěn)定性好，25可保持一年以上。,金免