《我的創(chuàng)作改編》PPT課件.ppt

1、基因工程郭玉柱,1.1基因工程的基本操作工具,1、概念：定向改造生物性狀，解讀2、原理：基因重組3、操作水平：DNA分子水平4、操作工具：（1）限制性核酸內(nèi)切酶-分子手術(shù)刀 1）來源：微生物（原核+真菌） 2）作用特點：識別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷裂。,3）結(jié)果：形成平末端或粘性末端（2）DNA連接酶分子縫合針1）種類：E.coliDNA連接酶和T4DNA 連接酶2）作用特點：使兩個DNA分子片段之間形成磷酸二酯鍵，從而使之連接在一起。 E.coliDNA連接酶只連接粘性末端，T4DNA 連接酶兩種末端都能連，但連接平末端效率

2、低。,比較限制酶、DNA連接酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶的異同點？相同點：都作用于磷酸二酯鍵不同點：1）限制酶切割DNA的磷酸二酯鍵2）DNA連接酶連接雙鏈DNA片段形成磷酸二酯鍵。3）DNA聚合酶使單個脫氧核苷酸之間形成磷酸二酯鍵。4）RNA聚合酶使單個核糖核苷酸之間形成磷酸二酯鍵。,（3）運載體-分子運輸車1）種類：質(zhì)粒、噬菌體衍生物、動植物病毒2）天然質(zhì)粒不能作為運載體，需要加工修飾后才可以。3）質(zhì)粒作為運載體滿足的條件：1、有一個至多個限制酶切位點，便于目的基因插入。2、能在宿主細(xì)胞中自我復(fù)制或整合到染色體DNA上，隨染色體DNA同步復(fù)制。,3、具有標(biāo)記基因（如抗生素抗性基因、熒光標(biāo)

3、記基因），便于將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來。4、大小適宜，對宿主細(xì)胞無傷害。,1.2 基因工程的基本操作程序,基因工程基本操作的四個步驟,1、目的基因的獲取,2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建,3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞,4、目的基因的檢測與鑒定,一、目的基因的獲取,(一)、目的基因主要是_,編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因,請舉出三個以上的例子,（二）、獲取目的基因的常用方法有哪些?,1、從基因文庫中獲取,2、利用PCR技術(shù)擴增,3、人工合成,請閱讀P9第一和二兩段,一、目的基因的獲取,（一）從基因文庫中直接獲取,1.基因文庫,cDNA( 互補DNA)： 是由生物的某一特定器官或特定發(fā)育時期細(xì)胞內(nèi)的mRNA經(jīng)體外反

4、轉(zhuǎn)錄后形成的互補DNA片段，與載體連接后儲存在一個受體菌群中，這個受體菌群就叫做這種生物的cDNA文庫,2)cDNA文庫 (cDNA library),基因重組,反轉(zhuǎn)錄酶,mRNA,cDNA,一、目的基因的獲取,（一）從基因文庫中直接獲取,按照外源DNA片段的來源： 從特定組織提取的染色體基因組DNA -基因組DNA文庫（總） mRNA反轉(zhuǎn)錄成的cDNA拷貝-cDNA文庫（部分）,基因文庫的目的,為了在不知目的基因序列的情況下，便于獲得所需的目的基因。,基因文庫的分類,2.基因文庫的構(gòu)建方法,：直接分離法,供體細(xì)胞中的DNA,許多DNA片段,運載體,限制酶,受體細(xì)胞,產(chǎn)生特定性狀,導(dǎo)入,外源D

5、NA擴增,目的基因,分離,(鳥槍法),一、目的基因的獲取,（一）從基因文庫中直接獲取,多用于原核生物,反轉(zhuǎn)錄法,目的基因的信使RNA,目的基因,化學(xué)合成法,肽鏈氨基酸序列,信使RNA序列,基因的核苷酸序列,目的基因,合成,逆轉(zhuǎn)錄,2.基因文庫的構(gòu)建方法,一、目的基因的獲取,（一）從基因文庫中直接獲取,人工合成法（真核生物）,推測,推測,單鏈DNA,合成,基因組文庫的構(gòu)建,（2）.基因文庫的構(gòu)建方法,通過對受體菌的培養(yǎng)而儲存基因, cDNA文庫的構(gòu)建-反轉(zhuǎn)錄法： 以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成互補的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需的基因。,目的基因的mRNA

6、,單鏈DNA,反轉(zhuǎn)錄酶,DNA聚合酶,雙鏈DNA (目的基因),怎樣從基因文庫中得到我們所需的目的基因呢?,依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息。 如：根據(jù)基因的核苷酸序列 基因的功能 基因在染色體上的位置 基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA 基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性,從基因文庫中得到目的基因的方法,2、利用PCR技術(shù)擴增目的基因, 概念：PCR全稱為_，是一項 在生物_復(fù)制_的核酸合成技術(shù),條件：_、 _、_ 、 _.等,原理：_,方式：以_方式擴增，即_（n為擴增循 環(huán)的次數(shù)）,結(jié)果：,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),體外,特定DNA片段,DNA復(fù)制,四種脫氧核苷酸,一對引物,DNA聚合酶,指數(shù),2n,使目的基因的片段在短時間內(nèi)

7、成百萬倍地擴增,要有一段已知目的基因的核苷酸序列（前提條件）,過程：,a、DNA變性（90-95）：雙鏈DNA模板 在熱作用下，_斷裂，形成_,b、退火（復(fù)性55-65）：系統(tǒng)溫度降低，引 物與DNA模板結(jié)合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下， 合成與模板互補的_。,氫鍵,單鏈DNA,雙鏈,DNA鏈,3、人工合成法：,基因較小，核苷酸序列已知，可以利用DNA合成儀人工合成,1、原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu),非編碼區(qū),非編碼區(qū),編碼區(qū),編碼區(qū)上游,編碼區(qū)下游,與RNA聚合酶結(jié)合位點,啟動子,終止子,啟動子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，有了

8、它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得蛋白質(zhì) 終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄,1、原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu),非編碼區(qū),非編碼區(qū),編碼區(qū),編碼區(qū)上游,編碼區(qū)下游,與RNA聚合酶結(jié)合位點,啟動子,終止子,RNA聚合酶:能夠識別啟動子上結(jié)合位點的一種蛋白質(zhì).,RNA聚合酶能夠識別調(diào)控序列中的結(jié)合位點，并與其結(jié)合。,轉(zhuǎn)錄開始后，RNA聚合酶沿DNA分子移動，并以DNA分子的一條鏈為模板合成RNA。,轉(zhuǎn)錄完畢后，RNA鏈釋放出來，緊接著RNA聚合酶也從DNA模板鏈上脫落下來。,不能轉(zhuǎn)錄為信使RNA，不能 編碼蛋白質(zhì)。,：能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的信使RNA，能 編碼蛋白質(zhì),編碼區(qū),非編碼

9、區(qū),原核細(xì)胞的 基因結(jié)構(gòu),有調(diào)控遺傳信息表達(dá)的核 苷酸序列.包括啟動子和終止子,非編碼區(qū),非編碼區(qū),編碼區(qū),編碼區(qū)上游,編碼區(qū)下游,啟動子,終止子,2、真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu),編碼區(qū),與RNA聚合酶 結(jié)合位點,內(nèi)含子,外顯子,能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做外顯子,不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做內(nèi)含子,啟動子,終止子,編碼區(qū)上游,編碼區(qū)下游,內(nèi)含子：,外顯子：,真核細(xì)胞的 基因結(jié)構(gòu),編碼區(qū),非編碼區(qū),外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列 內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列,：有調(diào)控作用的核苷酸序列， 包括位于編碼區(qū)上游的RNA 聚合酶結(jié)合位點（啟動子）。,非編碼序列：,包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子,3、原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比

10、較,思考,編碼相同數(shù)目氨基酸的蛋白質(zhì)，原核細(xì)胞與真核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)一樣長嗎？,連續(xù),不連續(xù),編碼區(qū),非編碼,二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建 基因工程的核心,1、目的： 所需物質(zhì)：,使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。,它們各自的作用是什么?,2、基因表達(dá)載體的組成：,復(fù)制原點+目的基因+啟動子+終止子+標(biāo)記基因,它們各自的作用是什么?,載體與表達(dá)載體的區(qū)別：二者都有標(biāo)記基因和復(fù)制原點兩部分DNA片段。表達(dá)載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟動子、終止子三部分結(jié)構(gòu) 用到的工具酶：既用到限制酶切割載體，又用到DNA連接酶將目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化學(xué)

11、鍵都是磷酸二酯鍵 啟動子、終止子對于目的基因表達(dá)必不可少 目的基因不能單獨進(jìn)入受體細(xì)胞，必需以表達(dá)載體的方式攜帶進(jìn)去。,注意,三將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞,（一）轉(zhuǎn)化：,（二）方法,將目的基因?qū)?植物細(xì)胞,將目的基因?qū)?動物細(xì)胞,將目的基因?qū)?微生物細(xì)胞,農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法(雙子葉）,基因槍法（單子葉）,花粉管通道法,顯微注射法,Ca2+處理法,目的基因進(jìn)入_內(nèi)，并且在 受體細(xì)胞內(nèi)維持_和_的過程,受體細(xì)胞,穩(wěn)定,表達(dá),1、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法： （1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 農(nóng)桿菌特點：,易感染雙子葉植物和裸子植物，對大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力,原理：Ti質(zhì)粒上的T-DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，并

12、整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上。,過程：,優(yōu)點,（2）基因槍法 （3）花粉管通道法,2、將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞 方法：顯微注射法 程序：,目的基因表達(dá)載體提純 取卵（受精卵） 顯微注射 受精卵（或胚胎干細(xì)胞) 新性狀動物,3、將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞 原核生物特點：繁殖快、單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)少 方法：,用Ca2+處理細(xì)胞 感受態(tài)細(xì)胞 表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合 感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子 CacL2可以改變微生物細(xì)胞壁的通透性,四、目的基因的檢測與鑒定,檢查是否成功,（一）、檢測,1、檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因,.首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA .用含目的基因的DNA片段用放

13、射性同位素等作標(biāo)記,以此做探針 .使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交,若顯示出雜交帶,表明染色體已插入染色體DNA中,（1）方法:,DNA分子雜交,（2）過程:,（二）、鑒定（個體生物學(xué)+分子生物學(xué)水平）,2、檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA,3、檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì),抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等,方法:,分 子 雜 交,方法:,抗原-抗體雜交,過程: 用上述探針和轉(zhuǎn)基因生物的mRNA雜交,若出現(xiàn)雜交帶,表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了mRNA,歸納: 基因工程的基本操作程序,獲取目的基因 從基因文庫 利用PCR 化學(xué)方法人工合成 構(gòu)建基因表達(dá)載體 目的基因、啟動子、終止子、標(biāo)記基因 將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、顯微注射法等 目的基