PCR(聚合酶鏈式反應)原理

1、PCR(聚合酶鏈式反應)原理 PCR 是體外酶促合成特異DNA片段的方法，主要由高溫變性、低溫退火和適溫延伸三個步驟反復的熱循環(huán)構(gòu)成： 即在高溫（95）下，待擴增的靶DNA雙鏈受熱變性成為兩條單鏈DNA模板；而后在低溫（3755）情況下，兩條人工合成的寡核苷酸引物與互補的單鏈DNA模板結(jié)合，形成部分雙鏈；在Taq酶的最適溫度（72）下，以引物3端為合成的起點，以單核苷酸為原料，沿模板以53方向延伸，合成DNA新鏈。這樣，每一雙鏈的DNA模板，經(jīng)過一次解鏈、退火、延伸三個步驟的熱循環(huán)后就成了兩條雙鏈DNA分子。如此反復進行，每一次循環(huán)所產(chǎn)生的DNA均能成為下一次循環(huán)的模板，每一次循環(huán)都使兩條人工

2、合成的引物間的DNA特異區(qū)拷貝數(shù)擴增一倍，PCR產(chǎn)物得以2n的批數(shù)形式迅速擴增，經(jīng)過2530個循環(huán)后，理論上可使基因擴增109倍以上，實際上一般可達106107倍。1971年Kleppe等人在Journal of molecular biology上發(fā)表文章首次準確、精煉、客觀的闡述了PCR方法，1976年一種從嗜熱水生菌(Thermus aquaticus)分離得到的熱穩(wěn)定的DNA依賴的DNA聚合酶的應用大大增加了PCR的效率。而現(xiàn)今所發(fā)展出來的PCR則是源于由Saiki和Mullis等人于1988年發(fā)表在Science上的一篇論文，Mullis當時服務于Perkin Elmer（PE）公司

3、，因此PE公司在PCR界有著特殊的地位。后來PE被Applied Biosystems Inc.（ABI）公司收購、分拆、再轉(zhuǎn)賣，而PCR的專利和倍受信賴的PCR儀器生產(chǎn)和銷售就留在ABI名下。到如今，PCR方法愈發(fā)趨向自動化，并從中衍生出更多的新技術(shù)方法，可以說，PCR技術(shù)是支撐現(xiàn)代分子生物學發(fā)展的一塊重要基石。這種技術(shù)的廣泛應用催生了一個龐大的市場，多個公司均有各種類型的商品化PCR儀出售。PCR的專利目前依然掌握在ABI和Roche（羅氏）兩大公司手中，去年業(yè)界頗為引人矚目ABI訴MJ公司侵犯侵犯PCR儀知識產(chǎn)權(quán)案最終以MJ敗訴并宣布破產(chǎn)、最終被Bio-rad收購暫告一段落。其后還會不會

4、有后繼的故事還需拭目以待。 PCR原理DNA的半保留復制是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶的作用下，以單鏈為模版，根據(jù)堿基互補配對原則復制成新的單鏈，與模版配對成為雙鏈分子挎貝。在體外實驗中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時也可以發(fā)生變性解鏈，當溫度降低后又可以復性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復性，并設計與模板DNA的5端結(jié)合的兩條引物，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復制，多次重復“變性解鏈退火合成延伸”的循環(huán)就可以以幾何級數(shù)大量擴增特定的基因。發(fā)現(xiàn)耐熱DNA聚合酶對于PCR的應用有里程碑的意義，該類酶可以耐受90以

5、上的高溫而不失活，不需要每個循環(huán)加酶，使PCR技術(shù)變得非常簡捷、同時也大大降低了成本，PCR技術(shù)得以大量應用，并逐步應用于臨床。從PCR原理可以看出，PCR儀的關(guān)鍵是升降溫的步驟?，F(xiàn)在偶爾還能聽到一些前輩們笑談早年的PCR實驗如何在3個水浴鍋中完成的趣聞。經(jīng)過不斷改進，今天的PCR已經(jīng)越來越完善和智能化。出于市場推廣的戰(zhàn)略需要，各廠家的PCR儀型號不同，著力宣傳的技術(shù)指標和參數(shù)也不盡統(tǒng)一，編者在這里簡單列出選購時我們認為應該考慮的常用指標，希望有助于大家選購PCR儀的選購技巧。PCR儀介紹及其選購PCR儀的種類總體來說可以分為兩大類：PCR擴增儀和實時熒光定量PCR儀，普通的PCR擴增儀又衍生

6、出帶梯度PCR功能的梯度PCR儀、和帶原位擴增功能的原位PCR儀等等。1996年由ABI公司首先推出將擴增和檢測融為一體的實時熒光定量PCR儀，此后很多公司如Eppendorf、ROCHE、Corbett、MJ等等都先后推出不同款式的定量PCR儀。一、溫度控制對普通PCR儀來說，溫度控制指標主要是指溫度的準確性、均勻性、以及升降溫速度，對梯度PCR儀來說，除了溫度的準確性和均勻性、升降溫速度以外，還必須考慮儀器在梯度模式和標準模式下是否具有同樣的溫度特性。 溫度的準確性是指樣品孔溫度與設定溫度的一致性，它直接關(guān)系到實驗的成敗。如果排除樣品加入過程中的問題，對于PCR反應而言最重要的莫過于溫度控

7、制的準確性，由于PCR是一個幾何級數(shù)擴增的過程，擴增過程中退火溫度的細微變化會被放大而直接影響結(jié)果，不論是變性、退火還是延伸都需要準確控制溫度，對退火溫度而言溫控顯的尤為重要，有時1度甚至0.5度的差異也能決定實驗的成功與失敗，所謂差之毫厘，謬之千里。因而對PCR擴增儀而言溫度控制就意味著質(zhì)量。溫度的均勻性是指樣品孔間的溫度差異，它關(guān)系到在不同樣品孔進行反應結(jié)果的一致性。我們在實驗中發(fā)現(xiàn)有時用同樣的樣品，同樣的PCR反應程序，最后的結(jié)果竟然差異非常明顯，或許就是因為不同位置的溫度不均一性所致。一些使用過早期PCR儀的腦子格外靈光的研究人員偏愛使用PCR儀中間某幾個固定的孔，就是因為過往反復的教

8、訓和認真的思索得出了這樣的結(jié)論，PCR儀的溫度均勻性不好，特別是最外周的樣品孔情況更差，很有可能影響實驗結(jié)果即“位置的邊緣效應”會影響結(jié)果的可重復性。正是這種位置效應對定量PCR的結(jié)果的影響更為明顯，所以后來才有Roche和Cobbett的離心式定量PCR的重大創(chuàng)新。 溫度控制除了精確度，還有一個廠家喜歡大力宣傳的指標升降溫的速度。更快的升降溫速度，可以縮短反應進行的時間，而且縮短了可能的非特異性結(jié)合、反應的時間，能提高PCR反應煌特異性。因此從本質(zhì)而言溫控方式就從以前相對穩(wěn)定耐用的機械式轉(zhuǎn)向了升降溫更快速的半導體。除了機械本身的原因，影響升降溫速度的還有制作承托樣品管的基座模塊的材料的導熱性

9、。例如ABI早就有升降溫速度高達5C的黃金基座(不要誤會，是銀質(zhì)鍍金而已，要是足金在哪兒可都長久不了)，最近eppendorf也推出了升降溫速度可達到6/秒和4.5/秒的銀質(zhì)模塊,是目前同類產(chǎn)品中升降溫速度最快的，據(jù)廠家資料，一個在其他儀器上原本需要需要4060分鐘的PCR反應，eppendorf Mastercycler ep(銀質(zhì)模塊)只需運行28分鐘別小看這節(jié)約下來的幾十分鐘，一天下來就可以多運行好幾輪了。而真正常用而經(jīng)濟的材料是鋁合金。作為用戶來說，當然更愿意選擇升降溫速度快的，這就像汽車上好看的表面配置一樣容易看到，而內(nèi)在的穩(wěn)定性和耐用性往往是看不到的而容易被忽略。必須注意到，儀器的

10、升降溫速度和樣品管中的樣品的升降溫速度并非同一回事，因為樣品管與基座接觸的緊密性、導熱性、鄰近樣品管的相互影響都會影響樣品的實際升降溫速度。現(xiàn)在的PCR儀如ABI,Eppendorf的一般具有兩種溫控模式，即模塊溫控模式（Block-control）和反應管溫控模式）（tube-control）。在模塊溫控模式下，機器根據(jù)探測器直接探測的溫控模塊（即承載樣品的金屬臺）的溫度進行控制，這種模式適用于長時間的靜態(tài)孵育（如連接、酶切、去磷酸化等）。反應管溫控模式實際上是一種模擬試管/PCR板的溫控模式，根據(jù)探測器所探測到的溫控模塊的溫度由計算機計算出管內(nèi)/PCR板孔內(nèi)樣品液的溫度來進行控制。一般說來

11、，試管溫控更為準確，因為管內(nèi)樣品的溫度無法與溫控模塊同時達到預設溫度。特別是PCR反應中的孵育過程一般都很短暫（30秒或更短），如果采用只有模塊溫控模式的話，反應混合物孵育的時間與程序設定的時間會有相當大的差距。而反應管控制精確的算法能自動補償時間，而且適合各種類型的反應管，確保反應混俁物按照程序設定的時間維持預設溫度。這里要表揚的是ABI因為他們的宣傳資料很老實的指出，模塊升降溫速度高達3.5，樣品的實際平均升降溫度是1左右，而且ABI的PCR儀中顯示的溫度也是計算出來的樣品溫度而非溫控模塊的溫度。我們看到過有的品牌代理做的宣傳資料中故意引用ABI的“樣品實際平均升降溫速度”去和自己的模塊升

12、溫速度比較，未免有失公允。有的PCR儀廠家推出了另一種溫控方式；熱敏電極溫控模式。該方法將一個熱敏電極插入一個專門的測量管中（管中裝有礦物油），反應進行時，將該測量管插入溫控模塊的樣品進行檢測。他們認為通過此途徑可以監(jiān)測反應管內(nèi)樣品的實際溫度，但這種方法未免有些華而不實；（1）測量管中礦物油的溫度變化與實際反應樣品的溫度變化未必一致；（2）因為測量管必須占用一個樣品孔，所以使用該溫控方式時就無法使用96孔PCR板作實驗。梯度PCR 對于一個PCR反應，雖然有各種各樣的PCR引物設計軟件或者經(jīng)驗公式計算最適的退火溫度，可是由于模版中堿基的組合千變?nèi)f化，對于特殊片斷，經(jīng)驗公式得到的數(shù)據(jù)不一定能P出

13、來結(jié)果，細微的變化對結(jié)果都可能產(chǎn)生決定性的影響，因而“摸條件”一度是讓人很頭疼的問題。梯度PCR的出現(xiàn)部分解決了一些問題在反應過程中每個孔的溫度控制條件可以在指定范圍內(nèi)按照梯度變化，根據(jù)結(jié)果，一步就可以摸索出最適合的反應條件。不單退火溫度，連變性溫度和延伸溫度都可以優(yōu)化對于多種聚合酶混合酶擴增如Invitrogen、Clontech、Promega的多數(shù)高保真Taq酶來說這個非常重要，因為Taq和校正酶的最佳反應溫度可能有顯著差異，優(yōu)化延伸溫度就顯得很重要。多次實驗可在一臺儀器上完成，既節(jié)省實驗時間提高效率，又節(jié)省實驗成本。對于帶梯度功能的PCR儀，需要考慮梯度模式下不同梯度管排間的溫度均勻性

14、和準確性，還必須考慮儀器在梯度模式和標準模式下是否具有同樣的溫度特性。這種差異可能導致在梯度模式下得出的最佳條件與標準模式下單獨做的結(jié)果出現(xiàn)差異。SteadySlope技術(shù)是eppendorf擁有的梯度PCR技術(shù)專利，可以同樣的溫度變化速率到達所有設定的梯度溫度，所以在梯度模式下具有恒定的溫度性。這一技術(shù)保證了在梯度模式和普通模式之間可以進行可靠的信息傳遞，不會因為溫度特性不同而導致產(chǎn)量和特異性的變化。MJ公司沒有付專利費而選擇在梯度模式下采用不同的降溫速率，每個梯度溫度之間的溫度曲線不同，從梯度模式向普通模式進行轉(zhuǎn)換的可能會出現(xiàn)問題。此外采用TCT（三組回路）技術(shù)的梯度PCR儀由于在梯度PC

15、R模式下增加了一個加熱和冷卻的控制區(qū)域，保證了梯度溫度控制的精確性并使不同梯度管排間的溫度均勻性更好。在PCR儀上增加原位PCR模塊就可以在玻片上進行原位PCR擴增，MJ和eppendorf的PCR儀都有提供原位適配器以滿足不同需要。購買配有支持原位PCR模塊的PCR儀對從事醫(yī)學研究的工作者是很值得的，一機兩用。此外，隨著基因組高通量研究的需求的提高，各品牌都推出了多槽式高通量PCR儀，各有特長：MJ有一種一拖四，就是1個主機帶4個擴增槽，每個槽可以獨立控溫，一次可以作96x4個樣品的PCR，不過一旦出現(xiàn)問題4個都不能用了。ABI則在原來的9700的基礎上推出了雙384孔的基座，一次完成384

16、x2個樣品，使得9700的功能又擴展到高通量領域而無需購買新的機器，可惜兩個384槽不能獨立控溫。eppendorf則有一個控制面板，可以控制5個獨立的PCR儀，每臺機器可以聯(lián)合，而且互不影響，但是比較浪費空間。二、儀器的功能性和人性化設計當然是越簡單方便的設計最符合用戶的要求。 熱蓋現(xiàn)在的PCR儀一般均配備熱蓋，熱蓋溫度設為105，使樣品管頂部的溫度達到105左右，蒸發(fā)的反應液就不會產(chǎn)生凝集在管蓋上而改變反應體積，這樣用戶就無需再向反應管內(nèi)加石蠟油，直接減少后繼反應的麻煩。如果是旋轉(zhuǎn)加壓的熱蓋就要特別小心，因為壓力到達時沒有明顯的提示，用戶需要根據(jù)經(jīng)驗將熱蓋旋到合適位置，不太容易掌握。如果過

17、松，熱蓋沒有充分接觸反應管而影響結(jié)果；如果過緊，則會導致反應管變形，甚至可能造成熱蓋的機械故障。最新的ESP技術(shù)是指熱蓋加熱時不接觸樣品管，避免加熱樣品管導致非特異產(chǎn)物，等加熱到設定溫度后熱蓋下降，將樣品管壓入加熱模塊，下降時間和壓力都由電子控制。樣品基座PCR反應多在0.2或者0.5的管子中進行，多數(shù)PCR儀也配備了不同的可更換樣品槽適配不同的樣品管。eppendorf有一個有趣的設計，一個槽內(nèi)帶有0.2和0.5兩種不同樣品孔，不需更換基座就可以分別使用兩種不同的反應管，或者96孔板，加原位適配器就可以變成原位PCR了。避免了換基座的麻煩。當然不同的反應管不可以同時使用的，因為高度不同，熱蓋不能作用。ABI的9700就可以更換不同的樣品槽，樣品槽系列擴增到從0.5到標準96孔，到雙384孔板，分別適合不同的需要，相當靈活。軟件新的PCR儀都比較注重程序編寫的簡易性。大屏幕，顯示實時信息，倒計時，記憶存儲多個程序、自動斷電保護等都有助于實驗室中的復雜環(huán)境使用。程序儲存方面，有人覺得儲存程序的多少似乎意義不太