乙肝疫苗制備.ppt

1、乙肝疫苗的制備，乙肝疫苗的概念，乙肝疫苗是一種用于預(yù)防乙肝的特殊藥物。接種后，它能刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生保護(hù)性抗體，這種抗體存在于人體體液中。一旦乙肝病毒出現(xiàn)，抗體會立即作用，將其清除，防止感染，并且不會對肝臟造成傷害，從而使人體對乙肝產(chǎn)生免疫力，從而達(dá)到預(yù)防乙肝感染的目的。接種乙肝疫苗是預(yù)防乙肝病毒感染最有效的方法。乙肝疫苗的發(fā)展歷史形成于1986年。為了得到乙肝疫苗，研究人員研究了第二輪病毒、酵母和純化蛋白序列。經(jīng)過大量誘導(dǎo)免疫反應(yīng)后。1991年，疫苗被用于高危人群。主要是一些兒童，因為兒童的感染率極高。2005年，美國引入了常規(guī)疫苗接種。給予所有未接種乙肝疫苗的兒童。治療性疫苗是指通過基因重組

2、技術(shù)產(chǎn)生的天然、合成或表達(dá)產(chǎn)物，通過在感染病原微生物或患有某些疾病的機(jī)體中誘導(dǎo)特異性免疫反應(yīng)，從而治療或預(yù)防疾病惡化。目前使用的乙肝疫苗是基因工程疫苗重組酵母乙肝疫苗和重組CHO乙肝疫苗，其主要成分是乙肝病毒的表面抗原，即乙肝病毒的外殼蛋白，它不是一種完整的病毒。這種表面抗原不含病毒遺傳物質(zhì)，沒有傳染性和致病性，但保留免疫原性，即刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體的能力。乙型肝炎表面抗原曾經(jīng)是從乙型肝炎病毒攜帶的血液中經(jīng)過純化和滅活等嚴(yán)格程序制備而成的，稱為血源性疫苗。由于安全性、來源和成本，這種疫苗已經(jīng)被淘汰(例如，它被懷疑會引起血源性疾病和浪費大量血液。基因工程乙肝疫苗是通過基因工程技術(shù)生產(chǎn)的，即構(gòu)建

3、含有乙肝表面抗原基因的重組質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)染到相應(yīng)的宿主細(xì)胞如酵母和CHO細(xì)胞中，生產(chǎn)乙肝表面抗原蛋白。重組酵母乙肝疫苗由重組酵母生產(chǎn)，重組CHO乙肝疫苗由CHO細(xì)胞生產(chǎn)，每種疫苗的劑量為5微克。它們可用于預(yù)防所有已知的乙型肝炎病毒亞型，并且可以放心選擇?；蚬こ桃腋我呙缡且环N乙肝表面抗原亞單位疫苗，采用現(xiàn)代生物技術(shù)構(gòu)建乙肝病毒表達(dá)表面抗原基因的質(zhì)粒，將其克隆到釀酒酵母或中國倉鼠卵巢細(xì)胞中，通過培養(yǎng)該重組酵母或CHO細(xì)胞表達(dá)乙肝表面抗原亞單位。發(fā)酵后，通過細(xì)胞破碎、一系列微濾、超濾、硅膠吸附洗脫和疏水層析，抗原蛋白純度可達(dá)99%以上。乙肝疫苗制造技術(shù)，1。目標(biāo)基因的獲得。工程菌的構(gòu)建。目標(biāo)基因的表

4、達(dá)，4。蛋白質(zhì)的分離純化、目的基因的獲得和乙型肝炎表面抗原編碼基因的獲得。獲取目的基因的一般方法包括： cDNA文庫法、化學(xué)合成法、反轉(zhuǎn)錄法和工程菌篩選法。CHO細(xì)胞具有精確的轉(zhuǎn)錄后修飾功能。表達(dá)的糖基化藥物蛋白在分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和生物學(xué)功能上最接近天然蛋白分子，具有產(chǎn)物胞外分泌的功能，便于下游產(chǎn)物的分離純化；具有高效擴(kuò)增和表達(dá)重組基因的能力；它具有貼壁生長、抗剪切力和滲透壓高的特點，可在高表達(dá)水平的懸浮液中培養(yǎng)；CHO細(xì)胞是纖維b 2細(xì)胞，很少分泌自己的內(nèi)源蛋白，這有利于外源蛋白的后分離。主要試劑：限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、質(zhì)粒DNA提取及柱凝膠回收試劑盒、乙型肝炎表面抗原檢測試劑

5、盒DMEM、透析胎牛血清胰蛋白酶、甲氨蝶呤(MTX)和脂質(zhì)體Liopofectamine TM HBsAg血凝檢測試劑盒、主要試劑：限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、質(zhì)粒DNA提取及柱凝膠回收試劑盒、乙型肝炎表面抗原檢測試劑盒DMEM、透析胎牛血清胰蛋白酶、甲氨蝶呤(MTX)和脂質(zhì)體Liopofectamine TM HBsAg血凝檢測試劑盒、編碼乙型肝炎表面抗原的基因、 聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增，提取質(zhì)粒與表達(dá)載體連接，目的基因與克隆載體連接，轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)入CHO細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，蛋白分離純化，固液分離，離心沉淀膜過濾，雙水相萃取濃縮和初步純化，離子交換層析，疏水層析，親和層析，高純度DNA，除熱原和病毒，

6、分離純化的基本要求溫和。 保持其良好的生物活性和選擇性，達(dá)到有效分離純化的目的，該技術(shù)可直接連接，節(jié)省工藝步驟，產(chǎn)率高，工藝快速。根據(jù)產(chǎn)品的表現(xiàn)形式選擇分離純化的依據(jù)方法，根據(jù)分離純化工藝的要求選擇分離純化工藝，疏水柱層析陰離子交換層析凝膠過濾層析，1。發(fā)酵液預(yù)處理，連續(xù)高速離心，去除細(xì)胞碎片，超濾濃縮。2.疏水柱層析介質(zhì)：丁基瓊脂糖ff，加入適量硫酸銨，調(diào)節(jié)電導(dǎo)率至柱層析平衡液的電導(dǎo)率，按照平衡柱床、樣品吸附、平衡液洗滌、硫酸銨濃度降低分析、柱清洗和再生程序進(jìn)行層析。3.陰離子交換柱層析介質(zhì)：DEAE Sepharose FF HBsAg活性蛋白經(jīng)Sephadex G-25柱脫鹽和改變，使緩沖鹽體系的ph值和離子強度