第四講 微生物與生物轉化.ppt

1、4. 微生物與生物轉化,概述,生物催化劑：微生物（細胞直接進行催化） 酶的來源，催化非天然有機物發(fā)生轉 化反應 優(yōu)點：1、同時參與反應的酶的種類多底物范圍廣 2、不需要進行酶的分離純化方便，廉價，高效 3、解決輔酶再生問題 缺點：1、副產(chǎn)物多得率低 2、產(chǎn)物分離純化困難 用途：有機酸、氨基酸、核苷酸、抗生素、維生素、甾體 激素等手性化合物的工業(yè)化生產(chǎn),4.1 微生物學基礎,微生物的特點 微生物（microorganism）： 所有形態(tài)微小，單細胞的或個體結構較為簡單的多細胞 的、甚或沒有細胞結構的低等生物的通稱。 微生物類群十分龐雜，包括： 病毒(不具細胞結構)、立克次氏體、細菌、放線菌(單細

2、胞) 酵母、霉菌、單細胞藻類、原生動物等,原核生物：不具核膜，核物質裸露，沒有有絲分裂過程 真核生物：細胞核有核膜，進行有絲分裂 特點 1、體積小，面積大比表面積大，代謝強度大 2、種類多10萬種以上，各具特性(三廢處理、合成產(chǎn)品) 3、分布廣營養(yǎng)要求不高，生長繁殖速度快，土壤 4、繁殖快，轉化能力強 5、適應性強，容易培養(yǎng)誘導酶、抗逆性強、極端微生物 溫度、壓力、高鹽濃度、酸堿、干燥、輻射、毒物等,和化學合成法相比：常溫常壓、原料廉價、來源廣、 不需其他特殊催化劑、環(huán)境友好 6、易變異：本質是基因突變，優(yōu)點，也是缺點可調 常用微生物： 細菌、放線菌、霉菌和酵母菌 1、細菌：球狀、桿狀、螺旋狀

3、，分裂生殖，體積很小 球菌：球形或橢圓形。分裂后產(chǎn)生的新細胞常保持一定 的空間排列方式。（單球菌、葡萄球菌等） 桿菌：桿狀或圓柱形。發(fā)酵工業(yè)中最常用。 螺旋菌：細胞呈彎曲桿狀。（弧菌、螺旋菌） 醋桿菌屬、乳桿菌屬、芽孢桿菌屬、梭狀芽孢桿菌屬、 大腸桿菌、短桿菌屬,2、放線菌 菌落呈放線狀而得名（Actinomyces） 厭氣菌放線菌屬 好氣菌鏈霉菌屬，也是放線菌 放線菌多為腐生，少數(shù)寄生。 菌落特點：干燥，不透明，表面呈緊密的絲絨 狀，上面有一層色彩鮮艷的干粉；菌落和培養(yǎng)基 連接緊密，那以挑取；菌落正反面顏色常常不一致 最突出的特性： 產(chǎn)生大量的、種類繁多的抗生素,目前已發(fā)現(xiàn)和分離的5500種

4、以上的抗生素，其中 4400多種為放線菌所產(chǎn)生。 實際應用的有100多種，如鏈霉素、井岡霉素等。 此外，還可用于： 生產(chǎn)維生素、嵋制劑； 甾體轉化、石油脫蠟、烴類發(fā)酵、污水處 放線菌的存在范圍： 土壤中最多，河流、湖泊和海洋中較少； 大氣中也有很多菌絲和孢子，食品、動物上,放線菌為單細胞，革蘭氏陽性。 菌絲分為：營養(yǎng)菌絲、氣生菌絲和孢子絲 放線菌孢子較耐干燥，不耐高溫（65度15分鐘） 放線菌的代表屬： 鏈霉菌屬 諾卡氏菌屬：可用于污水處理等 放線菌屬：多為致病菌 小單胞菌屬 鏈孢囊菌屬：可形成孢子囊和孢囊孢子 游動放線菌屬：孢囊孢子可以運動,3、霉菌（mold） 是一類“絲狀真菌”的通稱，不

5、是分類學上的名詞， 在分類學上分別隸屬于藻狀菌、子囊菌和半知菌。 定義：凡在營養(yǎng)基質上生長形成絨毛狀、蜘蛛網(wǎng) 狀或絮狀菌絲體的真菌，通稱為霉菌。 霉菌的菌落特征和放線菌類似，但是菌落較大， 質地一般比放線菌疏松。 用途：釀酒、制醬、發(fā)酵工業(yè)、農(nóng)業(yè)、紡織、 食品、皮革加工 但是也會引起發(fā)霉變質，是人和動植物致病。,全世界由于霉變而不能食（飼）用的谷物約占2。 目前已知的霉菌毒素達100種以上。其中毒性最強的 是由黃曲霉菌產(chǎn)生的黃曲霉毒素致癌 常用霉菌： a.毛酶： 制作腐乳、豆豉等食品，甾體轉化 b.根霉：淀粉酶、糖化酶（米根霉） c.曲霉：制醬、釀酒、制醋、酶制劑、有機酸、糖化 黑曲霉、米曲霉

6、、黃曲霉 d.青霉：產(chǎn)黃青霉、橘青霉、婁地青霉、展青霉 e.紅曲、木霉、地霉、假囊霉、脈孢菌、交鏈孢霉、 赤霉菌、白僵菌（生物農(nóng)藥，昆蟲病害的防治）,4、酵母（Yeast） 大多數(shù)酵母為單細胞。一般呈卵圓形、圓形、圓柱 形或者檸檬形。 常用的為：酵母屬（Saccharomyces）和假絲酵母 （Candida）。主要有釀酒酵母、產(chǎn)阮假絲酵母、 熱帶假絲酵母、畢赤酵母等。,微生物菌種的分離 1、采樣： 地點的確定：篩選目的、微生物分別特征、菌種的特征 一般在土壤中。（有的放矢）取樣范圍要廣 2、增殖培養(yǎng)： 一般需要進行目的菌種的富集 選擇有利于目的菌種生長繁殖而非目的菌種不容易生長繁殖 的培養(yǎng)條

7、件。如特殊底物、溫度、pH、微量元素、金屬離子、 抑制劑等。,4.2 微生物的分離和選育,3、純種分離 增殖培養(yǎng)后各種菌種的混合物 發(fā)酵或者培養(yǎng)要求純種 方法：a. 劃線法 b. 稀釋法 目的：獲得單菌落 過程中也可以加入篩選控制條件，提高篩選效率 4、性能鑒定 兩步法：初篩（快速的培養(yǎng)和測定方法，也可在純種分離時 進行） 復篩（比較復雜，精確，定量，可以確定目的菌種） 重復實驗確認菌種性質，獲得幾株野生型菌株,誘變育種 野生型菌種性能尚達不到工業(yè)生產(chǎn)的要求，因此要進行 “育種：。 方法：基因突變（自然、誘發(fā)） 誘變：誘變劑處理（致死率和突變率，正突變和負突變）、 高效篩選方法：可以借鑒野生型

8、的篩選方法 存在主要問題：工作量大、缺乏人工控制、提高幅度有一定 限度（尤其對于高產(chǎn)突變菌種） 工作程序：a.選擇出發(fā)菌株（連續(xù)誘變） b.菌懸液的制備（單細胞或者孢子進行誘變） c.誘變：化學誘變、物理誘變,物理誘變劑：各種射線，最常用的紫外線，太空育種 對DNA發(fā)生作用 化學誘變劑：作用原理比較復雜，常用的如亞硝基胍和甲基 磺酸乙酯（EMS） d.變異株的分離和篩選 初篩：菌落形態(tài)、色澤的變化（有時會和性質有關聯(lián)） 指示平板：平板培養(yǎng)基中有指示劑 復篩：營養(yǎng)缺陷型（中間培養(yǎng)淘汰野生型） 缺陷的類型：氨基酸、維生素、嘌呤、嘧啶等 發(fā)酵實驗，檢查其生產(chǎn)性能,重組工程菌的構建 天然微生物中所需要

9、的酶含量少，不能適應生物催化的要求 利用遺傳工程技術可以構建新的工程菌 大量表達生物催化所需要的酶 滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需要 操作步驟： a. 載體 b. 基因的分離 c. DNA分子的切割和連接 d. 引入宿主細胞 e. 重組體的篩選 f. 外源基因的表達 （轉錄、翻譯、修飾） 原生質體技術：多酶體系的重組 包括：原生質體誘變、轉化或轉染、融合等。,克隆天然酶基因,已知序列直接用PCR擴增 未知序列 根據(jù)同類酶保守序列設計引物或探針釣基因 建立genomic DNA或cDNA表達文庫篩選 純化酶，測定部分序列，設計引物或探針釣基因,表達系統(tǒng)的共性,基因克隆至表達載體 轉化至表達宿主細胞 篩選轉化

10、子 生長表達蛋白質,重組酶表達小結,選用強啟動子 若需翻譯后修飾選用酵母系統(tǒng) 蛋白質折疊和降解是高表達方案中的主要問題 融合表達 蛋白酶缺陷菌株 發(fā)酵條件,培養(yǎng)基：微生物的生長、繁殖、產(chǎn)物形成、產(chǎn)品提取分離 工藝的選擇 a. 提供構成細胞物質和代謝產(chǎn)物的有關營養(yǎng)物質 b. 提供能量 c. 加入前體物質用于提高產(chǎn)品的產(chǎn)量 包括：碳源（糖類、有機酸、醇和氨基酸、碳氫化合物、 二氧化碳光合作用，化學能） 氮源：有機氮、無機氮、固氮微生物（空氣中的氮） 無機元素：酶活、生長因子 生長輔助物質：營養(yǎng)缺陷，酵母粉、麥芽汁 水分：占細胞總量的80-90 氣體：氧氣和二氧化碳,4.3 微生物培養(yǎng),培養(yǎng)基優(yōu)化：

11、單因子實驗、正交實驗、代謝途徑 研究內容：種類、濃度、比例、緩沖能力和種類 粘度、雜質影響、誘導物、前體、促進劑 的加入量、加入時間和加入方式， 各種影響因素相互的作用 文獻報道、菌種基本要求、同類微生物的要求 細胞生長和產(chǎn)物形成動力學研究,微生物的營養(yǎng)類型： a. 光能自養(yǎng)微生物：光合作用，光為能源，無機物作為氫的 受體還原二氧化碳合成有機化合物 如：藻類、藍細菌等 b. 光能異養(yǎng)微生物：有機物為氫受體還原二氧化碳合成有機物 c. 化能自養(yǎng)微生物：以無機物氧化所產(chǎn)生的化學能作為能源， 以二氧化碳作為碳源合成有機物 如：硝化細菌、硫細菌等 d. 化能異養(yǎng)微生物：大多數(shù)微生物都屬于這類。 腐生型

12、和寄生型,微生物的培養(yǎng)方法 表面培養(yǎng)：類似自然培養(yǎng) 固體培養(yǎng)：固體培養(yǎng)基，設備簡單，自動化程度低 液體深層培養(yǎng)：可控性好，設備投資大，工業(yè)化生產(chǎn) 菌種的擴大培養(yǎng)新鮮的種子，菌種的分離純化和復壯 一級種子：搖瓶培養(yǎng)，由斜面培養(yǎng)基中接入 二級種子：種子罐，質量檢查，是否染菌 多級種子罐：50立的發(fā)酵罐一般使用三級發(fā)酵 接種菌齡，接種量 發(fā)酵：酶、次級代謝產(chǎn)物，純種培養(yǎng)，產(chǎn)品提取和精制,目的：使菌種的生命得以延續(xù)并保持其生物學特性 菌種保藏方法： 基本原理：根據(jù)微生物的生理、生化特點，人工的創(chuàng)造條件 使微生物處于代謝不活潑、生長繁殖受抑制的休 眠狀態(tài)。低溫、干燥、缺氧 1. 斜面保藏法：4可以保藏3

13、-6個月，到期轉接新鮮斜面 容易發(fā)生變異、染菌，可覆蓋礦物油 2. 穿刺保藏法：用接種針將菌種穿刺接入培養(yǎng)基的1/2處，然 后覆蓋無菌液體石蠟（保持水分、隔絕氧氣） 從中接出來時要進行復壯,4.3 菌種保藏,3. 干燥保藏法：適用于形成芽孢的細菌、形成孢子的絲狀真菌 和放線菌。 原理：將微生物吸附在各種載體上，干燥后保藏。 使用時要進行復壯，常用的為滅菌的沙子和土壤 4. 懸液保藏法：將微生物懸浮于不含養(yǎng)分的溶液中，如蒸餾水 磷酸緩沖液或生理鹽水中，然后密封保藏 5. 冷凍干燥保藏法：保藏期長，變異小，便于大量保藏，適用 范圍廣，是各保藏機構的主要方法 原理：將微生物或者孢子冷凍，然后在減壓情

14、況下利用 升華原理除去水分，使細胞的生命活度處于停止 狀態(tài)，然后進行低溫保藏（一般4）。,常用分散劑：脫脂牛奶和血清 菌種：處于生長后期的微生物，一般細菌培養(yǎng)24小時， 酵母培養(yǎng)72小時，放線菌和絲狀菌種培養(yǎng)7天 加入分散劑并刮下微生物菌體或孢子，制成懸液 30左右冷凍，真空干燥，使水分升華 干燥完畢后，抽真空并熔封。 復壯后使用 6. 液氮保藏法：效果好，方法簡單，保藏對象最為廣泛 濃的懸液加入滅菌后的分散劑中，加入最終濃度10 的甘油或者5的DMSO作為防凍保護劑，立即熔封。 緩慢冷卻到25 左右，保藏在196 的液氮罐中。 使用時取出放入3840 的溫水振蕩融化，然后接種,7. 低溫保藏

15、法 20 的低溫中用15甘油保藏。 菌種保藏中心 ATCC（美國標準菌種收藏中心） ARC（美國農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)研究服務部） NCTC（英國國立標準菌種收藏所） CBS（荷蘭霉菌中心保藏所） IFO（日本大阪發(fā)酵研究所） 中國有7個菌種保藏中心,4.5 微生物生物轉化,定義：利用微生物中特定的酶將人工合成的非天然 化合物進行生物轉化，轉化液經(jīng)分離純化可 得到所需產(chǎn)品的過程。 本質上與直接發(fā)酵法是一樣的，為酶催化反應 不同：發(fā)酵法：多酶低密度轉化 生物轉化：單酶或者多酶的高密度轉化 生物轉化優(yōu)點：工藝簡單、產(chǎn)物濃度高、轉化率及 生產(chǎn)效率高，副產(chǎn)物少,微生物種類多，含酶豐富，可進行多種生物轉化反 應 微

16、生物生物轉化反應具有高度選擇性，尤其是立體 選擇性，可完成一般化學反應難以實現(xiàn)的反應 如甾體、萜類與生物堿等有機化合物中非活潑氫的羥化反應 反應條件溫和，適用于不穩(wěn)定化合物的制備 一般用游離細胞或者固定化細胞培養(yǎng)法,游離細胞轉化法： 1、底物的預處理 考慮底物的各種性質，包括滲透性，溶解度，穩(wěn)定性和毒 性等。 目的：保證底物和催化反應的酶能夠相互接觸 a.酶的位置：胞內，底物首先要和細胞充分接觸 b.底物要透過細胞壁和細胞膜進入胞內 真菌細胞壁透過性較好，因此轉化效率高 細菌細胞壁透過性較差，因此轉化效率低 一般底物在轉化體系中溶解度大，生物轉化率就高,常用底物添加方法： 微生物轉化反應一般在

17、水溶液中進行，因此水溶性 強的底物可以高效進行反應，對于水溶性差的底物 (大多數(shù)生物轉化的底物水溶性都比較差，非天然有機化合物) 可以采用下列方法： a.無毒性的溶劑溶解底物，如乙醇、丙酮等。 b.直接添加固體底物，然后添加無毒性的表面活性 劑如吐溫系列物，劇烈攪拌，形成乳化液，以減少傳 質阻力。,如果底物對微生物有毒，則會干擾微生物的生長， 可以采用下列方法： a. 少量多次添加，控制底物濃度在毒性濃度之下 b. 分步法：首先培養(yǎng)細胞，然后誘導酶的產(chǎn)生，最 后進行生物轉化 c. 酸性或者堿性底物以鹽的形式添加 d. 揮發(fā)性底物在密閉體系中反應 e. 光敏底物在黑暗條件下反應,2、生長細胞培養(yǎng)

18、轉化法 在微生物細胞培養(yǎng)前或者培養(yǎng)一段時間后，將底物 直接加入到培養(yǎng)基中，微生物在生長繁殖的同時對底 物進行生物轉化。 優(yōu)點：容易，效率高 缺點：產(chǎn)品分離純化困難 尤其適用于能以底物作為唯一碳源的微生物,3、靜態(tài)細胞培養(yǎng)轉化法 將微生物細胞發(fā)酵培養(yǎng)一定時間后，離心收集菌 體，然后將菌體懸浮于含有底物的水或緩沖液中進 行生物轉化。(可以有效控制轉化條件) 優(yōu)點：產(chǎn)物后處理簡單，沒有培養(yǎng)基成分的污染 缺點：增加了額外的細胞收集和重懸步驟 廣泛用于有機化合物的轉化，真菌類使用多于細菌 靜態(tài)細胞轉化法所涉及到的酶一般為組成酶，而不 是誘導酶。 轉化可以在新鮮培養(yǎng)基中進行，也可以在緩沖液中 進行（可添加0.2的酵母抽提物）。,固定化細胞轉化法 固定化細胞 細胞的生長和生物催化過程是分離的 優(yōu)點：可以長期保持穩(wěn)定性和催化活性，反覆使用 缺點：生物轉化活性比游離細胞低，傳質阻力 固定化化細胞較容易，真菌一般固定化孢子 常用固定