腸道門診大便三線培養(yǎng)簡述.ppt

1、衛(wèi)生健康體檢腸道致病菌的檢測,*前言*,根據(jù)我國食品衛(wèi)生法第六章第二十六條的規(guī)定，食品生產(chǎn)經(jīng)營人員必須每年進(jìn)行健康檢查，新參加和臨時參加工作的也必須進(jìn)行健康檢查，取得健康證明后方可參加工作。 根據(jù)我國公共場所衛(wèi)生管理條例第二章第七條的規(guī)定，公共場所從業(yè)人員必須進(jìn)行健康檢查，取得健康證明后方可參加工作。 凡患有痢疾、傷寒、病毒性肝炎等消化道傳染?。òú≡瓟y帶者）是不得參加接觸直接入口食品的工作，或者治愈前不得直接從事公共場所的服務(wù)工作。,概念,大便三線培養(yǎng)： 一般來說，廣義的大便三線培養(yǎng)是指在醫(yī)療機(jī)構(gòu)的腸道門診中，日常進(jìn)行的一些腸道致病菌的常規(guī)檢測。主要包括：霍亂弧菌； 沙門菌、志賀菌、（大腸

2、埃希氏菌o157血清型）；副溶血弧菌； 衛(wèi)生健康體檢中大便三線培養(yǎng)： 與上面相比，檢測范圍比較小，屬于預(yù)防性體檢，一般主要針對：霍亂弧菌；沙門菌；志賀菌；大腸埃希氏菌（o157血清型）,*腸桿菌科*,是一大群寄居在人和動物腸道中的生物學(xué)性狀相似的G-無芽胞的短小桿菌，其中4類常引起腹瀉和腸道感染（埃希菌屬、志賀菌屬、沙門菌屬、耶爾森菌屬）；8類常導(dǎo)致院內(nèi)感染的條件致病菌（枸櫞酸桿菌屬、克雷伯菌屬、腸桿菌屬、多源菌屬、沙雷菌屬、變形桿菌屬、普羅威登菌屬、摩根菌屬） 形態(tài)、培養(yǎng)、生化特征： G-桿狀或球桿菌，無芽胞，多有鞭毛，能運動，致病性菌株多數(shù)有菌毛，多數(shù)具有F、R、COL等質(zhì)粒，需氧或兼性厭

3、氧，在普通和MAC培養(yǎng)基上生長良好，在液體培養(yǎng)基內(nèi)均勻混濁生長； 發(fā)酵葡萄糖，產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣，氧化酶陰性，觸酶陽性，硝酸鹽還原試驗陽性；多年來乳糖發(fā)酵試驗是區(qū)分致病性和非致病性腸桿菌科細(xì)菌的重要依據(jù)；,*腸桿菌科*,抗原構(gòu)造： O抗原：是細(xì)胞壁的成分，為脂多糖（LPS），具有屬、種特異性，以核心多糖為分子的中心，內(nèi)側(cè)是類脂A，為內(nèi)毒素的毒性處，外側(cè)是由重復(fù)的低聚糖組成的多糖鏈，決定O抗原的特異性； H抗原：是不耐熱的蛋白質(zhì)抗原，由鞭毛蛋白多肽鏈上的氨基酸序列和空間構(gòu)型決定H抗原的特異性； 表面抗原：是包繞在O抗原外側(cè)的不耐熱的多糖抗原，由黏液或莢膜多糖的結(jié)構(gòu)決定表面抗原的特異性，在不同的菌屬中

4、表面抗原有不同的專有名稱，如大腸埃希菌屬的K抗原、沙門菌屬的Vi抗原、志賀菌屬的B抗原等； 變異性：主要有S-R變異、H-O變異,*沙門菌*,定義：是一群寄居于人類和動物腸道中，生化反應(yīng)與抗原結(jié)構(gòu)相關(guān)的革蘭氏陰性桿菌，多數(shù)對動物致病，僅少數(shù)引起人類疾病，如導(dǎo)致腸熱癥的傷寒、甲副、肖氏、希氏沙門氏菌等。有些動物沙門氏菌也可傳染給人類，引起食物中毒或敗血癥，如鼠傷寒沙門氏菌。 形態(tài)和培養(yǎng)特性： 1、G-細(xì)長桿菌，有鞭毛和菌毛（除雞沙門氏菌和雛沙門氏菌），一般無莢膜，均無芽胞。 2、需氧或兼性厭氧，最適溫度37，PH7.27.4，對營養(yǎng)要求不高，在普通培養(yǎng)基生長良好，37 ，24h，能形成菌落中等大

5、小，直徑23mm，圓形或卵形，表面光滑濕潤，無色半透明，邊緣整齊的菌落。 3、在液體培養(yǎng)基中，呈均勻混濁性生長，無菌膜。,*沙門菌*,生化特征： 1、發(fā)酵GLU，甘露醇，山梨醇產(chǎn)酸產(chǎn)氣（傷寒雞傷寒沙門氏菌少數(shù)不產(chǎn)氣） 2、不發(fā)酵乳糖，蔗糖，側(cè)金黃花醇 3、多數(shù)產(chǎn)生H2S（+），不產(chǎn)靛基質(zhì)（-），不分解尿素（-），不產(chǎn)生乙酰甲基甲醇（VP）（-） 4、能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽（+），動力陽性（+） 5、在KCN培養(yǎng)基中生長（-），苯丙氨酸脫羧酶（-）,*沙門菌*,*沙門菌*,抗原結(jié)構(gòu)（血清型）： 1、O (菌體)抗原 是細(xì)胞壁上的脂多糖（LPS），性質(zhì)穩(wěn)定，耐濕熱100數(shù)小時，不被酒精或0.1%石

6、炭酸破壞，用阿拉伯?dāng)?shù)字1，2，3表示，目前發(fā)現(xiàn)有58種。將相同抗原組分的劃歸一組，稱為群。 沙門氏菌中的主要菌群及其群特異性抗原 A群 O2 C群 O6 C1亞群 O6、 O7 C2亞群 O6、O8 B群 O4 D群 O9 F群 O11 E群 O3 E2亞群 O3、O10族 E3亞群O3、O15 E4亞群 O1、O3、O19,*沙門菌*,2、H（鞭毛）抗原 為蛋白質(zhì)，性質(zhì)不穩(wěn)定，不耐熱，濕熱6015分鐘或酒精處理即破壞?？煞譃橄嗪拖唷Ｆ渲邢嗵禺愋愿?，故又稱特異相，以a、b、c、d表示； 相特意性低,故又稱為非特意相,以1、2、3、4表示。同時有相和相H抗原的稱為雙相菌，僅有一相者為單相菌。 3

7、、Vi(表面)抗原 化學(xué)成分為不耐熱的聚-N-乙酸-D-半乳糖胺糖醛酸，不穩(wěn)定，經(jīng)6030分鐘、石炭酸處理或傳代培養(yǎng)后易消失。它是菌體表面抗原，有抗吞噬、抗補(bǔ)體的作用。 4、菌毛抗原,*沙門菌*,臨床意義： 1、致病物質(zhì)：侵襲力、內(nèi)毒素、腸毒素 2、所致疾病：腸熱癥（傷寒）、胃腸炎（食物中毒）、敗血癥（多見于兒童和免疫力低下的人）、無癥狀帶菌者 3、免疫性：是細(xì)菌胞內(nèi)寄生微生物，人體僅主要靠細(xì)胞免疫 4、抵抗力：對濕熱敏感，65，1520分鐘滅活，水中存活23周，糞便中存活12個月，在冰凍土壤中越冬，5%石炭酸5分鐘可殺死，對某些染料有一定耐受（SS平板）。,*志賀菌*,定義：是腸道中主要的病

8、原菌之一，導(dǎo)致人類細(xì)菌性痢疾的革蘭氏陰性短小桿菌?？煞譃?個群，痢疾志賀氏（A群），福氏志賀氏（B群），鮑氏志賀氏（C群），宋內(nèi)氏志賀氏（D群），我國以B群最多見，占70%以上，其次為D群和A群。 形態(tài)和培養(yǎng)特性： 1、G-短小桿菌，無鞭毛，有菌毛，一般無莢膜，均無芽胞，胞質(zhì)內(nèi)有兩種質(zhì)粒，與侵襲力和耐藥性相關(guān)。 2、需氧或兼性厭氧，最適溫度37，PH7.27.4，對營養(yǎng)要求不高，在普通培養(yǎng)基生長良好，37 ，24h，能形成菌落中等大小，表面光滑濕潤，無色半透明，邊緣整齊的菌落。 3、在液體培養(yǎng)基中，呈均勻混濁性生長，無菌膜。,*志賀菌*,*志賀菌*,生化特征： 1、發(fā)酵GLU，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，分解

9、甘露醇（除A群外） 2、不發(fā)酵乳糖，（宋內(nèi)氏遲緩發(fā)酵，48小時），不發(fā)酵蔗糖 3、不產(chǎn)生H2S（-），不產(chǎn)靛基質(zhì)（-），不分解尿素（-），不產(chǎn)生乙酰甲基甲醇（VP）（-） 4、甲基紅試驗陰性（-） 5、動力陰性（-）,*志賀菌*,根據(jù)生化反應(yīng)和O抗原差異，分成4個血清群和44個血清型 1、A群：痢疾，不分解甘露醇，有10個血清型 2、B群：福氏，有15個血清型，我國以2a、1b、3型居多 3、C群：鮑氏，有18個血清型 4、D群：宋內(nèi)氏，遲緩發(fā)酵乳糖，只有1個血清型，但分為S和R型兩種菌落，其診斷因子血清無交叉凝集現(xiàn)象,*志賀氏菌*,臨床意義： 1、致病物質(zhì)：侵襲力、內(nèi)毒素、外毒素（痢疾志賀氏

10、產(chǎn)生，包括腸毒素、細(xì)胞毒素和神經(jīng)毒素） 2、所致疾?。杭毙跃?、慢性菌痢（治療不徹底造成的反復(fù)發(fā)作）、無癥狀帶菌者 3、免役性：人體主要靠腸道局部免疫 4、抵抗力：對理化因素的抵抗力較弱，對酸敏感，對濕熱敏感，5060，10分鐘滅活，日光照射30分鐘滅活，1%石炭酸1530分鐘可殺死，容易發(fā)生SR和耐藥性變異，耐藥性主要由R質(zhì)粒決定，可在細(xì)菌間傳播。,*檢測和鑒定程序（沙門氏、志賀氏）,采樣（濕潤的10CM棉簽、肛拭） S.F增菌液10ml（37、1824小時） GN增菌液10ml（37、46小時） S.S平板劃線分離培養(yǎng)（37、1824小時） 無可疑菌落報告 觀察、挑選可疑菌落接種KIA或雙

11、糖鐵 （37、1824小時） 初步鑒定，根據(jù)結(jié)果做氧化酶試驗等 全面生化反應(yīng)實驗 血清學(xué)鑒定（多價診斷血清） 報告結(jié)果,*檢測和鑒定程序（沙門氏、志賀氏）,*檢測和鑒定程序（沙門氏、志賀氏）,沙門氏菌在KIA或雙糖鐵上的生長情況： 斜面產(chǎn)堿鮮紅色/底層產(chǎn)酸黃色，有少量產(chǎn)氣或不產(chǎn)氣，H2S陽性有顯黑色（A K + +）,動力陽性（沿穿刺線蔓延生長） 志賀氏菌在KIA或雙糖鐵上的生長情況： 斜面產(chǎn)堿鮮紅色/底層產(chǎn)酸黃色，不產(chǎn)氣， H2S陰性無顯黑色（A K - -） ，動力陰性（只沿穿刺線生長）,*檢測和鑒定程序（沙門氏、志賀氏）,三糖鐵斜面高層培養(yǎng)現(xiàn)象,2志賀氏菌3沙門氏菌4大腸桿菌,*檢測和鑒

12、定程序（沙門氏、志賀氏）,半固體瓊脂培養(yǎng)現(xiàn)象,*檢測和鑒定程序（沙門氏、志賀氏）,沙門氏菌血清學(xué)分型： 1、先A-F多價混合診斷血清進(jìn)行玻片凝集; 2、再單價抗O因子診斷血清進(jìn)行玻片凝集; O4因子血清 B群 O9因子血清 D群 O3因子血清 E群 O11因子血清 F群 O2因子血清 A群 O6因子血清 C群 3、最后H單價抗原血清進(jìn)行玻片凝集;,*檢測和鑒定程序（沙門氏、志賀氏）,志賀氏菌血清學(xué)分型： 1、用4種志賀氏菌多價血清，如果由于表面抗原的存在而不出現(xiàn)凝集，應(yīng)將菌液煮沸后再進(jìn)行玻片凝集試驗; 2、用A1，A2，B群多價，C群多價，D群診斷血清分別試驗; 3、依次選用型因子血清分別進(jìn)行

13、試驗;,有關(guān)配制培養(yǎng)基的補(bǔ)充:,從業(yè)人員體檢大便三線培養(yǎng)基本要求 *相關(guān)物品的準(zhǔn)備* 1、儀器設(shè)備 恒溫培養(yǎng)箱 干燥箱 高壓滅菌器 顯微鏡 接種環(huán) 2、培養(yǎng)基 SS瓊脂 4號瓊脂(必須用9cm玻離平皿) SF和GN增菌液 堿性胨水 KIA或雙糖鐵 3、診斷血清 沙門氏多價 志賀氏多價 霍亂多價,有關(guān)配制培養(yǎng)基的補(bǔ)充:,檢驗要求及報告 1. 檢驗標(biāo)本必須增菌或直接接種平板進(jìn)行，增菌后再次接種平板，堿性胨水增菌液必須保存到陰性報告發(fā)出后。 2. 疑似霍亂菌株必須在18-24h內(nèi)報縣疾控中心。 3. 其他疑似菌株就近送縣級醫(yī)院或縣疾控中心。,有關(guān)配制培養(yǎng)基的補(bǔ)充:,1、配制S.F和GN增菌液時，玻璃

14、試管分裝量一般為10ml支，否則增菌效果不明顯； 2、由于S.F中的主要成分為亞硒酸，遇高溫會還原成硒酸，失去抑制雜菌的作用，故采用先把干凈的玻璃空試管加硅膠塞，高壓滅菌，121，1520分鐘，再把S.F增菌液干粉培養(yǎng)基按比例要求加熱徹底溶解，后采用無菌手法分裝；貼上配制時間的標(biāo)簽，放冰箱冷藏，一般為28 ，可以保質(zhì)1個月左右；但是要隨時觀察，如果發(fā)現(xiàn)試管底部有紅色沉淀，說明增菌液長雜菌變質(zhì)，需重新配制新的增菌液；同時，干粉培養(yǎng)基也應(yīng)放冰箱儲存； 3、最好用直徑9cm的玻璃平皿配制SS平板，厚度為23 mm，估計400ml的培養(yǎng)基傾倒23個平皿，貼上配制時間的標(biāo)簽，放冰箱儲存，一般為28； 4

15、、KIA或雙糖鐵配制時，干粉培養(yǎng)基應(yīng)徹底充分溶解，否則分裝后每支斜面高層內(nèi)含瓊脂量不均勻；由于其中含糖成分，高壓滅菌溫度不能太高， 110，1015分鐘；所制成的高層斜面應(yīng)該規(guī)范，保留1cm的垂直高度；,*大腸埃希菌（O157:H7血清型）*,一般在人體腸道內(nèi)，存在正常的大腸埃希菌，但是也有一些大腸埃希菌具有一定的毒力，感染腸道后即可致病引起腹瀉，稱為致病性大腸埃希菌，包括5種： 腸產(chǎn)毒型（ETEC）：主要在發(fā)展中國家引起兒童腹瀉和旅行者腹瀉，癥狀較輕，可治愈； 腸致病型（EPEC）：主要引起嬰幼兒腸道感染，血清型有O55、O111等，可治愈； 腸侵襲型（EIEC）：引起類似志賀菌屬的菌痢癥狀

16、，可治愈； 腸出血型（EHEC）：它的代表菌為O157:H7血清型，引起的癥狀較嚴(yán)重，由并發(fā)癥所導(dǎo)致的死亡率在3%10%，經(jīng)糞-口傳播，形成爆發(fā)流行，1996年在日本大阪地區(qū)就有上萬人感染，死亡11人，我國有散發(fā)病例的報告，應(yīng)引起重視； 腸凝聚型（EaggEC）:引起慢性腹瀉，可治愈；,*大腸埃希菌（O157:H7血清型）*,生物學(xué)特性和生化特點： G-直短桿菌，無芽胞，多數(shù)有鞭毛，能運動； 營養(yǎng)要求不高，兼性厭氧，普通瓊脂上生長良好；液體培養(yǎng)基中混濁生長；在血平板上產(chǎn)生溶血菌落；在SS平板上由于發(fā)酵乳糖形成粉紅色、光滑、濕潤菌落； 吲哚、甲基紅、V-P、枸櫞酸鹽試驗（IMVC）結(jié)果為+ +

17、- -；KIA斜面高層均產(chǎn)酸產(chǎn)氣、H2S陰性，結(jié)果為A A + -；動力-吲哚-尿酶試驗（MIU）結(jié)果為+ + -；遲緩發(fā)酵山梨醇（ 48小時 ），用SMAC平板純培養(yǎng)； 抗原構(gòu)造： O（菌體）抗原； H（鞭毛）抗原 ； K（表面）抗原；,*大腸埃希菌（O157:H7血清型）*,檢測程序： 糞便、直腸拭子 涂片染色鏡檢 （ 37、1824小時）血液增菌 血平板、SS、MAC、EMB （ 37、1824小時） 可疑菌落（ 37、1824小時） 純培養(yǎng)（SMAC） 生化試驗、血清學(xué)鑒定（O157:H7因子血清）,霍亂弧菌的檢測,*概述與流行病學(xué)*,霍亂弧菌是屬于弧菌科，弧菌屬，是一群革蘭染色陰性，

18、菌體直或微彎曲，具有端極鞭毛，氧化酶試驗陽性，葡萄糖利用試驗為發(fā)酵型的細(xì)菌。 根據(jù)菌體（O）抗原不同，目前將霍亂弧菌分出200個以上的血清型，但是到現(xiàn)在我們僅僅只是發(fā)現(xiàn)O1和O139，這兩個血清型對人類致病的。 目前，從1817年開始至今，全世界共引起發(fā)生了七次霍亂大流行，其中，1992年發(fā)生的大流行的由O139 引起的，其余的由O1群引起的。,*概述與流行病學(xué)*,自古以來，印度恒河三角洲就是霍亂的地方性流行區(qū)，19世紀(jì)初由于在通商、朝圣和戰(zhàn)爭等因素的影響下，霍亂從印度向世界各地傳播。 我國于1820年，霍亂首次傳入，其后世界上的歷次大流行我國都遭受侵襲，除西藏外，其余省份幾乎都波及。特別在19241948年期間，我國每年都發(fā)生，報告的病人數(shù)達(dá)數(shù)萬到10萬，病司死率也高達(dá)30%以上。 解放后，我國的霍亂流行情況有所好轉(zhuǎn)，但是，目前我國仍處于1961年開始的，至今尚未停息的第七次大流行期間，應(yīng)該得到相應(yīng)足夠的重視。,*概述與流行病學(xué)*,傳染源：病人（重型、中型、輕型）； 帶菌者（潛伏期帶菌、病后帶菌、健康帶 菌）； 傳播途徑：經(jīng)口感染的腸道傳染病，常通過水、食物、生活 活接觸、蒼蠅等傳播； 人群易感性：人類不分種族、年齡、性別，對